IL-10、TNF-α及SOCS3在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥母胎界面的變化

曹麗瓊，蔣惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院產(chǎn)科，新疆 烏魯木齊 830000)

IL-10、TNF-α及SOCS3在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥母胎界面的變化

曹麗瓊，蔣惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院產(chǎn)科，新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探討白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子3(SOCS3)在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)母胎界面的變化。方法 選取新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2013年10月至2016年10月ICP孕婦43例作為觀察組，選擇同期產(chǎn)檢的健康孕婦47例作為對(duì)照組。采用Envision免疫組化法測(cè)定兩組孕婦胎盤組織中IL-10、TNF-α的表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和蛋白免疫印跡法(Western-blot)測(cè)定兩組孕婦胎盤組織中SOCS3的表達(dá)水平。結(jié)果 觀察組IL-10的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.578，P<0.05)，TNF-α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.421，P<0.05)；觀察組的孕婦胎盤組織中SOCS3表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.325，P<0.05)；兩組患者SOCS3的OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=565.702，P<0.05)。結(jié)論 ICP患者的母胎界面TNF-α表達(dá)增加，IL-10表達(dá)降低，胎盤組織中SOCS3參與了ICP的發(fā)病。

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；胎盤；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子3；白細(xì)胞介素-10；腫瘤壞死因子-α

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠中晚期特發(fā)疾病，其導(dǎo)致的死胎死產(chǎn)是圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一，而至今其發(fā)病機(jī)制仍未闡明。從生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，Th1/Th2型細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)妊娠免疫耐受中發(fā)揮重要作用[1]。而研究發(fā)現(xiàn)ICP孕婦的Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡發(fā)生變化，Th1的表達(dá)更明顯[2]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)調(diào)控蛋白家族中的成員，這類成員主要負(fù)責(zé)細(xì)胞因子信號(hào)通路，與Th1/Th2細(xì)胞因子失衡、Th2免疫優(yōu)勢(shì)有密切關(guān)系[3]，缺乏SOCS3可引起胎盤功能不全而導(dǎo)致死胎[4]。目前，關(guān)于SOCS3在ICP發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)ICP患者和健康孕婦胎盤組織中SOCS3、白細(xì)胞介素-10(interleukin 10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達(dá)水平，從而了解它們?cè)贗CP母胎界面的表達(dá)，初步探討SOCS3在ICP發(fā)病中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院產(chǎn)科2013年10月至2016年10月經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩的ICP患者43例作為觀察組，所有孕婦均無(wú)肝膽疾病、免疫系統(tǒng)疾病及糖尿病等妊娠合并癥。選擇47例同期產(chǎn)檢的健康孕婦剖宮產(chǎn)分娩者作為對(duì)照組。觀察所用胎盤組織標(biāo)本，經(jīng)過(guò)醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，而且患者知情并同意。

1.2方法

1.2.1試劑

所用試劑包括：兔抗人SOCS3蛋白多克隆抗體(購(gòu)自上海博耀生物科技有限公司)、蛋白質(zhì)印跡法(WB)、二抗試劑盒(上海研生生化試劑有限公司)、β-微管蛋白(β-tubulin)(上海研生生化試劑有限公司)、預(yù)染蛋白Marker(分子量：20～118kD)[愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司]、RIPA裂解液(RIPA lysis buffer)、蛋白上樣緩沖液(上海博耀生物科技有限公司)、免疫組化檢測(cè)試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗人IL-10單克隆抗體和兔抗人TNF-α單克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)、SOCS3 ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物有限公司)。

1.2.2標(biāo)本收集及處理

兩組研究對(duì)象剖宮產(chǎn)術(shù)后，立即在無(wú)菌條件下進(jìn)行胎盤組織的選取，胎盤組織主要位于臍帶附著處旁開(kāi)2～3cm，分離出胎盤組織兩塊，用生理鹽水沖洗3遍，其中一塊放于10%甲醛中進(jìn)行固定，時(shí)間為24～48h，固定后再依次進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋備用；另一塊放入采用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的環(huán)氧樹(shù)脂(EP)管中，-170℃液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.3免疫組化法檢測(cè)胎盤組織中IL-10及TNF-α的表達(dá)

采用多聚體(Envision)免疫組化法測(cè)定IL-10、TNF-α，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。Envision程序：脫蠟、水化組織切片；預(yù)處理組織切片，蒸餾水漂洗，置于三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)中。阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(僅用于Envision TM)；蒸餾水漂洗，置于TBS中10min，一抗孵育10～30min，TBS漂洗10min，Envision TM孵育10～30min，TBS漂洗10min，色源底物溶液孵育10min，蒸餾水漂洗，復(fù)染及封片后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，并在450nm處進(jìn)行光密度(OD)值測(cè)定。

1.2.4蛋白免疫印跡法測(cè)定胎盤組織中SOCS3的表達(dá)水平

按蛋白免疫印跡法(western-blot)標(biāo)準(zhǔn)流程(妊娠組織總蛋白的提取與定量→電泳→電轉(zhuǎn)膜→免疫反應(yīng))進(jìn)行，具體操作按說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行。結(jié)果在450nm處進(jìn)行OD值測(cè)定。

1.2.5 ELISA法測(cè)定胎盤組織中SOCS3的表達(dá)水平

按照SOCS3 ELISA的說(shuō)明書進(jìn)行操作，將標(biāo)準(zhǔn)樣和標(biāo)本樣處理后采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。加入顯色底物(TMB)100微升/孔，于36℃的孵箱進(jìn)行避光孵育15min。加入終止液100微升/孔，混勻后并在450 nm處進(jìn)行OD值測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組一般資料比較

兩組孕婦在年齡、孕周方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

2.2 IL-10及TNF-α在胎盤組織的定位及表達(dá)

IL-10、TNF-α主要在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，見(jiàn)圖1、圖2。IL-10、TNF-α在兩組孕婦胎盤組織中均有表達(dá)，觀察組IL-10的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.578，P<0.01)，而TNF-α的表達(dá)水平則明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.421，P<0.01)，見(jiàn)表2。

分組例數(shù)(n)年齡(歲)孕周(周)觀察組4333.2±6.238.3±5.9對(duì)照組4731.9±5.840.1±3.3t1.0281.806P0.3070.074

2.3 SOCS3在胎盤組織的表達(dá)水平

SOCS3在兩組產(chǎn)婦胎盤組織中均有表達(dá)，如圖3。觀察組的孕婦胎盤組織中的SOCS3表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.325，P<0.05)，見(jiàn)表2。

注：圖1A為滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕褐色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；圖1B為滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有少量表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淡黃色染色顆粒，呈弱陽(yáng)性反應(yīng)SP×400。

圖1 兩組IL-10的表達(dá)

Fig.1 Expression of IL-10 in two groups

注：圖2A為滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有少量表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淡黃色染色顆粒，呈弱陽(yáng)性反應(yīng)；圖2B為滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大量表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕褐色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)SP×400。

圖2 兩組TNF-α的表達(dá)

Fig.2 Expression of TNF-α in two groups

表2 兩組產(chǎn)婦IL-10及TNF-α在胎盤組織的表達(dá)

圖3 兩組SOCS3的表達(dá)

Fig.3 Expression of SOCS3 in two groups

2.4 SOCS3的ELISA結(jié)果

觀察組的OD值為0.698±0.002，對(duì)照組的OD值為0.236±0.005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=565.702，P<0.05)。

3討論

3.1 IL-10及TNF-α在胎盤組織的定位及表達(dá)

ICP是一種多病因疾病，其臨床危害主要在胎兒方面，故母胎界面的異常改變成為研究的著眼點(diǎn)。正常妊娠時(shí)胎盤作為免疫隔離部位，使遺傳父親基因的胎兒不受到排斥，因此可以起到免疫耐受的作用。有研究表明正常妊娠時(shí)孕婦存在Th2免疫優(yōu)勢(shì)，可以避免胎兒的不良結(jié)局[4]。國(guó)內(nèi)有研究表明ICP患者的外周血免疫球蛋白降低，從而導(dǎo)致患者血清CD4/CD8比值不斷增高，而淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率不斷降低[5]，因此Th1型細(xì)胞因子TNF-α、干擾素(IFN)-β升高而Th2型細(xì)胞因子IL-4降低[6]，母胎間免疫平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致該病的發(fā)生，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致母嬰的不良結(jié)局發(fā)生。本研究通過(guò)對(duì)ICP患者和正常妊娠孕婦的TNF-α、IL-10在胎盤組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ICP患者的TNF-α表達(dá)水平要比正常孕婦高，而IL-10表達(dá)要低于正常妊娠孕婦，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明TNF-α、IL-10在ICP患者母胎界面的表達(dá)異常，不利于母嬰的結(jié)局。

3.2 SOCS3在ICP母胎界面的變化

SOCS是連接蛋白-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號(hào)通路中的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，可抑制多種細(xì)胞因子的信號(hào)通路，并參與T細(xì)胞的分化和免疫調(diào)控，其表達(dá)不足或缺陷，會(huì)破壞免疫耐受，導(dǎo)致相應(yīng)疾病[7]。SOCS3在機(jī)體免疫調(diào)控中的作用最突出，研究表明SOCS3促進(jìn)Th1/Th2平衡向Th2偏倚[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ICP時(shí)母胎界面SOCS3的表達(dá)下降，這一結(jié)果與董倩等[9]的研究結(jié)果部分相符。因此，ICP患者的母胎界面SOCS3表達(dá)下降，從而導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層IL-10的表達(dá)不足，使胎盤滋養(yǎng)層受到損害，使母體對(duì)胎兒的免疫排斥不斷增強(qiáng)，從而出現(xiàn)死胎。

本研究ICP患者胎盤組織中的SOCS3表達(dá)降低，從而導(dǎo)致患者的免疫力降低，打破Th1/Th2平衡，從而影響到患者和胎兒的健康，發(fā)生不良結(jié)局的幾率也會(huì)增加。因此分析ICP患者的胎盤組織中的TNF-α、IL-10和SOCS3的表達(dá)，可以分析ICP患者的發(fā)病情況，而且可以通過(guò)相應(yīng)的治療，減少患者及新生兒的不良結(jié)局的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)準(zhǔn)確及詳細(xì)地分析ICP患者提供一定的參考。

綜上所述，ICP患者的母胎界面TNF-α表達(dá)增加，而IL-10表達(dá)降低，胎盤組織中SOCS3參與了ICP的發(fā)病。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Changes of IL-10, TNF-α and SOCS3 at maternal-fetal interface of ICP patients

CAO Li-qiong, JIANG Hui-ling, A Mi-na, YI Jin-ling

(DepartmentofObstetrics,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUrumqi830000,China)

Objective To study the changes of interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) at maternal-fetal interface of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP). Methods From October 2013 to October 2016, 43 pregnant women with ICP in the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected in observation group, and 47 healthy pregnant women taking prenatal examination in the same period were selected in control group. The expressions of IL-10 and TNF-α level in placenta of two groups were determined by Envision immunohistochemical method, and the expression level of SOCS3 was determined by ELISA method and Western blot (Western-blot) method. Results The expression of IL-10 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.578,P<0.05), but the expression of TNF-α was significantly higher (Z=-4.421,P<0.05). The expression of SOCS3 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.325,P<0.05). There was obvious difference in OD value of SOCS3 between two groups (t=565.702,P<0.05). Conclusion The expression of TNF-α increases but IL-10 decreases in maternal-fetal interface of patients with ICP, and SOCS3 in placenta is involved in the pathogenesis of ICP.

intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP); placenta; supressor of cytoking signaling3(SOCS3); interleukin 10 (IL-10); tumor necrosis factor α(TNF-α)

2016-11-16

曹麗瓊(1975-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事為妊娠免疫及妊娠合并癥的診治工作。

易金玲，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.013

R714.2

A

1673-5293(2017)03-0259-03