QuEChERS/HPLC/DAD法同時檢測果蔬中多種植物激素殘留

朱 松，袁曉晴，戴 軍，陳尚衛

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學分析測試中心，江蘇 無錫 214122；2.河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450000)

QuEChERS/HPLC/DAD法同時檢測果蔬中多種植物激素殘留

朱 松1*，袁曉晴2，戴 軍1，陳尚衛1

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學分析測試中心，江蘇 無錫 214122；2.河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450000)

采用高效液相色譜法，建立了同時分析玉米素(Z)、赤霉酸(GA)、多效唑(PBZ)、4-氟苯氧乙酸(4-FPA)、4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、脫落酸(ABA)、萘乙酸(NAA)、氯吡脲(CPPU)、2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)及2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)13種植物激素含量的方法。采用含0.5%甲酸的80%乙腈進行提取，分散固相萃取吸附劑(C18和硅藻土)進行凈化，選取Waters XBridge C18色譜柱，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，二極管陣列檢測器200～400 nm檢測，外標法定量。結果表明，13種植物激素在50 min內可實現基線分離，在線性范圍內的相關系數(r)為0.992 1～0.999 3；加標回收率為68.4%～95.1%；相對標準偏差(RSD)均小于5%；方法的檢出限為0.005～0.020 mg/kg；定量下限為0.01～0.09 mg/kg。該方法前處理操作快速、簡便，具有良好的靈敏度、精密度和回收率，適用于果蔬的質量監控。

QuEChERS；高效液相色譜(HPLC)；植物激素；果蔬

植物激素是指人工合成或從微生物中提取的、外部施用于植物、可以調節植物生長發育的非營養的化學物質，使用較低濃度的植物激素即可對植物的生長發育起到促進或抑制作用[1]。近年來，植物激素的應用日益廣泛。然而，植物激素與其他農藥一樣，在使用過程中存在潛在的安全風險。有植物激素殘留的果蔬，在短期食用可能對人體影響不大，但長期食用會導致人體內分泌紊亂，影響體內的代謝平衡[2]。因此，國際食品法典委員會、歐盟、美國、日本等均對水果蔬菜中植物激素的殘留限量進行了規定。我國《GB 2763-2012食品中農藥最大殘留限量標準》中規定PBZ，2，4-D和2,4,5-T的限量為0.5 mg/kg，NAA和CPPU的限量為0.1 mg/kg，6-BA的限量為0.2 mg/kg；國際食品法典委員會標準中規定GA3，Z，IAA和IBA的限量為0.2 mg/kg；歐盟標準中規定4-FPA和4-CPA的限量為0.2 mg/kg。目前植物激素的使用不當或濫用現象導致的食品安全問題日益增多，從食品安全的角度來看，有必要建立一種實用準確的果蔬中植物激素殘留分析方法。

目前，常用的植物激素由于化學結構差異很大，因而殘留分析方法也各不相同，已有的檢測方法主要包括氣相色譜法[3]、放射免疫法[4]、酶聯免疫法[5]、毛細管電泳法[6]、液相色譜法[7-8]、色譜-質譜聯用法[9-10]等。其中放射免疫法和酶聯免疫法等免疫檢測法由于檢測過程中干擾因素較多，需繼續完善，以減少交叉反應，提高測定結果的準確性；氣相色譜法檢測首先需要對樣品進行衍生化處理，步驟較為繁瑣，而且不同的植物激素采用的衍生化方法也不同，不能對多種植物激素殘留進行同時檢測；高效液相色譜法檢測可以解決氣相色譜法需衍生化的缺陷，并實現不同類型植物激素的多殘留檢測。而色譜-質譜聯用法由于儀器較為昂貴，常用于超標樣品的確證。相比較而言，液相色譜法是一種更為實用的植物激素分析方法。

對于液相色譜法而言，樣品前處理決定著分析的準確性和精密度，是整個分析過程的重要步驟。QuEChERS方法具有快速、簡單、成本低、有效、可靠和安全等特點，被廣泛應用于水果、蔬菜和農作物中的農藥殘留檢測[11-13]。本文選取玉米素、赤霉酸、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧基乙酸、多效唑、3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、對氯苯氧乙酸鈉、脫落酸、3-吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、氯吡脲、2,4,5-三氯苯氧乙酸為研究對象，采用QuEChERS方法，建立了針對果蔬樣品中上述13種不同植物激素的提取凈化技術，并通過高效液相色譜法實現了果蔬樣品中植物激素的多殘留檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters1525高效液相色譜儀，配有Waters 2707自動進樣器和Waters2998 DAD檢測器(美國Waters公司)；EL204分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(無錫市星海王生化設備有限公司)。

赤霉酸(GA,98.0%)、玉米素(Z,98.5%)、多效唑(PBZ,98.5%)、4-氟苯氧乙酸(4-FPA,98.5%)、4-氯苯氧乙酸(4-CPA,98.0%)、吲哚-3-乙酸(IAA,99.5%)、吲哚-3-丁酸(IBA,99.9%)、6-芐氨基嘌呤(6-BA,99.0%)、脫落酸(ABA,99.5%)、萘乙酸(NAA,98.5%)、氯吡脲(CPPU,98.7%)、2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D,99.0%)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T,99.0%)均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，美國天地公司)；草莓、獼猴桃等果蔬購于當地超市。

1.2 樣品處理

提取：以含0.5%甲酸的80%乙腈水溶液為提取液，果蔬樣品在多功能食品加工機內打成勻漿，準確稱取5 g樣品勻漿于50 mL離心管中，加入10 mL提取液，劇烈振蕩1 min，加入6 g MgSO4和1.5 g NaAc，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液。

凈化：在提取上清液中加入1.2 g MgSO4，400 mg C18和400 mg硅藻土，劇烈振蕩30 s，4 000 r/min離心5 min，取上清液，用氮吹儀濃縮至近干，加入1.0 mL乙腈溶液復溶，超聲30 s，過0.22 μm微孔濾膜，濾液供高效液相色譜儀檢測。

1.3 標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg的赤霉酸、玉米素、多效唑、4-氟苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐氨基嘌呤、脫落酸、萘乙酸、氯吡脲、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4,5-三氯苯氧乙酸標準品置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇水溶液溶解并定容后，充分混勻，配制成標準母液，置于4 ℃的冰箱內保存，逐級稀釋制備成所需系列標準溶液，現用現配。

1.4 色譜條件

實驗采用Waters XBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫為30 ℃，二極管陣列器的檢測波長為200～400 nm，采用梯度洗脫。流動相:A為乙腈-水-乙酸溶液(10∶90∶0.05)，B為乙腈-水-乙酸溶液(80∶20∶0.05)，梯度洗脫程序：0～40 min，20%～70 % B；40～50 min，70%～95% B；50～54 min，95% B，流速為0.9 mL/min。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

本實驗通過考察混合標準溶液的分離情況來對比不同型號C18色譜柱的效果，包括：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、XBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)以及GraceSmart RP 18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，發現使用XBridgeTMC18色譜柱的分離效果最好，因此最終確定Waters公司的XBridgeTMC18色譜柱為本實驗的色譜柱。

隨后考察了流動相對分離的影響，直接以乙腈-水溶液作為流動相時，13種植物激素的混合標準樣品不能完全分離，色譜峰拖尾嚴重，且峰形很差。乙酸可以抑制樣品基質的電離，改善色譜峰的拖尾現象，因此流動相中需要加入乙酸[14]。本實驗對流動相中乙酸的用量進行了考察，發現乙酸含量為0.05%時分離效果最佳，既能保證13種植物激素混合標樣的有效分離，改善拖尾現象，也可防止流動相酸度過大而損壞色譜柱。因此最終確定流動相A為乙腈-水-乙酸溶液(10∶90∶0.05)，B為乙腈-水-乙酸溶液(80∶20∶0.05)，并采用梯度洗脫方式進行洗脫。

采用DAD檢測器對13種植物激素進行檢測，確定最佳檢測波長分別為：4-氟苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、2,4,5-三氯苯氧乙酸的檢測波長為220 nm；玉米素、赤霉酸、多效唑、吲哚-3-乙酸、6-芐氨基嘌呤、氯吡脲和2,4-二氯苯氧乙酸的檢測波長為240 nm；4-氯苯氧乙酸、脫落酸和萘乙酸的檢測波長為290 nm。

在優化色譜條件下，13種植物激素標樣的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 植物激素標樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of phytohormones standard mixture1.Z；2.GA；3.PBZ；4.4-FPA；5.4-CPA；6.IAA；7.IBA；8.6-BA；9.ABA；10.NAA；11.CPPU；12.2,4-D；13.2,4,5-T

2.2 樣品提取條件的優化

根據13種植物激素的化學性質和已有文獻報道[15-16]，本實驗考察了4種提取溶劑(80%乙腈，80%甲醇-0.5%甲酸，80%乙腈-0.5%甲酸，乙腈-0.5%甲酸)對不同植物激素在0.5 mg/kg加標水平下的提取效果，結果顯示，由于4-氟苯氧乙酸、脫落酸、4-氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、萘乙酸、吲哚-3-乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸的分子結構中均含有羧基，而酸性環境對羧基在溶液中呈現離子形態起到一定的抑制作用，所以在提取液中加入0.5%的甲酸有助于提高此類化合物的回收率。進一步比較了80%乙腈-0.5%甲酸和乙腈-0.5%甲酸的提取效果，發現對于大部分植物激素而言，80%乙腈-0.5%甲酸的回收率更好，考慮到提取目標物的極性差異，選擇一個合適極性提取液是非常必要的。綜合不同植物激素的回收率結果，本實驗采用80%乙腈-0.5%甲酸作為提取溶劑，此時各植物激素的回收率為86.4%～105.0%。

圖2 不同凈化方法對植物激素的回收率比較Fig.2 Recoveries of phytohormones with different purification methods

2.3 凈化條件的優化

分散固相萃取技術是QuEChERS方法的凈化手段，它主要通過極性、非極性和離子相互作用選擇性除去基質中的干擾組分，從而達到凈化樣品的目的。目前，常用的吸附劑有PSA、C18、硅藻土、中性氧化鋁等。本實驗比較了PSA、C18、硅藻土以及C18+硅藻土的凈化效果(圖2)。在使用PSA作為吸附劑時，極性較強和含有羧基的植物激素回收率較低，存在一定的吸附作用。而當采用C18作為吸附劑時，各植物激素均能得到較好的回收率，這與黃何何[17]和Cui[18]等的研究結果一致。實驗過程中發現硅藻土能有效吸附果蔬提取液中的色素類物質，而對于目標化合物吸附較少，聯合使用C18和硅藻土能達到更好的凈化效果。因此，本文采用1.2 g MgSO4+400 mg C18+400 mg硅藻土作為吸附劑，此時，13種植物激素的回收率均高于80.4%。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、檢出限及定量下限 采用優化的液相色譜分析條件對系列混合標樣進行測定，13種植物激素的濃度(X,μg/mL)與對應的峰面積(Y)呈良好的線性關系，其相關系數(r2)為0.992 1～0.999 3。將3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)對應的樣品質量濃度分別定義為該方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得13種植物激素的LOD為0.005～0.020 mg/kg，LOQ為0.01～0.09 mg/kg(見表1)。

表1 13種植物激素的線性方程，檢出限及定量下限Table 1 Linear equations,LODs and LOQs of 13 analytes

2.4.2 準確度與精密度 稱取6份空白樣品，分別添加0.3 mg/kg濃度的植物激素標準溶液，采用“1.2”方法預處理后，于同一天內上機分析，計算相對標準偏差(RSD)，得到日內精密度；每日稱取1份空白樣品，添加0.3 mg/kg濃度的植物激素標準溶液，當天進行樣品預處理和上機分析，連續測試5 d，計算RSD，得到日間精密度。由表2可知，日內精密度和日間精密度均小于5%，說明該方法精密度良好，能滿足樣品的檢測要求。

表2 13種植物激素的回收率、精密度及穩定性實驗結果Table 2 Precision,repeatability,stability and recovery of 13 analytes

圖3 草莓樣品中添加0.1 mg/kg植物激素后的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of blank sample spiked with 0.1 mg/kg phytohormone peak numbers were the same as those in Fig.1

在空白樣品中添加植物激素標準溶液，濃度均為0.3 mg/kg，預處理后每隔2 h進行測試，其RSD小于5%，說明樣品在10 h內穩定性良好。重復制備樣品6次進行測試，RSD小于5%，說明該方法的重復性良好。

對陰性樣品進行加標回收率實驗，分別取草莓、獼猴桃、豆芽樣品，添加3個不同濃度(0.1，0.3，0.5 mg/kg)的植物激素標準溶液，13種植物激素的平均加標回收率為68.4%～95.1%，RSD均小于5%，方法的準確度和精密度均符合檢測要求。圖3為13種植物激素添加量為0.1 mg/kg的草莓樣品色譜圖，各植物激素在保留時間區域內無干擾，故本方法具有較好的選擇性。

2.5 方法的應用

運用本文建立的方法對市售的獼猴桃、草莓、豆芽、青椒進行檢測，每種果蔬樣本量均為5份。結果顯示，樣品中均未檢出此13種植物激素。

3 結 論

本文將QuEChERS凈化方法與HPLC/DAD結合應用于果蔬樣品中13種植物激素的同時檢測，并成功應用于實際樣品的測定。方法簡便快速，儀器設備通用性強，能夠滿足我國對植物激素殘留限量的要求，具有一定的實際應用價值。

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Simultaneous Determination of Different Phytohormones Residues in Fruits and Vegetables by QuEChERS/DAD/HPLC

ZHU Song1*,YUAN Xiao-qing2，DAI Jun1,CHEN Shang-wei1

(1.Analysis & Testing Center,State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China；2.Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450000,China)

This work describes the development of a sensitive and reliable method using QuEChERS sample preparation and high performance liquid chromatography-diode array detector(HPLC-DAD) for simultaneous determination of phytohormones, zeatin(Z), gibberellic acid(GA), paclobutrazol(PBZ), 4-fluorophenoxyacetic acid(4-FPA), 4-chlorophenoxyacetic acid(4-CPA), 3-indolyl-acetic acid(IAA), 3-indolyl-butyric acid(IBA), 6-benzylaminopurine(6-BA), abscisic acid(ABA), 1-naphthyl acetic acid(NAA), forchlorfenuron(CPPU), 2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid(2,4,5-T), in fruits and vegetables.The samples were extracted with 80% acetonitrile containing 0.5% acetic acid,and the extract was cleaned up with dispersive solid phase extraction adsorbent(powder of C18and diatomaceous earth).The phytohormones were separated on a Waters XBridge C18,and eluated utilizing a gradient elution program of acetonitrile and water containing 0.05% acetic acid(by volume) as mobile phase.The correlation coefficients of calibration curves were over 0.99 in the corresponding concentration ranges.The average recoveries of the 13 analytes at three spiked concentration levels varied from 68.4% to 95.1% with relative standard deviations(RSD) less than 5%.The limits of detection(LOD) and quantitation(LOQ) were in the ranges of 0.005-0.020 mg/kg and 0.01-0.09 mg/kg,respectively.The real sample tests showed that the proposed method was simple,rapid,reliable and cost-effective,and was suitable for the simultaneous determination of phytohormones in fruits and vegetables.

QuEChERS；high performance liquid chromatography(HPLC)；phytohormones；fruits and vegetables

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.012

2016-09-21；

2016-11-15

食品科學與技術國家重點實驗室自主科研課題;高等學校重點科研項目(15A550015);國家自然科學基金(31401532)

O657.72；O629.8

A

1004-4957(2017)04-0513-06

*通訊作者：朱 松，博士，副研究員，研究方向：食品分析，Tel:0510-85919609，E-mail：zhusong@jiangnan.edu.cn