高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜確證測定面粉及面制品中氨基脲

黎 娟，曹 民，王翠蘋，閆革彬

(北京市昌平區疾病預防控制中心，北京 102200)

研究簡報

高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜確證測定面粉及面制品中氨基脲

黎 娟*，曹 民，王翠蘋，閆革彬

(北京市昌平區疾病預防控制中心，北京 102200)

采用高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜(HPLC-QTRAP-MS)建立了面粉及面制品中氨基脲的確證及測定方法。樣品采用鹽酸(HCl)提取，在超聲輔助下與衍生劑鄰硝基苯甲醛反應。衍生產物在中性條件下經PLS固相萃取柱凈化、乙酸乙酯洗脫，經Shim-Pack XR-ODS Ⅲ C18柱(2.0 mm×50 mm,1.6 μm)分離，0.1%(體積比)甲酸-水溶液和甲醇溶液為流動相梯度洗脫；采用多反應監測(MRM)-信息依賴性采集(IDA)-增強子離子掃描(EPI)模式檢測，EPI譜庫確認，內標法定量。結果表明：氨基脲在0.5～40 μg/L范圍內線性關系良好(r=0.996)；檢出限(LOD，S/N=3)為0.10 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)為0.25 μg/kg；4個加標水平(0.25，0.5，2.0，10.0 μg/kg)下的回收率為89.1%～112.8%；相對標準偏差(RSD)為1.4%～8.6%。該方法分析速度快，靈敏度高，回收率好，可用于面粉及面制品中氨基脲的快速檢測。

高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜；氨基脲；超聲輔助衍生；面粉及面制品

氨基脲(Semicarbazide,SEM)，化學分子式為CH5N3O，是呋喃西林的特征性代謝產物，也是偶氮二甲酰胺在高溫條件下的分解產物，可在動物源食品、面制食品等多種食品中被檢出[1]。面粉及其制品中的氨基脲主要來源于添加劑偶氮甲酰胺。偶氮甲酰胺是一種能強化面筋、改善面制品組織結構的增筋劑，其在濕潤的條件下能夠轉化為聯二脲和脲唑，其中聯二脲分子結構與氨基脲相似，可在酸性加熱條件下生成氨基脲殘留于面粉制品中[2-4]。

目前國內外對于偶氮甲酰胺是否可以作為食品添加劑直接用在面制品中存在不同規定，歐盟、澳大利亞、新加坡等地區和國家已禁止將偶氮甲酰胺作為食品添加劑用于面粉的加工，而在我國偶氮甲酰胺仍可作為添加劑用于面制食品，且在GB 2760-2014《食品添加劑使用衛生標準》中規定其使用上限標準為45 mg/kg[5-6]。有關資料顯示，面制品中偶氮甲酰胺與氨基脲的轉化效率約為1%，并指出面粉中偶氮甲酰胺的添加量與其轉化生成的氨基脲的殘留量成正比[7-8]。以上研究暗示若面制品中偶氮甲酰胺的用量為45 mg/kg，則可產生的氨基脲殘留量約為450 μg/kg，結合相關毒理學研究結果，即氨基脲具有神經毒性、遺傳毒性、生殖毒性及抗雌激素活性等生物毒性效應[9-12]，不難推測一旦氨基脲隨著食物進入人體，將會對人體健康造成潛在危害。

由于偶氮甲酰胺引起的食品安全隱患歸根結底是由于其分解產物——氨基脲具有多種生物毒性效應，因此確證食品中氨基脲的殘留水平是監測偶氮甲酰胺引起的健康風險的關鍵步驟。然而，迄今我國對于面粉及面制品中氨基脲殘留量的檢測仍無相應的標準。目前主要采用液相色譜-串聯質譜法進行檢測，由于氨基脲的分子量小、熱穩定性差，因此需要衍生后測定。國際上通用的動物組織、面粉及面制品中氨基脲的衍生方法是樣品經2-硝基苯甲醛(2-NBA)在恒溫振蕩下水解衍生16 h。近來尹等[13]建立了超聲波輔助衍生，HPLC-MS/MS測定養殖水體中包括氨基脲在內的4種硝基呋喃代謝物的分析方法，超聲輔助方法將衍生時間從傳統的16 h縮短到60 min，但該報道未考察溫度對衍生效率的影響。四極桿/離子阱質譜儀(QTRAP-MS)由于兼具串聯四極桿和離子阱的功能，其多反應監測(MRM)-信息依賴性采集(IDA)-增強子離子掃描(EPI)的采集模式可以實現一次進樣完成確證和定量分析。因此，近年來應用QTRAP-MS進行檢測的文獻報道逐漸增加[14-16]，但使用QTRAP-MS檢測氨基脲的文獻尚無報道。本文基于高效液相色譜-離子阱質譜，即應用QTRAP-MS，采集模式MRM-IDA-EPI，結合優化超聲衍生溫度、時間等前處理條件及色譜-質譜條件，建立了面粉及面制品中氨基脲確證和測定的分析技術。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4500 QTRAP型三重四極桿串聯質譜儀配電噴霧離子源(美國AB 公司)；LC-30A型高效液相色譜(日本島津公司)；2-16KL型冷凍離心機(美國Sigma公司)；GL Sciences固相萃取裝置(Dikma公司)；氮吹儀(美國Organomation 公司)；旋渦震蕩儀(海門市麒麟醫用儀器廠)。

甲醇、甲酸(色譜純，Dikma公司)；氫氧化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；濃鹽酸(優質純，國藥集團化學試劑有限公司)；鄰硝基苯甲醛(Alfa Aesar公司，純度98%);氨基脲鹽酸鹽(SEM-HCl，Fluka公司，純度99%)；氨基脲鹽酸鹽同位素內標(SEM-[1,2-15N213C]，Fluka公司，純度99%)。PLS固相萃取柱(Dikma公司)。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Shim-Pack XR-ODS Ⅲ C18(2.0 mm×50 mm, 1.6 μm)；流動相:A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，10%B；0.1～6 min，10%～30% B；6～8 min，30%～90% B；8～10 min，90% B；10～12 min，10% B。柱溫箱：40 ℃；分析時間12 min。

1.3 質譜條件

用正離子模式(ESI+)，在MRM-IDA-EPI掃描模式下采集數據；MRM檢測窗口:60 s;目標掃描時間:1 s;IDA采集閾值:500 cps(勾選動態背景扣除);EPI掃描速率:10 000 Da/s;掃描質量數范圍:50～300。優化后的質譜分析條件：離子化電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度(TEM)：550 ℃；氣簾氣壓力(CUR)：1.7×105Pa；噴霧氣(GS1)：3.8×105Pa；輔助加熱氣(GS2)：4.0×105Pa。定量離子、定性離子、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表1 氨基脲及其同位素內標的質譜條件Table 1 MS parameters for the determination of SEM and SEM isotopes

*quantitative ion;DP:declustering potential;CE:collision energe

1.4 樣品處理方法

1.4.1 樣品水解與衍生化 稱取混勻的試樣 2 g(準確至0.001 g)，置50 mL 塑料離心管中，加氨基脲同位素內標溶液(0.1 μg/mL) 50 μL和鹽酸(0.2 mol/L)10 mL，在渦旋混合器上混合均勻后，加入100 μL 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，再次混勻后，置于超聲波儀中在37 ℃下避光超聲30 min。

1.4.2 樣品的提取與凈化 將衍生化后的試樣冷卻至室溫，加NaOH溶液(2.0 mol/L)1.1 mL調節pH 值(6.8～7.2)，于4 ℃下，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，待過PLS柱。依次用3 mL甲醇和3 mL水活化PLS小柱，上樣，以6 mL水淋洗。淋洗后吹干，加乙酸乙酯3 mL洗脫。洗脫液在40 ℃下氮吹至近干，殘渣以甲酸溶液(0.1%)1 mL溶解，離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)，取上清液檢測。

1.5 空白基質匹配標準溶液的配制

使用不含有氨基脲的面粉作為空白基質，稱取2 g(準確至0.001 g)置于50 mL 塑料離心管中，加鹽酸(0.2 mol/L) 10 mL，在渦旋混合器上混合均勻。分別加氨基脲標準溶液(0.020 μg/mL) 0，25,50，100，250，500，2 000 μL，并分別加氨基脲同位素內標溶液(0.10 μg/mL) 50 μL。其余操作按照“1.4.1”和“1.4.2”所述。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

食品中氨基脲的HPLC-MS/MS檢測方法中，關于流動相的選擇有所不同：如農業部781號公告中采用5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸作為流動相分析動物源食品中包括氨基脲在內的多種硝基呋喃代謝產物；而王丹等[16]經過與農業部781號公告中的方法比較，認為以0.1%的甲酸水和純乙腈溶液作為流動相可降低質譜的背景信號值、提高信噪比。本實驗以0.1%的甲酸水作為流動相A，并比較了以純甲醇和純乙腈分別作為流動相B的情況下目標化合物峰的分離程度，發現選擇純乙腈為流動相B時氨基脲的保留時間為4.25 min，而選用純甲醇為流動相B時，氨基脲的保留時間為6.22 min，除了保留時間有所差別，其余無任何影響。考慮到乙腈成本高，且毒性大，所以本實驗選擇甲醇作為流動相B，以達到較好的色譜分離目的，同時又可降低實驗成本和提高安全操作保障。圖1為本實驗條件下HPLC-MS/MS分析氨基脲及其同位素內標的MRM色譜圖。

2.2 樣品衍生化條件的選擇

HPLC-MS/MS檢測食品中的氨基脲，一般采用2-NBA衍生氨基脲，形成特征性衍生物，以提高質譜檢測的靈敏度。超聲波的高頻振蕩可加速樣品分散，使得樣品與溶劑的接觸面積增大，進而提高傳質速率，因此使用超聲輔助衍生具有節約衍生反應時間的優勢。本研究采用內標定量法，以回收率為指標，選擇37，45，60 ℃ 3個衍生溫度梯度，分別在15，30，60，120，180，240 min超聲時間下進行衍生化反應。結果顯示，衍生溫度為37 ℃和45 ℃時，上述6個超聲時間段下的回收率分別為103.7%，103.4%，103.8%，103.5%，103.6%，103.9%和104.1%，104.4%，104.8%，104.4%，104.8%，103.2%；而衍生溫度為60 ℃時，各超聲時間段下的回收率分別為109.8%，108.2%，107.8%，106.9%，107.6%及109.6%。超聲衍生時間的比較實驗結果顯示，對于同一衍生溫度，其回收率在各超聲時間段下無明顯差異。初步優化結果表明衍生溫度對衍生效率有一定影響，37 ℃或45 ℃可作為適宜衍生溫度采用，而超聲衍生時間對衍生效率無明顯影響，即超聲時間段從15 min至240 min均可。

圖2 1 μg/L氨基脲標準溶液的在線EPI譜圖Fig.2 On-line EPI spectrum of 1 μg/L SEM standard solution

2.3 質譜條件的選擇

采用1 μg/L氨基脲標準溶液進行質譜參數優化，以MRM-IDA-EPI模式采集氨基脲的EPI譜圖(圖2)，所得到的質譜相關參數如“1.3”所述。與MRM掃描模式相比，MRM-IDA-EPI采集模式同時具有篩查、定量和確證功能，能夠獲得較為豐富的確證信息。本方法中EPI模式是在3種采集能量(20，35,50 V)水平上獲得離子碎片的數學組合，即一次采集可獲得3種能量級(20，35，50 V)的EPI圖譜。如圖2所示，EPI譜圖中除了包含MRM采集的m/z209，166外，還有m/z192，177，149，64.8等碎片離子的信息，根據歐盟關于鑒別點(IdentificationPoint，IP)的計算規則[17]，母離子IP為1.0，子離子IP為1.5，使用該采集模式獲得的氨基脲IP值為8.5，遠高于歐盟規定的污染物確認方法中IP值應為4.0的要求。由于離子阱的靈敏度高于四極桿，因此即使是低濃度水平的檢測，EPI譜圖也可獲得較好的確證優勢。

2.4 定量下限及線性關系

取實際加標樣品溶液，用0.1%甲酸水倍比稀釋后測定，以信噪比(S/N)為3時所測定實際加標樣品溶液中氨基脲的濃度為檢出限，以S/N為10時氨基脲的濃度為定量下限。在標準溶液中，以目標組分定量離子的相對峰面積比值(y)對相應的質量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線(濃度范圍：0.5,1.0,2.0,5.0,10,40 μg/L)，線性回歸采用1/x2權重(校正低濃度端準確度)，所得線性回歸方程為y=2.27x+0.003 98，線性關系良好(r=0.996)。當取樣量為2 g時，本研究中氨基脲的檢出限為0.10 μg/kg，定量下限為0.25 μg/kg。運用LC-MS/MS檢測面粉中的氨基脲，周、劉等得到的檢出限分別為0.15，0.25 μg/kg[6,18]，而王、周等獲得的定量下限為0.50 μg/kg[16,18]，均達到國際要求的檢出限0.50 μg/kg。可見，與上述報道的數據相比，本方法可以獲得更佳的檢出限與定量下限。

2.5 回收率與精密度

以陰性面粉為樣品基質，進行4個濃度水平(0.25,0.5,2.0,10.0 μg/kg)的加標回收檢測，每個濃度水平進行6次平行實驗，內標法定量，計算其平均回收率及相對標準偏差(RSD)。結果顯示，在4個加標水平下氨基脲的平均回收率范圍分別為89.1%～112.8%，95.6%～109.6%，101.3%～108.8%，97.9%～102.3%，RSDs范圍分別為6.9%～8.6%，4.9%～5.6%，3.6%～3.8%及1.4%～1.5%。

2.6 EPI譜圖匹配純度閾值的確定及運用

采用LC-MS/MS分析物質殘留時，通常將鑒別點數(IPs)、保留時間(RT)及信噪比(S/N)等作為物質定性的參數。本方法使用EPI圖譜比對輔助進行面粉及其制品中氨基脲殘留量確證：用IDA觸發保留時間匹配(±2.5%)且信噪比滿足要求(S/N≥3)的質量色譜峰，采集其EPI譜圖，進一步與譜庫中目標物的標準EPI譜圖進行比對，使用Analyst軟件計算EPI譜圖匹配的Fit、RevFit及Purity值。

Purity閾值確定方法參見文獻[15,19]，即通過空白加標實驗與標準溶液相比對確定，取陰性面粉樣品作為空白基質加標(以定量下限0.25 μg/kg為加標量)，測定10個平行試樣，采集氨基脲的EPI譜圖與標準EPI庫進行比對。計算結果顯示，空白基質添加樣品中的EPI譜圖對標準工作液和對基質標準工作液的EPI譜圖匹配Purity值無明顯差別，故本實驗以對標準工作液的Purity值70.44(±2.88)為氨基脲的EPI譜圖純度閾值，樣品中氨基脲的EPI譜圖匹配Purity值超過70.44即可作為確證分析的有效判據。

為了進一步確認最佳衍生時間和溫度，本研究根據建立好的高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜條件，并結合“2.2”所述，分別對比分析37,45,60 ℃下，超聲衍生時間為15 min和30 min的氨基脲EPI譜圖，以EPI譜圖比對的匹配結果作為輔助指標判斷最優衍生條件。結果表明，綜合考慮匹配結果的Fit,RevFit及Purity值，則最佳衍生溫度和時間分別為37 ℃和30 min(表2)；在實際樣品檢測中均采用該衍生條件，即在37 ℃下超聲衍生30 min。

2.7 實際樣品的檢測

利用本方法對53件北京市售的面粉及其制品(面包、蛋糕、餅干、包子)中的氨基脲進行檢測，檢出陽性樣品24件，含量為0.171～913 μg/kg。圖3為1個檢出量為244 μg/kg的面包樣品的相關圖譜。其相應目標峰EPI圖譜匹配在線譜庫中標準的氨基脲EPI圖譜的Fit，RevFit及purity值分別88.41,92.28及87.09，可有效確證面包中氨基脲的存在。

圖3 面包樣品中氨基脲的選擇離子流質量色譜圖(A)、在線EPI譜圖(B)及譜庫中氨基脲的標準EPI譜圖(C)Fig.3 Extracted ion chromatogram of SEM in positive bread sample(A)，on-line EPI spectrum of SEM(m/z 209.1/166.0) in positive bread sample(B) and on-line EPI matched spectrum of SEM in library(C)

3 結 論

本文基于高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜(HPLC-Q/Trap-MS)建立了面粉及面制品中氨基脲的確證及測定方法。在樣品提取中，采用超聲波輔助衍生方法代替傳統的恒溫振蕩法，并在此基礎上探討了超聲波輔助衍生的最佳溫度和時間，發現超聲溫度為37 ℃、衍生時間為30 min時衍生效率達到最佳。此外，本方法采用多反應監測(MRM)-信息依賴性采集(IDA)-增強子離子掃描(EPI)模式檢測可得到較高的IP值，且可同時得到3個能量級的EPI圖譜，通過將其與譜庫中標準EPI圖譜對比，實現了對氨基脲的確證和定量分析。該方法分析速度快，靈敏度高，回收率好，可有效用于面粉及其制品中氨基脲的快速檢測，并為面粉及其制品中氨基脲的監管提供了強有力的技術支撐。

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Identification and Detection of Semicarbazide in Flour and Flour Products by High Performance Liquid Chromatography Coupled to Quadrupole/Linear Ion Trap Mass Spectrometry

LI Juan*,CAO Min,WANG Cui-ping,YAN Ge-bin

(Changping Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102200,China)

An analytical method was developed for the identification and detection of semicarbazide(SEM) residues in flour and flour products by high performance liquid chromatography coupled to quadrupole/linear ion trap mass spectrometry(HPLC-QTRAP/MS).Samples were reacted with o-nitrobenzaldehyde in HCl with assistant of ultrasonic to produce stable derivative,and then the derivative was cleaned up with PLS SPE cartridge,eluted with ethyl acetate.The separation of analytes was carried out on a Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18column(2.0 mm×50 mm,1.6 μm) using mobile phases of 0.1%(by volume) formic acid in ultrapure water and methanol solution by gradient elution.A multiple reaction monitoring(MRM) scan mode and an enhanced product ion(EPI) scan mode as dependent in an information-dependent acquisition(IDA) experiment were used in mass spectrometry acquisition．Lab-built EPI library and the internal standards were adopted for the identification and quantification．The results indicated that the calibration curve of SEM showed a good linearity(r=0.996) whithin the range of 0.5-40 μg/L.The limit of detection(LOD,S/N=3) for SEM was 0.10 μg/kg,and the limit of quantitation(LOQ,S/N=10) was 0.25 μg/kg．The average recoveries of SEM at four spiked levels of 0.25,0.5,2.0,10.0 μg/kg were in the range of 89.1%-112.8% with relative standard deviations(RSDs) of 1.4%-8.6%.With high sensitivity and good recovery,the proposed method was effectively used to identify and detect the residues of semicarbazide in flour and flour products.

high performance liquid chromatography-quadruple/linear ion trap mass spectrometry(HPLC-QTRAP/MS)；semicarbazide；ultrasonic-assisted derivatization；flour and flour products

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.008

2016-11-14；

2016-12-10

中國科學院生態環境研究中心環境化學與生態毒理學國家重點實驗室開放基金(KF2015-04)

O657.63;TS213.2

A

1004-4957(2017)04-0490-06

*通訊作者：黎 娟，博士，主管技師，研究方向：食品科學與毒理學，Tel:010-69720125，E-mail:allison_2008@126.com