P2X2受體在肝郁脾虛證小鼠模型前額皮質中的表達

劉 燕 丁秀芳 嚴志祎 李曉娟 劉玥蕓 鄒小娟 丁鳳敏 余 濤 陳家旭,

(1 湖北中醫藥大學，武漢，430065； 2 河南中醫藥大學，鄭州，450046； 3 北京中醫藥大學，北京，100029)

P2X2受體在肝郁脾虛證小鼠模型前額皮質中的表達

劉 燕1,2丁秀芳3嚴志祎3李曉娟3劉玥蕓3鄒小娟1丁鳳敏1余 濤1陳家旭1,3

(1 湖北中醫藥大學，武漢，430065； 2 河南中醫藥大學，鄭州，450046； 3 北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：研究胞外ATP特異性P2X2受體的表達與肝郁脾虛證發生之間的關系，為深入了解胞外ATP的釋放現象與肝郁脾虛證的發生機制之間的關系奠定基礎。方法：48只C57BL/6J小鼠隨機分為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組，除正常組外其余各組小鼠均接受復合應激21 d，建立肝郁脾虛證小鼠模型。采用免疫組化、western blot和實時熒光定量PCR方法檢測各組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白和基因的表達。結果：與正常組比較，模型組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達顯著下降(P<0.05)，而P2X2受體mRNA表達差異無統計學意義，但存在一定的下降趨勢(P>0.05)；與模型組比較，逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達顯著升高(P<0.05)，氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體mRNA表達顯著升高(P<0.05)。結論：本研究結果表明基于復合應激的肝郁脾虛證小鼠前額皮質P2X2受體的表達存在減少的趨勢，其可能是誘導肝郁脾虛證發生的一個重要原因。

P2X2受體；肝郁脾虛證；小鼠模型；前額皮質

肝郁脾虛證指由于肝氣郁結，疏泄失司，導致脾胃功能紊亂，出現肝木克脾土的情況，表現為消極、適應能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等[1]。現代生活節奏的加快，工作壓力、社會競爭、起居調攝失宜等原因，造成人們心里負荷加重，情志抑郁，氣機失于調達，而致肝郁脾虛證成為臨床的常見證候。長期以來，中醫研究者們一直試圖從多系統、多層次、多角度來詮釋肝郁脾虛證的實質，挖掘其臨床變化的物質基礎。

大量研究證實P2X2受體在動物中樞神經系統分布廣泛。P2X2受體具有多種生理功能，主要包括神經遞質釋放、細胞因子和趨化因子表達和釋放的調控，介導炎性反應和免疫反應，誘導細胞損傷和凋亡等[2-3]。大量研究證實神經遞質異常[4]、免疫反應[5]等均與肝郁脾虛證的發生密切相關。由此，可推測P2X2受體表達異常可能是肝郁脾虛證發生的上游機制。本研究通過檢測肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質組織中P2X2受體表達水平，并對P2X2在肝郁脾虛證發生中的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年C57BL/6J小鼠48只，10周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：NO.11400700088123。飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，溫度(22±2)℃，濕度30%～40%，各組小鼠常規飼養，自由進水。適應性飼養1周后按隨機數字表法分為正常組，模型組，逍遙散組和氟西汀組，每組12只，正常組6只一籠，其余3組單籠孤養，除正常組外，其余各組小鼠接受復合應激造模和相應藥物灌胃。

1.1.2 藥物 《太平惠民和劑局方》逍遙散：北柴胡30 g，當歸30 g，炒白術30 g，茯苓30 g，白芍30 g，薄荷10 g，甘草15 g，干姜10 g。逍遙散55劑均購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司，并由中日友好醫院制劑室精制成逍遙散藥粉共3 200 g，用時以蒸餾水稀釋至所需濃度。鹽酸氟西汀膠囊(Patheon Fance公司，批號：2061A，規格：20 mg/粒)。每周定點測量各組小鼠體重，并調整灌胃濃度。

1.1.3 試劑與儀器 抗P2X2受體兔多克隆抗體(購自Abcam公司，規格：100 μL，批號：ab10266)；抗β-Actin鼠單克隆抗體(購自康為世紀公司，規格：20 μL，批號：：CW0281)；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(購自中山金橋公司，規格：18 mL，批號：PV-9001)；AMV一步法RT-PCR試劑盒(購自Invitrogen公司，規格：500T，批號：L1500-01)。36012型光學顯微鏡(OLYMPUS公司)；RM2245石蠟切片機(LEICA公司)；Powerpac Basi電泳儀(BIO-RAD公司)；Tanon-5200型全自動化學發光成像分析系統(Tanon公司)；PICO17型臺式高速離心機(Thermo公司)；1600型凝膠成像系統(Tanon公司)；ABI ViiA7 Real Time PCR System(Applied Biosystems)

1.2 方法

1.2.1 模型制備 以復合應激方法建立肝郁脾虛證小鼠模型，采用新環境抑制進食實驗、曠場實驗、高架十字迷宮實驗、血清D木糖檢測等方法對肝郁脾虛證小鼠模型進行評價[6]。

1.2.2 標本采集與制備 21 d造模和藥物干預結束后，以3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，每組隨機選取5只小鼠，以4%的多聚甲醛進行灌流固定，取全腦放入4%多聚甲醛溶液中備用切片，剩余的小鼠直接開顱取前額皮質組織放入凍存管，標記并凍存于-80 ℃備用。

1.2.3 免疫組化檢測 免疫組化染色采用二步法。將各組小鼠前額皮皮質置于二甲苯和梯度乙醇中脫蠟和水化后，于枸櫞酸鹽緩沖液中高壓抗原修復10 min，待自然冷卻后，滴加3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，采用山羊血清工作液4 ℃封閉過夜后，滴加適當稀釋的抗P2X2受體多克隆抗體(1∶500)濕盒內4 ℃孵育過夜，其余步驟按照試劑說明書進行操作。以PBS代替一抗做陰性對照。圖像采集和分析：CellSens Dimension1.11圖像采集系統進行觀察和拍照，并采用Court & Measure Full cellSens 1.11系統對圖片進行分析，計算陽性細胞數和平均光密度(Optical Density，OD)值。

1.2.4 Western blot檢測小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達 細胞裂解法提取小鼠前額皮質總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜(濕轉法)，孵育一抗、二抗，ECL化學發光法顯色，Tanon-5200型全自動化學發光成像分析系統曝光自動獲取蛋白條帶圖像。用系統自帶GIS1D 4.2圖像分析軟件對圖像灰度值進行采集，以相同蛋白樣品的灰度值為標準對各孔灰度值進行歸一化處理，然后以P2X2受體蛋白灰度值比相應的β-actin灰度值的表示P2X2受體蛋白的相對表達量。

1.2.5 實時熒光定量PCR方法檢測肝郁脾虛證小鼠前額皮質P2X2 mRNA的表達 Trizol法提取小鼠前額皮質總RNA，分光光度法測定260 nm與280 nm的OD值，用且RNA純度為A260/A280比值，范圍在1.8～2.1之間。按AMV一步法RT-PCR試劑盒說明進行反轉錄和熒光定量PCR擴增。每次擴增設置無模板的陰性對照和GAPDH陽性對照，上面實時熒光定量重復3次，得到3次Ct，并算出平均Ct值。引物設計與合成：序列參照Gene Bank數據庫中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計，由華大基因公司合成(見表1)。SDS軟件系統導出數據模塊，根據RQ=2-△△Ct方法對P2X2 mRNA的表達進行相對定量分析。公式：△Ct實驗組=Ct靶基因-Ct管家基因；△Ct對照組=Ct靶基因-Ct管家基因；△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

表1 小鼠P2X2引物序列

2 結果

2.1 小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達情況 免疫組化結果顯示：與正常組比較模型組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白OD值和陽性細胞數顯著降低(P<0.05；P<0.01)；與模型組比較逍遙散組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白OD值和陽性細胞數顯著升高(P<0.01；P<0.05)，氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白OD值著升高(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 各組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白免疫組化OD值及陽性細胞數的統計學描述±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組小鼠前額皮質PrL區P2X2蛋白表達免疫組化圖(400×)

Western Blot檢測結果顯示：與正常組比較，模型組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達顯著升高(P<0.01，P<0.05)。

表3 各組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達的統計學描述±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 各組小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達

2.2 小鼠前額皮質P2X2受體mRNA表達情況 實時熒光定量PCR檢測結果顯示：與正常組比較，模型組、逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，氟西汀組小鼠前額皮質P2X2受體mRNA表達顯著升高(P<0.05)。

表4 各組小鼠前額皮質P2X2受體 mRNA表達的統計學描述±s)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

在中樞神經系統中，胞外ATP是一種重要的信號轉導分子，在細胞外環境中，ATP可以結合到其特異性P2受體上，從而介導各種作用，由于大規模的ATP釋放現象一般出現在各類應激、腦缺血、腦損傷之后，由于其具有細胞外營養功能，因此，可以認為細胞外ATP在中樞神經系統中扮演者非常復雜的角色，具有神經系統疾病治療靶點的潛能[7]。

既往研究顯示ATP特異性P2受體在全身多個組織、器官、和系統中均可被檢測到。其中P2X2受體在大腦皮質、海馬、韁核、下丘腦腹正中核、三叉神經中腦核、迷走神經背核和孤束核等部位均存在大量表達[8]。另外現代醫學認為，肝郁脾虛證的病因學基礎與情志反應密不可分，神經中樞—丘腦下部—腦干植物神經系統—效應器作為情志反應的作用軸，而前額皮質腦區作為情緒控制、認知、感覺和運動等多級協調體系的高級中樞，其形態和功能的改變均與肝郁脾虛證的發生發展存在著密切的聯系[9-10]。因此，本研究基于復合應激肝郁脾虛證小鼠模型對肝郁脾虛證小鼠前額皮質P2X2受體蛋白和基因的表達情況及逍遙散的調節作用進行了觀察，以了解胞外ATP特異性P2X2受體的表達與肝郁脾虛證發生之間的關系，為深入了解胞外ATP的釋放現象與肝郁脾虛證的發生機制之間的關系奠定基礎。

本次研究通過免疫組化和Western blot技術觀察到肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質P2X2受體蛋白表達較正常組均存在顯著減少的現象，而逍遙散和氟西汀2種藥物均能顯著改善這種現象。另外本次研究通過實時熒光定量PCR技術對肝郁脾虛證小鼠前額皮質P2X2受體mRNA的表達進行了觀察，結果顯示較正常小鼠，模型組小鼠前額皮質P2X2受體mRNA的表達無顯著差異，但存在一定的下降趨勢，而逍遙散和氟西汀這2種藥物也均有改善這種現象的趨勢，體現了2種藥物對肝郁脾虛證小鼠的治療作用。從方證對應角度來看，逍遙散為肝郁脾虛證之代表方劑，其在模型小鼠前額皮質P2X2蛋白和基因表達方面均體現出較好的改善和治療作用，因此，根據方證對應原理，我們可以判定首先此肝郁脾虛證動物模型的建立是成功的，另外研究結果表明基于復合應激的肝郁脾虛證小鼠前額皮質P2X2受體的表達存在減少的趨勢，其可能是誘導肝郁脾虛證發生的一個重要原因，另外P2X2是胞外ATP的特異性受體，胞外ATP的釋放與應激有著密切的關系，那么肝郁脾虛證是否還與胞外ATP的含量以及ATP釋放機制紊亂有著密切的聯系？有待進一步深入研究。

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(2017-02-20收稿 責任編輯：洪志強)

The expression of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice with syndrome of liver depression and spleen deficiency

Liu Yan1,2, Ding Xiufang3, Yan Zhiyi3, Li Xiaojuan3, Liu Yueyun3, Zou Xiaojuan1, Ding Fengmin1, Yu Tao1, Chen Jiaxu1,3

(1HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430036,China; 2HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China; 3BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To study the relationship between the expression of specific P2X2 receptor of ATP and occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency, in order to lay the foundation for the study on relationship between the release phenomenon of ATP and occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency. Methods:A total of 48 C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups as normal group, model group, Xiaoyaosan group, and Fluoxetine group. All the mice, except the normal group, received multiple stresses for 21 days to establish the mice model of syndrome of liver depression and spleen deficiency. Immunohistochemical technique, Western blot, and qPCR were used to test the expression of protein and mRNA of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice. Results:Compared with the normal group, the expression of protein of P2X2 receptor of mice in model group decreased significantly (P<0.05), and the expression of mRNA of P2X2 receptor of mice in model group declined, although it was not significant (P>0.05). Compared with model group, the expression of protein of P2X2 receptor of mice in Xiaoyaosan and Fluoxetine groups increased significantly (P<0.05), and the expression of mRNA of P2X2 receptor of mice in Fluoxetine group also increased (P<0.05). Conclusion:Induced by multiple stresses, the expression of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice with syndrome of liver depression and spleen deficiency tends to be reduced, which might be an important reason of occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency.

P2X2 receptor; Syndrome of liver depression and spleen deficiency; Mice model; Prefrontal cortex

國家自然科學基金項目(編號：81630104；81473597)；北京市自然科學基金項目(編號：7152093)

陳家旭，男，教授，博士研究生導師，北京市朝陽區北三環東路11號北京中醫藥大學中醫學院中醫診斷系83號信箱，郵編：100029，Tel：(010)64286656，E-mail：chenjx@bucm.edu.cn

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.008