PAK1在幽門螺桿菌聯合MNNG誘導人食管上皮細胞分泌IL-8和GRO-α中的作用

郭雨松 李思瑤 陳艷*

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球最常見的消化系統惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康與生命。根據全球癌癥統計（global cancer statistics，GLOBOCAN）數據顯示，2020 年我國食管癌新發病例數為324,422例，死亡病例數為301,135 例，分別占全球食管癌新發病例和死亡病例的53.70%和55.35%［1］。亞硝胺類化合物具有極強的致癌作用，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）是一種具有較強誘變及致癌能力的人工合成化合物，常被用于化學致癌物誘變機理的研究［2］。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）已被證實與眾多消化系統疾病的發生密切相關，但其與食管癌的相關性研究甚少。近年來，炎癥與腫瘤之間的關系愈發成為研究熱點。本課題組前期通過Agilent Human LncRNA芯片檢測DNMT1 高表達食管上皮細胞和正常細胞株差異表達的LncRNA 和mRNA，結合生物信息學技術和共表達網絡分析發現LncRNA TUG1 的異常表達與幽門螺桿菌感染的上皮信號通路有關［3-4］，而PAK1（p21-activated protein kinase 1）為該信號通路的關鍵因子。CXCR2 是與PAK1 相關的趨化因子受體之一，可參與腫瘤細胞增殖、引起細胞運動及促血管生成［5］，其中最知名的配體是IL-8（CXCL8）和GRO-α（CXCL1）。本研究通過制備RNAi和過表達慢病毒并感染人食管上皮細胞構建PAK1 低、高表達HEEC 穩定細胞株，探討PAK1在HP 聯合MNNG 誘導人食管上皮細胞分泌趨化因子IL-8、GRO-α 中的作用，以期為食管癌的發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管上皮細胞系（HEEC）購自寶信生物公司（中國武漢），內參基因、目的基因引物由上海吉凱公司設計與合成，工具載體GV112、GV341 購自上海吉凱公司。幽門螺桿菌標準菌株（ATCC26695）來源于廣東省微生物菌種保藏中心，MNNG 分析純購自上海羅恩公司，PMI1640 培養基購自美國HyClone 公司，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液均購自美國Gibco 公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶公司，布氏肉湯購自杭州微生物試劑有限公司，甘油三酯購自廣東西隴科學試劑公司，RNAiso Plus、PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）和TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）均購自日本Takara 公司。GRO-α 及IL-8 ELISA 試劑盒購自欣博盛公司。

1.2 儀器 CO2恒溫孵育箱、生物安全柜和超低溫冰箱購自美國Thermo Scientific 公司，生物超凈臺購自上海天呈公司，低速自動平衡離心機購自北京京立公司，低溫離心機購自德國Eppendorf 公司，生物厭氧培養箱購自浙江義烏冷凍機總廠，紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司，PCR 儀（Mastercycler）和Realtime PCR 儀（RealpleX2）均購自德國Eppendorf 公司。

1.3 方法 （1）PAK1 低表達HEEC 穩定細胞株的構建：通過制備RNAi 慢病毒并感染HEEC 構建PAK1 低表達穩定細胞株（PAK1-KD）。引物由上海吉凱公司設計與合成、工具載體GV112 購自上海吉凱公司。具體步驟為設計目的基因干擾靶點→干擾靶點克隆構建至病毒載體上→測序確保靶點序列一致→質粒擴增、質檢→質粒轉染細胞包裝病毒→病毒收獲、濃縮、純化→病毒質檢、分裝→慢病毒預感染→病毒感染→目的基因的干擾效率檢測。引物序列見表1、2。（2）PAK1 高表達HEEC 穩定細胞株的構建：通過制備過表達慢病毒載體并感染HEEC 構建PAK1 高表達HEEC 穩定細胞株（PAK1-OE）。目的基因引物由上海吉凱公司設計與合成、工具載體GV341 購自上海吉凱公司。具體步驟為設計目的基因獲取→重組質粒構建至病毒載體上→測序確保序列一致→質粒擴增、質檢→質粒轉染細胞包裝病毒→病毒收獲、濃縮、純化→病毒質檢、分裝→慢病毒預感染→病毒感染→目的基因過表達效率檢測。目的基因引物序列見表3。（3）細胞染毒：PAK1-KD 和PAK1-OE 細胞分別分為HP+MNNG 聯合染毒組、HP 染毒組和MNNG 染毒組并設立空白對照組，共8 組。將PAK1-KD/ PAK1-OE 細胞接種于6 孔板中，當細胞鋪滿70%～80%瓶底面積時，按感染復數（MOI）=100 ∶1，即細菌∶細胞=100 ∶1 加入至細胞中進行共培養，加入MNNG 溶液至終濃度為IC50［6］進行染毒。（4）IL-8、GRO-α 含量的測定：各組細胞染毒3 h、6 h 和9 h 后棄去上清液，用PBS 清洗3 次，用含慶大霉素的無血清培養基培養48 h 后做支原體檢測，避免支原體污染，收集上清液，嚴格按ELISA 試劑盒說明書方法進行測定，每組設3 個復孔。

表1 PAK1 RNAi靶點

表2 PAK1 RNAi合成引物信息

表3 PAK1合成引物信息

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0 統計學軟件。計量資料進行正態性檢驗，均為正態分布，采用（±s）進行統計描述。兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。用Graphpad Prism 8 繪圖軟件繪圖。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HEEC PAK1 低、高表達穩定株的構建 經實時熒光定量PCR 驗證，與PAK1-NC 組相比，PAK1-KD 基因敲減效率達84.1%（t=14.627，P=0.004），PAK1-OE組PAK1 基因的表達豐度是PAK1-NC 組的1,101.646 倍（t=16.104，P=0.004），見表4，圖1。表明成功構建了PAK1 低、高表達人食管上皮細胞穩定株。2.2 PAK1 在HP 聯合MNNG 染毒促進細胞IL-8 分泌中的作用 PAK1-KD 與PAK1-OE 細胞染毒3 h、6 h和9 h 后，各染毒組細胞IL-8 含量隨染毒時間增加，經趨勢性檢驗線性趨勢顯著（PAK1-KD 細胞：F對照組=2.682，P=0.153；FMNNG=20.425，P=0.004；FHP=40.862，P=0.001；FHP+MNNG=25.181，P=0.002。PAK1-OE 細胞：F對照組=2.190，P=0.189；FMNNG=39.286，P=0.001；FHP=36.478，P=0.001；FHP+MNNG=193.692，P＜0.001）。相同染毒時間，各組細胞IL-8 含量差異有統計學意義（PAK1-KD 細胞：F3h=126.292，P＜0.001；F6h=281.997，P＜0.001；F9h=232.455，P＜0.001。PAK1-OE 細胞：F3h=486.373，P＜0.001；F6h=588.701，P＜0.001；F9h=378.793，P＜0.001），且均出現聯合染毒組＞HP 染毒組＞MNNG 染毒組＞對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。相同染毒時間，與PAK1-KD 相比，PAK1-OE 顯著促進聯合染毒組、HP 染毒組和MNNG 染毒組細胞分泌IL-8（聯合組：t3h=3.377，P=0.028；t6h=3.017，P=0.039；t9h=3.394，P=0.027；HP 染毒組：t3h=2.863，P=0.046；t6h=2.909，P=0.044；t9h=3.629，P=0.022；MNNG 染毒組：t3h=2.964，P=0.043；t6h=3.014，P=0.040；t9h=2.837，P=0.047）。對照組間無顯著差異（均P＞0.05）。見圖2。說明PAK1 高表達可以促進HP 聯合MNNG 誘導人食管上皮細胞分泌IL-8。

圖1 PAK1低、高表達HEEC穩定細胞株構建效率。注：與NC組比較，*P＜0.01

圖2 PAK1 對各處理組不同染毒時間細胞分泌IL-8 的影響。注：與對照組比較，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001；與HP+MNNG 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與HP 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

表4 慢病毒感染后PAK1基因相對表達量［（±s），2-ΔΔCt］

表4 慢病毒感染后PAK1基因相對表達量［（±s），2-ΔΔCt］

注：細胞標記說明：NC-空載體對照組、KD-低表達組、OE-高表達組

?

2.3 PAK1 在HP 聯合MNNG 染毒促進細胞分泌GRO-α 中的作用 PAK1-KD 與PAK1-OE 細胞染毒3 h、6 h 和9 h 后，各染毒組細胞GRO-α 含量均隨染毒時間增加，經趨勢性檢驗線性趨勢顯著（PAK1-KD細胞：F對照組=2.679，P=0.153；FMNNG=38.283，P=0.001；FHP=28.980，P=0.002 ；FHP+MNNG=121.938，P＜0.001。PAK1-OE 細胞：F對照組=0.597，P=0.469；FMNNG=58.925，P＜0.001 ；FHP=40.543，P=0.001 ；FHP+MNNG=246.745，P＜0.001）。相同染毒時間，各組細胞分泌GRO-α 含量差異有統計學意義（PAK1-KD 細胞：F3h=226.755，P＜0.001 ；F6h=835.844，P＜0.001 ；F9h=1182.142，P＜0.001。PAK1-OE 細胞：F3h=1523.939，P＜0.001；F6h=675.016，P＜0.001；F9h=1654.557，P＜0.001），且均出現聯合染毒組＞HP 染毒組＞MNNG 染毒組＞對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。相同染毒時間，與PAK1 低表達相比，PAK1 高表達顯著促進聯合染毒組、HP 染毒組和MNNG 染毒組細胞分泌GRO-α（聯合組：t3h=6.645，P=0.004；t6h=9.059，P=0.012；t9h=11.523，P＜0.001；HP 染毒組：t3h=3.014，P=0.039；t6h=4.034，P=0.016；t9h=3.519，P=0.024；MNNG 染毒組：t3h=3.308，P=0.030；t6h=3.091，P=0.037；t9h=4.063，P=0.015）。對照組間無顯著差異（均P＞0.05）。見圖3。說明PAK1 高表達可以促進HP 聯合MNNG 誘導人食管上皮細胞分泌GRO-α。

圖3 PAK1 對各處理組不同染毒時間細胞分泌GRO-α 的影響。注：各組與對照組比較，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001；各組與HP+MNNG 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；各組與HP 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

3 討論

食管癌是一種與炎癥相關的疾病，炎癥在食管癌的發生、發展中發揮重要作用。有研究表明亞硝胺類化合物是食管癌的重要致病因素，NF-κB 通路通常在MNNG 誘導食管炎中起關鍵作用［7］。此外，某些細菌產物如HP 亦具有促腫瘤作用，當機體受到細菌感染時會引起促炎介質釋放增加，進而改變趨化因子和細胞因子的表達，促進細胞生長與侵襲，導致腫瘤的發生［8］。已有研究表明HP 可導致慢性胃炎，并增加消化性潰瘍、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤（MALT）和胃癌的發病風險［9］，然而關于HP 與食管癌的相關性研究甚少，且結論也不一致。吉勝利等［10］研究HP 感染與食管鱗癌相關性時，發現在食管鱗癌患者組中HP 感染陽性率最高，明顯高于重度不典型增生患者組、輕-中度不典型增生患者組、慢性食管炎患者組和輕度不典型增生患者組，提示HP 感染可影響食管鱗癌的發生與發展。研究［11］表明HP 感染可提高食管癌細胞的增殖能力，導致細胞形態不規則及細胞間隙擴大，促進食管癌的發生、發展。PAK1 作為HP 感染上皮信號通路中的重要分子，其激活可引發下游IL-8、GRO-α 和其他中性粒細胞趨化因子的改變［12］，引起促炎反應及趨化效應，促使腫瘤的發生。TRAN 等［13］研究表明HP 可通過EGFR、MAPK 和JAK/STAT 信號通路誘導趨化因子GRO-α 和IL-8 的表達。IL-8 及其受體在腫瘤的發展過程中發揮了關鍵作用，IL-8 可與其受體CXCR1 及CXCR2 相互作用參與腫瘤細胞增殖［14］、促進血管生成及誘導炎癥反應等。范玉宏等［15］研究發現在食管鱗癌患者組織中GRO-α 及其受體CXCR2 的mRNA 和蛋白表達水平顯著高于正常組織，說明食管黏膜在發生癌變過程中，GRO-α 和CXCR2 參與啟動趨化過程來介導食管鱗癌的發生。作為癌癥發展過程中的重要趨化因子，IL-8 和GRO-α 可通過與CXCR2 受體相結合的方式，參與激活TAK1/NF-κB 信號傳導［16］，促進癌細胞的增殖和轉移。

PAK1 是一個潛在的癌基因，目前已在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、淋巴瘤及黑素瘤等中觀察到PAK1 基因和PAK1 蛋白的過度表達［17］，其在調節細胞周期、細胞運動、存活和細胞生長信號轉導、轉化方面發揮關鍵作用［18］。本研究發現，PAK1 高表達顯著促進了HP 聯合MNNG 誘導人食管上皮細胞分泌趨化因子IL-8 和GRO-α，有理由認為HP 聯合MNNG 可激活PAK1，引起下游炎癥趨化因子IL-8 和GRO-α 分泌增加，引發食管癌相關不良反應。

由于食管癌發生的復雜性，本研究采用短期染毒方法，僅在分子水平觀察到PAK1 對HP 聯合MNNG 誘導的趨化因子IL-8 和GRO-α 的調控作用，在以后的研究中，需增加更長染毒時間點或慢性染毒人食管上皮細胞，以深入探討PAK1 在HP 聯合MNNG 致食管癌發病中的作用機制。