低分子肝素制備方法研究進展

李美花

摘 要：低分子肝素由于吸收性好、安全性及生物利用率高等優點，而逐漸取代肝素應用于臨床。文章介紹了低分子肝素的基本概念，簡述了其發展過程，重點綜述了制備低分子肝素的化學降解法和酶解法，探討了其發展趨勢，為相關研究者提供參考。

關鍵詞：低分子肝素；LMWH；降解

低分子肝素（LMWH）是在普通肝素的基礎上發展的新一代肝素類抗凝血藥物，是使用合適方法將肝素分級或降解得到的具有較低分子量的肝素組分或片段。20世紀70年代中，在肝素研究史上取得了兩大突破：一是發現肝素中僅有30%～50%的組分可以結合ATⅢ發揮抗凝血活性，這改變了“肝素的每一個分子都有抗凝血活性”的老觀點；二是發現以往認為并無無活性的低分子肝素對Ⅱa因子有強的抑制作用[1]。20世紀70年代末，低分子肝素進入臨床使用。

低分子肝素的制備方法主要有物理制備法、化學降解法、酶解法和合成法。不同的制備方法可獲得不同分子量和生物活性的 LMWH，彼此不能代替使用。以下主要對化學降解法和酶解法進行綜述。

1 化學降解法

化學法是指利用化學反應獲取低分子量肝素的方法，使肝素糖環或糖苷鍵斷裂，從而，大分子的肝素降解成低分子量的肝素及相應寡糖，主要的方法有亞硝酸降解、β-消除降解法、過氧化氧降解法、光化學降解法。

1.1 亞硝酸降解法

這是最經常使用的一種方法。酸性條件下，肝素中游離的氨基與亞硝酸發生重氮化反應，斷裂在氨基葡萄糖的殘基部位，最終生成低分子量肝素和氮氣。此反應條件較溫和，并且這種方法在低分子肝素的末端引入了新的縮環的甘露糖殘基的還原基團。然而，亞硝酸降解法對N硫酸化的氨基葡萄糖殘基的保護作用不完全，又偏偏這些殘基是抗凝血酶III結合所必需的片段。反應過程中，通過控制亞硝酸的量，酸堿度，反應溫度和時間等，可控制生成的產物的分子量[2]。

1.2 β-消除降解法

β-消除降解法包括肝素季銨化、酯化和降解三個步驟[3]。在堿性條件下，肝素會發生β-消除反應，斷裂在艾杜糖醛酸殘基部位，從而生成低分子量肝素，但會引起多糖鏈結構的變化和多糖基上O-硫酸基團脫落，會喪失原有部分功能。酯化肝素中的糖醛酸可以增強α-H的酸度，非水相或水相介質條件下，肝素酯更容易與親和基團發生β-消除反應。肝素的鹵代芐基化合物和季銨鹽在DMF或二氯甲烷中能夠發生酯化反應，生成的酯在堿性條件下可以水解成LMWH。控制季銨鹽的種類堿性條件、季銨鹽的用量可以控制肝素的降解程度，從而獲得不同分子量分布的產物。

1.3 過氧化氫法降解法

過氧化物由于擁有不配對電子的氧自由基，因此化學反應性極高。該法關鍵是利用過氧化氫在銅離子催化下分解生成羥基自由基，在所生成的自由基攻擊下，糖鏈發生斷裂[4]。制備過程中，條件較溫和，溫度和pH均沒有顯著變化，肝素的活性中心不易被破壞，但是硫酸化程度較高，過程中銅離子等雜質的引入為后期的處理造成了困難。過氧化氫法也適用于其他糖胺聚糖的解聚，如刺參糖胺聚糖、硫酸皮膚素和硫酸軟骨素等。

1.4 光化學降解法

電噴霧傅立葉變換質譜和氫譜測試證明，光化學降解肝素是一個隨機的、可發生在Heparosan多糖中的N-乙酰胺殘基或葡糖醛酸的過程。Higashi等[5]利用TiO2催化下的光化學反應，將E. coli K5發酵生產的分子量大于15000 Heparosan成功降解至8000左右，解聚前后結構沒有發生變化的過程。進一步地，Higashi等[6]還成功使用過濾器-硼硅玻璃燈降解硫酸化多糖-肝素并顯著減少硫酸化基團的脫去。

2 酶解法

通過控制肝素酶的用量和種類、降解時間等一系列條件可得到不同分子量分布范圍的低分子肝素。酶解法選擇性較強，肝素降解后在末端產生在232nm處有特異的光吸收的不飽和的糖醛酸，該光吸收特征可以作為檢測信號；Heparnase-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是目前常用的三種肝素酶[7]。這三種酶的基因序列不同，降解肝素的位點也有所差異。使用多種肝素酶降解肝素或類肝素，可生成肝素寡糖或二糖等小片段，這有利于對肝素結構的分析。

3 總結與展望

酶解法反應條件溫和、選擇性高，但是成本較其他方法高，大規模工業生產還有待實現；光化學降解法能降低反應過程中硫酸基團的丟失，保持樣品的內部結構，從而更好的保持肝素的抗凝血活性。其他化學降解法容易由于硫酸基團丟失而影響產物的抗凝血活性。除了抗凝活性，LMWH的抗炎作用臨床使用并不成熟；此外，其還有調節細胞增殖、抗腫瘤、預防腹部術后粘連等作用[8]，但均有待成熟。未來對于LMWH抗凝以外的生物活性及其臨床應用是研究工作的主要方向。

參考文獻

[1]張利 .低分子量肝素藥物的質量標準綜述[J].科技傳播，2010，8（下）：91-92.

[2]張麗萍，李雷剛，馬中蘇.亞硝酸降解法制備低分子肝素的工藝參數優化與確定[J].藥物分析雜志，2009（7）：1148-1152.

[3]王 .一種超低分子肝素鋼的制備方法及其應用[P].中國專利：102952202，20130306.

[4]Robert J L， Pdnsg M S. Production and processing of low molecular weight heparins[J]. Semin Thmmb Hemost， 1999，25（3）：5-16.

[5]Higashi K，Ly M，Wang Z Y，et al. Controlled photochemical depolymerization of K5 heparosan，a bioengineered heparin precursor[J].Carbohydr Polym，2011，86（3）：1365-1370.

[6]Higashi K，Hosoyama S，Ohno A，et al. Photochemical preparation of a novel low molecular weight heparin[J]. Carbohydr Polym，2012，87（2）：1737-1743.

[7]Linhardt R J. Analysis of glycosaminoglycans with polysaccharidelyases[J]. Curr Protocols Mol Biol，1999，17（13B）：11-17.

[8]劉利.系列肝素藥物質量分析及控制研究[D].江蘇：蘇州大學，2014：1-48.