青海省251株結核分枝桿菌Spoligotyping基因型與4種一線藥物耐藥表型的研究

王兆芬，李 斌，蔣明霞，馬永成，汪海靜，申秀麗，姚雪瓊，李婷婷，陳 英，王新華

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青海省251株結核分枝桿菌Spoligotyping基因型與4種一線藥物耐藥表型的研究

王兆芬1，李 斌1，蔣明霞2，馬永成2，汪海靜1，申秀麗1，姚雪瓊1，李婷婷1，陳 英1，王新華1

目的 研究青海結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物耐藥狀況及與Spoligotyping基因型的關系，為結核病有效預防提供依據。方法 采用常規比例法對分離的251株結核分枝桿菌進行異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)等4種一線抗結核藥物的藥敏試驗，并對菌株進行Spoligotyping分型，對藥敏試驗和基因分型結果進行綜合分析。結果 251株結核分枝桿菌中，總耐藥率為56.2%；對INH、RFP、SM和EMB的耐藥率分別為43.0%(108/251)、37.1%(93/251)、39.0%(98/251)和27.9%(70/251)；耐多藥率為31.5%(79/251)。所有菌株經Spoligotyping分型，分為北京基因型185株(73.7%)與非北京型菌株66株 (26.3%)。未發現北京型與非北京型結核菌株與耐藥存在統計學關聯。結論 青海流行的結核分枝桿菌耐藥率及多耐藥率較高，Spoligotyping分型顯示北京基因型為主要流行型。

結核分枝桿菌；耐藥；寡核苷酸序列分型

結核病(Tuberculosis, TB)是目前全球最重要的公共衛生問題之一，耐多藥結核(Multidrug-resistant TB, MDR TB)的流行更是加劇了結核病對人群的威脅。據世界衛生組織(World Health Organization, WHO)2015年度報告，2014年世界上有960萬結核病新發病例，共有150萬人因結核死亡，19萬人死于耐多藥結核病；估計全球耐多藥患者48萬[1]。中國是結核病高負擔國家，2014年結核發病人數93萬，位居第3，耐多藥患者約5.2萬[1]。隨著分子生物學的發展，基因分型方法在結核分枝桿菌分型工作中的應用逐漸得到完善。DR區的寡核苷酸序列分型方法(Spacer Oligonucletide Typing, Spoligotyping)是以PCR為基礎的一種快速分型方法。本研究對青海省分離的251株結核菌進行了Spoligotyping分型及耐藥檢測，并進行了基因型與耐藥情況的分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定 251株結核分枝桿菌臨床分離株由青海省疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病實驗室提供，對照標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病實驗室提供。結核分枝桿菌的分離及鑒定根據《結核病診斷細菌學檢驗規程》進行，病原分離采用改良羅氏培養基，菌型鑒定使用鑒別培養基培養法，本實驗研究中251株菌均為結核分枝桿菌。

1.2 藥敏試驗 采用WHO/國際防癆和肺病聯合會(WHO/IUATLD)推薦的比例法[2]，分別對異煙肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampin, RFP)、鏈霉素(streptomycin, SM)和乙胺丁醇(ethambutol, EMB)等4種一線抗結核藥物進行藥敏試驗。

1.3 Spoligotyping分型 對本研究的251株結核分枝桿菌進行Spoligotyping分析，H37Rv為實驗陽性對照。參照的方法為國際標準的43個寡核苷酸位點的寡核苷酸雜交實驗技術[3]。

1.4 數據分析 將Spoligotyping實驗結果進行數字轉化，并與SpolDB 4.0數據庫[4]進行比對分析確定菌株的類型。通過藥敏試驗鑒定菌株耐藥情況，運用SPSS 20.0統計軟件進行檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 藥敏試驗 251株結核分枝桿菌分離株中，對1種或1種以上藥物耐藥者有141株，總耐藥率為56.2%，其中耐INH藥物的結核菌株有108株(43.0%)、耐RFP藥物的有93株(37.1%)、耐SM藥物的有98株(39.0%)、耐乙胺丁醇藥物的有70株(27.9%)，耐多藥菌株79株(31.5%)。

2.2 Spoligotyping分型 通過與SpolDB4.0數據庫進行比對分析，北京基因型有185株(73.7%)，MANU2型基因型有8株(3.2%)，U型基因型有9株(3.6%)，T1型基因型有3株(1.2%)，H4型基因型有1株(0.4%)，其他類型基因型45株(17.9%)。表1為251株結核分枝桿菌Spoligotyping分型結果。

表1 251株結核分枝桿菌Spoligotyping分型結果

Tab.1 Results of genotyping of 251M.tuberculosisisolates with spoligotyping

SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□■■■■□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□■□□□□□□□□□■□■■□□□□■■□□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□□■■■■■■■■■??NEW2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■1Beijing156(62．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□??like?Beijing16(6．4)表1(續)SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■190like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□??like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□■■■■□??like?Beijing3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■□■□??like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□■■□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□□□■■□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■□□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■□□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□□□□□??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■54MANU27(2．8)■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■583MANU21(0．4)■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■523U9(3．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■??NEW4(1．6)■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■53T13(1．2)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□■■■■■□■■■??NEW1(0．4)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□□□■■■■■■■127H41(0．4)■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■□□□□■■■■■■■???NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■□??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■■■■■■■■□■■■??NEW4(1．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■■■■■■■■■□■■■??NEW2(0．8)■□■■■■□■■■■□■■□□□■■□□□□■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)

2.3 不同基因型與耐藥相關分型 本研究未發現北京基因型及非北京型結核分枝桿菌與耐藥性之間存在關聯，見表2。

表2 不同基因型與耐藥相關分析

Tab.2 Correlation between genotypes and drug resistance

ResistancephenotypesNo．ofisolates251(%)GenotypesBeijing185(%)non?Beijing66(%)χ2POnlyresistanttoINH5(2．0)4(2．2)1(1．5)0．0001．000OnlyresistanttoRFP11(4．4)5(2．7)6(9．1)3．3360．068OnlyresistanttoSM13(9．6)9(4．9)4(6．1)0．0030．958OnlyresistanttoEMB4(1．6)4(2．2)0(0．0)1．4500．229MDR79(31．5)55(29．7)24(36．4)0．9930．319TotalResistance141(56．2)101(54．6)40(62．5)1．2100．271

Note：MDR is resistant to both isoniazid and rifampin.

3 討 論

北京基因型結核分枝桿菌是引起全球結核病流行的優勢菌株，占全球分離的結核分枝桿菌菌株的13%，在東亞地區更是達到50%以上[5]。此前有研究表明，我國北方地區北京基因型菌株所占比例高于南方地區[5]，這可能與北方地區的地理環境、氣候條件、人口構成等因素有關，同時也表明北京基因型菌株可能存在特殊的地域性。本研究251株結核分枝桿菌中，通過Spoligotyping方法進行基因分型，結果顯示，在青海省主要流行的結核菌株為北京型(73.7%)，這個結果與之前其他人所做結果一致[6-7]。

結核分枝桿菌耐藥性的產生機制復雜，可能與基因突變及菌體蛋白表達差異等有關[8-9]。耐藥結核病的流行，使結核病的防治面臨嚴峻挑戰，亞洲和非洲尤甚[1]。全國結核病耐藥性基線調查報告顯示：我國肺結核病患者中耐藥率為37.8%，耐多藥率為8.3%[10]。2015年世界衛生組織的全球結核病報告顯示，我國新發耐多藥結核病率為19%，復發耐多藥結核病率為54%[1]。

本研究實驗結果顯示：青海地區流行的結核菌株對一線4種抗結核藥物1種或1種以上藥物耐藥者有141株，總耐藥率為56.2%，遠高于抽樣調查的全國平均水平36.8%[11]。有研究認為北部省份耐藥率偏高，主要原因可能是北部省份經濟發展水平較南方差，氣候較為寒冷，居民室內活動時間較長，易于傳染等[12]。本研究發現青海地區251株結核分枝桿菌，耐INH藥物的結核菌株有108株(43.0%)、耐RFP藥物的有93株(37.1%)、耐SM 藥物的有98株(39.0%)、耐EMB藥物的有70株(27.9%)，這與米熱班·熱夏提等的研究結果一致[13]，但與車洋等人[14]的研究結果有差異，提示各地區結核耐藥情況有所區別。青海地區一線藥物耐多藥率高達31.5%(79/251)，遠高于一線抗結核藥物全國耐多藥率6.8%[11]。不同地區結核分枝桿菌的耐藥率有所不同，在治療結核病時，需要根據當地耐藥特征選擇適當的敏感藥物。青海高耐藥率與高耐多藥率的原因需要進一步研究。

由于北京型菌株在全球流行廣泛，有研究者報道北京型結核分枝桿菌與耐藥無關[15-17]，但也有研究發現此基因型菌株與耐藥性存在相關[18]。本研究結果顯示，青海地區北京型結核分枝桿菌與非北京型結核分枝桿菌的耐藥率差異不明顯，菌株分型與耐藥率之間無統計學關聯(P>0.05)。以后的研究中尚需要進一步觀察。

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Investigation on spoligotyping and phenotypes of drug resistance to four first-line drugs in 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai, China

WANG Zhao-fen1, LI Bin1, JIANG Ming-xia2, MA Yong-cheng2, WANG Hai-jing1, SHEN Xiu-li1, YAO Xue-qiong1, LI Ting-ting1, CHEN Ying1, WANG Xin-hua1

(1.PublicHealthDepartmentofMedicalSchool,QinghaiUniversity,Xining810001,China; 2.InstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,QinghaiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xining810007,China)

This study aims to learn drug resistance situation of four first-line anti-TB drugs among 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai and to explore their relationships with genotypes by Spoligotyping, so as to provide basis for effective prevention of tuberculosis. Isolates of 251M.tuberculosiswere tested susceptibilities of four first-line drugs including isoniazid (INH), rifampicin (RFP), streptomycin(SM) and ethambutol (EMB) by using conventional proportion method and genotyped by Spoligotyping. Relationship between drug resistance and genotypes was analyzed statistically. Results showed the total drug resistance rate was 56.2% (141/251) among 251M.tuberculosisisolates. Resistance rates of four first-line drugs were 43.0% (108/251) for INH, 37.1% (93/251) for RFP, 39.0% (98/251) for SM, 27.9% (70/251) for EMB respectively. Rate of multidrug-resistant TB (MDR TB) was 31.5% (79/251). All 251 isolates ofM.tuberculosiswere typed by spoligotyping. The 185 (73.7%) were Beijing genotypes and 66 (26.3%) were non-Beijing genotypes, and no statistical association was found with drug resistance. This paper concludes that isolates ofM.tuberculosisprevail in Qinghai have both high rates of drug resistance and MDR and dominant isolates are Beijing genotypes by spoligotyping.

Mycobacteriumtuberculosis; drug resistance; spoligotyping

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.008

國家自然科學基金(No.81660556)；青海省科技廳項目(No.2014-ZJ-910)聯合資助

1.青海大學醫學院公共衛生系，西寧 810001； 2.青海省疾病預防控制中心傳染病預防控制所，西寧 810007

Supported by the National Natural Science Foundation (No.81660556) and Qinghai Science and Technology Commission (No.2014-ZJ-910)

R378.9

A

1002-2694(2017)04-0332-05

2016-06-06 編輯：張智芳