不同地理種群白紋伊蚊線粒體基因COI的遺傳多樣性分析

張瑞玲，姚廣琴，潘曉倩，馬德珍，趙愛華，張 忠

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不同地理種群白紋伊蚊線粒體基因COI的遺傳多樣性分析

張瑞玲1,2，姚廣琴2，潘曉倩2，馬德珍3，趙愛華3，張 忠1,2

目的 探討白紋伊蚊不同地理種群間的進化關系和遺傳分化情況，為白紋伊蚊防制和蚊媒病防控提供基礎資料。方法 在廣泛采集樣品的基礎上，通過PCR擴增、測序獲取線粒體基因COI片段，并從GenBank下載了部分序列，比對、剪切后的598 bp用于后續分析。結果 系統發育分析的結果表明所有白紋伊蚊的COI序列聚成一支，沒有明顯的遺傳差異；60條COI序列分屬于19個單倍型，其中4個為共享單倍型；單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)為0.20%；海南的白紋伊蚊種群與絕大部分地理種群間出現了明顯的分化(P<0.05)；H1和H6形成了2個輻射中心，是較為原始的單倍型。結論 我國的白紋伊蚊種群正處于擴張的趨勢，海南的白紋伊蚊種群與其它地理種群間出現了明顯分化。

白紋伊蚊；地理隔離；瓶頸效應；蚊媒病

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)又稱“亞洲虎蚊”，隸屬于雙翅目，蚊科，伊蚊屬，是中國常見蚊種之一。白紋伊蚊是登革熱、黃熱病、基孔肯雅熱、西尼羅熱等多種病毒的重要傳播媒介。近些年來，蚊媒病在全球的流行呈現明顯增加的趨勢，其中許多是傳播力強、流行面廣、發病率高、危害性大的疾病，已經成為世界性的公共衛生問題[1]。當前，由于登革熱等蚊媒病尚無特效藥物和疫苗，對傳播媒介白紋伊蚊的防制是預防和控制蚊媒病疫情的主要手段。

蚊蟲傳播病原體的能力受其遺傳因素的影響，研究證據表明地理來源不同的白紋伊蚊種群和個體對登革熱病毒的易感性和傳播能力有所不同[2-3]。因此，不同白紋伊蚊種群遺傳背景的深入了解將對蚊媒病的防控具有重要的意義。在長期的進化過程中，受到環境選擇壓力、突變、遺傳漂變等因素的影響，不同地理種群的蚊蟲間在基因交流、遺傳多樣性方面都會出現變化。利用分子生物學的方法，結合生態、分布格局、種群動態和遺傳多樣性等多個方面的資料，探討白紋伊蚊不同地理種群間的分化，不僅有助于闡明不同地理種群間的遺傳結構和擴散動態，還可以了解它們傳播疾病能力之間的差異，是用于制定合理高效防控措施的可靠理論依據[4]。

我國研究人員已開展了大量相關研究，但多局限于某一地區種群遺傳結構的探討[5-7]。本文基于前期在全國范圍內廣泛采樣的基礎上，利用線粒體基因COI(Cytochrome C Oxidase Subunit I)初步分析了我國不同地區白紋伊蚊的遺傳結構和系統發育關系，以期為蚊媒病有效防治策略的制定提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品 本研究所用樣品的采集信息見表1。所有標本浸泡于95%無水乙醇中于-20 ℃保存備用。基于形態學特征對采集樣本進行物種鑒定。

1.2 DNA 提取、基因擴增及測序 取單頭個體，使用組織/細胞 DNA 快速提取試劑盒(北京全式金生物技術)，按說明書步驟進行提取，提取到的DNA于-20 ℃條件下保存備用。PCR上游引物為LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；下游引物為HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。擴增體系為30 μL，其中DNA模板2 μL；TaqDNA聚合酶0.4 μL；正反向引物各0.6 μL；10 × buffer，3 μL；dNTPs，2.4 μL；ddH2O，21 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，45 ℃復性50 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

擴增反應結束后，取3 μL PCR產物于瓊脂糖凝膠(2%)上，置于電泳槽中電泳(120 V，30 min)檢測，電泳緩沖液為1×TAE。同時，電泳過程中選用DNA Marker 進行目的基因長度的確認，PCR產物經電泳檢測后，送北京六合華大基因科技有限公司進行純化和測序。

1.3 數據分析 所得雙向測序結果利用DNAStar 7.1(DNASTAR, Inc. 1996)軟件包中的Seqman程序進行序列拼接和編輯，確定序列的方向，然后將這些序列在NCBI中進行BLAST同源性比對，以確保所得到的是目標序列。序列在MEGA 5.0軟件[4]中進行編輯和比對，包括：1)位點的手工篩查和糾正；2)將DNA序列翻譯成相應的氨基酸序列，以檢查序列內是否有終止密碼子的存在；3)堿基組成分析，變異位點、簡約信息位點及保守位點的計算。

系統發育分析選用三帶喙庫蚊(Culextritaeniorhynchus)(GenBank登錄號：KJ012246、KJ768093、KT358420)作為外群。采用 PAUP*4.0[8]構建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)。用DnaSP 5.0[9]計算單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)。使用Arlequin 3.5[10]估算種群間的分化系數Fst(F-statistics)。使用Network 4.6.1.3軟件[11]基于Median-joining方法構建了單倍型的網絡關系圖。

2 結 果

2.1 遺傳多樣性和系統發育分析 本研究測得以及GenBank下載獲得的白紋伊蚊COI序列共計60條，比對處理后用于后續分析的序列長度為598 bp，無插入和缺失突變。共檢測到579個保守位點和19個可變信息位點，利用DnaSP分析共定義19個單倍型，其中有4個共享單倍型(shared haplotype)，15個私有單倍型(singletons)(表1)。該物種的單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)為0.20%。不同地理種群單倍型多樣性差異明顯，其中四川(Hd=0.504，π=0.08%)、廣西(Hd=1.000，π=0.25%)、廣東(Hd=0.454，π=0.11%)、臺灣(Hd=1.000，π=0.33%)和北京(Hd=0.833，π=0.26%)，山東、浙江和海南的種群多樣性較低。

表1 白紋伊蚊樣品信息和單倍型分布

*：數字表示用于分析的序列總數，括號內表示自NCBI下載序列的序列號

**：下劃線標示共享單倍型

*：Arabic numeral represents total sequences used for analysis, and accession number of downloaded sequences was showed in bracket

**：Shared haplotype was marked with underline

以三帶喙庫蚊為外群，構建的ML樹顯示所有白紋伊蚊的COI序列聚成一支，支持率為100%，表明不同地理種群間沒有明顯的分化(圖1)。

2.2 種群遺傳結構分析和單倍型網絡圖 種群分化系數(Fst)常用來表示種群間的分化程度，Fst接近于0時，說明種群間沒有發生遺傳分化。根據種群間兩兩比對的結果可以看出(表2)，山東、四川、廣西、廣東、浙江和臺灣的白紋伊蚊種群間沒有明顯的分化(P>0.1)；北京和四川、廣東之間的分化系數分別為0.307和0.395，但分化有統計學意義(P<0.05)。海南的白紋伊蚊種群與其他7個種群間的分化系數介于0.593～1.000之間，且除與臺灣種群的分化無統計學意義，與其他6個種群間的分化有統計學意義(P<0.05)。

表2 基于COI序列的白紋伊蚊地理種群間遺傳分化系數(Fst)

*：P< 0.05

圖1 基于線粒體基因COI構建的ML樹Fig.1 Maximum likelihood tree constructed based on mitochondrial gene COI

從單倍型網絡圖中可以看出，單倍型H1和H6處于中間的位置，形成2個輻射中心，是比較原始的單倍型(圖2)。H1是分布最廣的單倍型，包括了山東、陜西、四川、云南、廣西、廣東、湖南、浙江、江蘇和北京的樣品，并輻射進化出12個單倍型，說明H1是較為古老的單倍型。北京和廣西的部分樣品組成了以H6為原始單倍型的星狀網絡圖。

3 討 論

白紋伊蚊具有擴散能力強、環境可塑性高等特點，且與人類關系密切，分布區易于受到人為因素的影響，攜帶有蚊卵和幼蟲的廢舊輪胎及金屬容器等是其向潛在適生區擴散的常見方式。頻繁的貨物運輸和人員往來促進了白紋伊蚊的擴散和流動，所以不同地理種群的白紋伊蚊樣品在系統進化樹上聚成一支(圖1)。該物種的單倍型多樣性(Hd)為0.737，核苷酸多樣性(π)僅為0.20%，較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性表明不同地理種群可能經歷過“瓶頸效應”，之后伴隨著種群快速增長的歷史事件，但擴張歷史較短，核苷酸變異積累不充分[12]。基于Median-joining方法構建的單倍型網絡關系圖出現了兩個輻射進化中心，均呈星狀分布。其中分布最廣的H1是最原始的單倍型，輻射進化出多個單倍型；H6可能是由H1分化而來，又逐漸分化出北京和廣西地理種群的私有單倍型。“星狀系統發育關系(star phylogeny)”也支持了我國白紋伊蚊不同地理種群是經歷“種群瓶頸”后開始擴張的種群[13]。

Each cycle represent a haplotype, the area of the circle is proportional to the frequency of haplotype. Different geographical populations were shown in different colors.圖2 基于線粒體COI構建的Median-joining單倍型網絡關系圖Fig.2 Median-joining haplotype network construction based on mitochondrial gene COI

不同地理種群間的分化系數Fst值也有明顯的差異，大部分種群間的分化不明顯，但海南種群與其它地理種群間的Fst值均較大，且達到顯著水平，其中海南種群和浙江種群間的Fst值為1.0，表明是這兩個種群達到了完全的隔離分化。這可能是與海南島與其它地區的地理隔離有關系，白紋伊蚊的主動擴散能力弱，島嶼的地理隔離導致基因交流受阻，部分地理種群間出現了遺傳分化。此外，這也可能是與本研究所涵蓋的地理群體和研究樣品較少有關，上述研究結果并不排除在其它未取樣地區存在不同或與現有結果不一致的現象。增大樣本量和種群覆蓋面，研究結果可能將會更加客觀。

隨著全球氣候變暖，生態環境和生物群落都隨之發生改變，白紋伊蚊的密度及其地理分布也在發生變化。目前全世界都面臨著蟲媒病的重大威脅，其中相當一部分屬于蚊媒病。近幾年登革熱疫情持續加重，給社會和經濟發展帶來沉重負擔。但持續擴張中的白紋伊蚊種群間分化水平很低，頻繁的基因流是保持種群間不出現分化的重要因素，同時基因流也使得不同地理種群白紋伊蚊具有相似的帶毒能力，因此蚊媒病的防控任務仍很艱巨。

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Zhang Zhong, Email：zhangz@tsmc.edu.cn

Genetic diversities of different geographical populations ofAedesalbopictusbased on mitochondrial gene COI

ZHANG Rui-ling1,2, YAO Guang-qin2, PAN Xiao-qian2, MA De-zhen3, ZHAO Ai-hua3, ZHANG Zhong1,2

(1.CollaborativeInnovationCenterfortheOriginandControlofEmergingInfectiousDiseases,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 2.DepartmentofPathogenicBiology,Tai’anMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 3.TaianMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000,China)

In order to figure out phylogenetic relationship and genetic diversity of different geographical populations, genetic analyses ofAedesalbopictuswere performed based on mitochondrial gene COI. Based on samples collected from most distribution regions in China, mitochondrial gene Cytochrome C Oxidase Subunit I was obtained through PCR and DNA sequence. Together with some COI sequences downloaded from GenBank, 60 COI sequences with the final length of 598 bp were used for subsequent analyses. Results showed that there was no obvious divergence according to phylogenetic analyse, all sequences were clustered together in Maximum Likelihood tree. Sixteen haplotypes were detected, and four of them shared haplotypes. Haplotype diversity (Hd) was 0.737, nucleotide diversity (π) was 0.20%. Population genetic differentiation analyses demonstrated that Hainan population showed obvious divergences. In the network of haplotypes, H1 and H6 was found to be the primary haplotypes, and they formed two radical centers. All these results indicate thatA.albopictuspopulations of China are expanding presently, and Hainan population become differential with other geographical populations, which probably attribute to geographical isolations.

Aedesalbopictus; geographical isolation; bottleneck effect; mosquito-borne disease

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.005

國家自然科學基金(Nos.81401693&81572028)和大學生創新創業訓練計劃(No.201510439010)聯合資助

張 忠，Email：zhangz@tsmc.edu.cn

1.泰山醫學院新發傳染病溯源及防控協同創新中心，泰安 271016； 2.泰山醫學院基礎醫學院，泰安 271016； 3.泰安市疾病預防控制中心，泰安 271000

Supported by the Natural Science Foundation of China (Nos. 81401693 & 81572028) and the Student’s Platform for Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201510439010)

R384.1

A

1002-2694(2017)04-0316-05

2016-08-02 編輯：劉岱偉