新疆中哈邊境地區分離到遠東型和西伯利亞型蜱傳腦炎病毒

張桂林，孫 響，劉 然，鄭 重，劉曉明，伊小平

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新疆中哈邊境地區分離到遠東型和西伯利亞型蜱傳腦炎病毒

張桂林1，孫 響1，劉 然1，鄭 重1，劉曉明1，伊小平2

目的 研究新疆中哈邊境阿拉套山夏爾西里自然保護區蜱傳腦炎疫源地病原的基因型及生物學特征。方法 采用布旗法采集蜱，活蜱保存或液氮凍存；采用BALB/c小鼠與BHK-21細胞進行蜱傳腦炎病毒分離培養；采用RT-PCR擴增蜱傳腦炎病毒遠東型FE和西伯利亞型S特異基因片段并測定其序列。結果 從新疆中哈邊境阿拉套山夏爾西里自然保護區全溝硬蜱和森林革蜱中分離出16株蜱傳腦炎病毒株，通過對擴增基因序列比對分析，明確其中13株為遠東型，3株為西伯利亞型。結論 從新疆中哈邊境阿拉套山夏爾西里自然保護區分離到遠東型和西伯利亞型蜱傳腦炎病毒，該地區為兩種亞型病毒共存的蜱傳腦炎自然疫源地。

蜱傳腦炎病毒；遠東型；西伯利亞型；疫源地；中哈邊境

蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)屬于黃病毒科(Flavivirdae)黃病毒屬(Flavivirus)，能導致人急性腦炎癥狀，并引起較為嚴重的后遺癥。蜱傳腦炎(Tick-borne encephalitis, TBE)是一種人獸共患病，主要由媒介蜱叮咬傳播，分布地區與媒介全溝硬蜱、蓖籽硬蜱棲息生境密切相關。在世界上蜱傳腦炎流行地區橫跨歐洲、俄羅斯、中國、蒙古以及日本[1]。在中國蜱傳腦炎疫源地主要分布在與俄羅斯、蒙古等蜱傳腦炎流行國家接壤的地區，包括東北地區的長白山與大小興安嶺林區以及新疆天山北坡和阿爾泰山南坡林區[2-3]。根據基因序列和血清型的不同，蜱傳腦炎病毒分為3個亞型，遠東亞型(Far Eastern)、西伯利亞亞型(Siberian)和歐洲亞型(European)，不同病毒亞型毒力不同，引起的臨床癥狀及疾病的后果也不相同。遠東亞型能導致非常嚴重的中樞神經系統疾病，如腦炎、腦膜炎能引起人的意識喪失，并對大腦和脊髓造成損害，恢復緩慢，留下嚴重的后遺癥，致死率為5%～20%；西伯利亞亞型引起的急性癥狀較輕，很少造成癱瘓，但能形成慢性腦炎，致死率6%～8%；歐洲亞型引起的腦炎癥狀溫和，致死率也較低，為0.5%～2%[4-5]。我國發現的蜱傳腦炎病毒流行株均為遠東亞型[6]。

夏爾希里自然保護區(東經81°43′～82°18′，北緯45°07′～45°23′)位于新疆北部中哈邊境，地處阿拉套山南坡，屬于博爾塔拉蒙古自治州博樂市。2011年該保護區發現2例蜱傳腦炎疑似病例，后被確診，且血清學調查發現當地人群蜱傳腦炎感染率較高。2012年從該地區全溝硬蜱、森林革蜱中分離出13株遠東亞型蜱傳腦炎病毒，證實阿拉套山南坡夏爾西里自然保護區存在蜱傳腦炎疫源地[7]。2014年再次從夏爾西里自然保護區全溝硬蜱中分離出3株西伯利亞亞型蜱傳腦炎病毒，表明中哈邊境夏爾西里自然保護區同時存在遠東亞型和西伯利亞亞型蜱傳腦炎病毒，是兩種亞型病毒共存的蜱傳腦炎自然疫源地。

1 材料與方法

1.1 標本來源 分別在2012年5月和2014年6月，采用布旗法和家畜體表撿法采集蜱，活蜱保存或在液氮中凍存。全溝硬蜱采集于阿拉套山南坡海拔1 400—1 800 m的針闊葉混交林林間灌叢，森林革蜱采集于海拔1 400—1 800 m陽坡草地。

1.2 主要試劑及實驗動物 PureLinkTM RNA提取試劑盒購自Thermo Fisher公司，一步法RT-PCR 試劑盒購自Invitrogen公司，DL2000Marker購自Tiangen公司。BALB/c小鼠，SPF級，6～8周，♂，體重18～22 g,購自新疆醫科大學實驗動物中心。

1.3 引物設計及合成 蜱傳腦炎遠東型FE特異引物5′-TGG AGC TYG ACA AGA CCT CA-3′與 5′-TCC CAC YAG GAT CTT GGG CAA-3′,片段長度為785 bp；蜱傳腦炎西伯利亞型S特異引物5′-GKG GAT GTG TCA CGA TCA CT-3′與5′-GCY GTY GGA AGG TGT TCC AGA-3′，片段長度為553 bp[8]。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 病毒分離 將活蜱或凍存的蜱分類后分組,饑餓蜱50～60只/組，飽血蜱10～20只/組，經70%乙醇和滅菌PBS消毒后研磨，加入1 000 IU/mL青霉素和鏈霉素雙抗，5 000 r/min離心，取上清。將蜱懸液上清按0.5 mL/只劑量腹腔接種6～8周的BALB/c小鼠，每組接種2—3只。接種后每日觀察小鼠發病情況，連續觀察28 d，發病頻死的小鼠無菌解剖取腦組織連續傳代，至第3代取發病癥狀穩定的小鼠腦組織研磨，離心，取上清接種BHK-21細胞，37 ℃ 5%CO2條件下培養，往復盲傳3代后觀察細胞病變現象。

1.5 病毒基因序列分析和鑒定

1.5.1 RNA提取及PCR擴增 取第3代發病小鼠腦組織研磨液和病變細胞培養上清液提取病毒RNA，按照RNA提取試劑盒說明書操作，提取物溶于40 μL DEPC處理的去離子水，置于-70 ℃冷藏備用。按照一步法RT-PCR試劑盒說明書操作，擴增體系為25 μL，其中包括5 μL RNA 提取物，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。擴增條件：50 ℃反轉錄30 min；92 ℃熱變性3 min；4輪熱循環中，每輪循環92 ℃熱變性10 s，52 ℃退火30 s，68 ℃擴增1 min；之后35 輪熱循環中，每輪循環92 ℃熱變性10 s，58 ℃退火20 s，68 ℃擴增20 s，最后68 ℃延伸3 min。取5 μL擴增產物進行1%(m/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性擴增產物交上海生工生物工程公司測序。

1.5.2 基因序列分析 利用DNAstar 7.0 SeqMan 程序，將擴增序列與GenBank其它蜱傳腦炎病毒序列進行比對，分析分離株的序列特征。

2 結 果

2.1 病毒分離 于2012年5月和2014年6月，在夏爾西里自然保護區山地森林草甸生境中采集成蜱1 971只，其中全溝硬蜱(Ixodespersulcatus)1 740只，占數量組成的88.29%,森林革蜱(Dermacentorsilvarum)220只，占數量組成的11.16%,邊緣革蜱(Dermacentormarginatus)6只，占組成的0.30%，和嗜群血蜱(Haemaphysalisconcinna)5只，占組成的0.25%。按照不同種類和雌雄分組，共24組蜱接種BALB/c小鼠分離病原，其中全溝硬蜱21組，森林革蜱2組，嗜群血蜱1組。接種后16組小鼠發病，其中全溝硬蜱14組，森林革蜱2組。發病小鼠腦組織連續傳至3代。發病小鼠可出現蜷縮、毛聳、食欲減退，并能導致神經癥狀和死亡。西伯利亞亞型能導致小鼠四肢麻痹，失去運動能力；遠東型能導致小鼠后肢或一側肢體麻痹。將第3代發病小鼠腦組織研磨上清液接種BHK-21細胞并盲傳3代，細胞出現圓縮、脫落病變現象。對發病小鼠腦組織和細胞培養物進行蜱傳腦炎病毒遠東型FE和西伯利亞型S基因PCR擴增，發現13組為遠東型，3組為西伯利亞型(表1)。

表1 2012—2014年中哈邊境夏爾西里自然保護區蜱傳腦炎病毒分離結果

Tab.1 Tick-borne encephalitis virus isolated from Charles Hilary in 2012 and 2014

病毒分離時間Isolationtime標本來源Source接種組數No．ofinoculation陽性組數及編號Positivenumber蜱傳腦炎基因型Genetype2012年全溝硬蜱(♀)86(01A，04A，05A，06A，07A，08A)遠東型全溝硬蜱(♂)75(09A，11A，12A，13A，14A)遠東型森林革蜱(♀/♂)22(16A，17A)遠東型2014年全溝硬蜱(♀)43(X3，X4，X5)西伯利亞型全溝硬蜱(♂)20嗜群血蜱(♀)10

2.2 病毒基因序列分析 用蜱懸液接種BALB/c小鼠，有16組小鼠發病。對16組第3代發病小鼠腦組織RNA提取物和16組BHK細胞病毒培養物RNA提取物進行遠東型FE基因和西伯利亞型S基因PCR擴增，并進行序列比對分析，表明分離株01A、04A、05A、06A、07A、08A、09A、11A、12A、13A、14A、16A、17A為同一序列, 為蜱傳腦炎病毒遠東亞型，與我國東北分離毒株MDJ-02株、森張株核苷酸序列同源性為99.5%，氨基酸序列同源性99.8%，與俄羅斯境內Svetlogrie 株、Karalerovo 株序列同源性達到98%。X4，X5，X6序列相同，為蜱傳腦炎病毒西伯利亞亞型，與俄羅斯西伯利亞南部地區檢出的Kemerovo-49-08西伯利亞亞型毒株核苷酸97.8%、氨基酸98%。電泳結果見圖1。

M: DNA Marker (DL2000)；1: Negative control; 2: XJ-03A Negative result of Sib; 3: XJ-X5 Positive result of Sib; 4: XJ-X5 Negative result of FE ; 5: XJ-03A Positive result of FE; 6: XJ-03A Positive result of Flavivirus; 7: XJ-X 5 Positive result of Flavivirus圖1 蜱傳腦炎病毒遠東型和西伯利亞型擴增結果Fig.1 RT-PCR product of Far-Eastern and Siberian subtypes of TBEV

3 討 論

蜱傳腦炎病毒3種亞型分布地區及傳播媒介不同。歐洲亞型分布在中歐、東歐和北歐，傳播媒介為蓖籽硬蜱(Ixodesricinus)，遠東亞型主要分布在俄羅斯遠東和西伯利亞地區、中國北部、蒙古、日本以及巴爾干半島國家，傳播媒介為全溝硬蜱，西伯利亞亞型分布在俄羅斯西伯利亞地區、蒙古、芬蘭、愛沙尼亞、拉脫維亞等國家，傳播媒介也為全溝硬蜱，俄羅斯、愛沙尼亞、芬蘭、拉脫維亞、蒙古等存在2種或3種亞型[9-11]。本研究從新疆中哈邊境夏爾西里自然保護區全溝硬蜱和森林革蜱中分離出16株蜱傳腦炎病毒，其中13株為遠東亞型，3株為西伯利亞亞型。這是我國首次分離出西伯利亞亞型毒株，表明我國蜱傳腦炎病毒也存在遠東和西伯利亞2種亞型。全溝硬蜱為遠東亞型和西伯利亞亞型的主要傳播媒介，但是不同地區2種亞型在全溝硬蜱中的自然感染率不同，疫源地流行優勢株也就不同。基于對E蛋白基因的PCR檢測，俄羅斯遠東地區全溝硬蜱遠東亞型占70%，西伯利亞亞型占30%，在俄羅斯中部分離出的蜱傳腦炎病毒株90%為西伯利亞亞型，10%為遠東亞型，并且從蜱中檢測到歐洲亞型，在俄羅斯西部西伯利亞亞型所占的比例繼續上升，而遠東亞型和歐洲亞型的比例下降[5]。本研究在夏爾西里自然保護區分離的蜱傳腦炎病毒株中遠東亞型占81.25%(13/16)，西伯利亞亞型占18.75%(3/16)，提示該疫源地以遠東亞型為優勢流行株。本研究從夏爾西里自然保護區同時分離出遠東亞型和西伯利亞亞型，表明該地區蜱傳腦炎疫源地存在蜱傳腦炎病毒的兩種亞型自然循環。在愛沙尼亞西部Laanemaa地區從鼠中分離到蜱傳腦炎遠東亞型，而在當地病人血樣本中分離出歐洲亞型，表明在同一疫源地中存在著遠東和歐洲兩種亞型[12]。而本研究結果也進一步證實在同一塊蜱傳腦炎自然疫源地可同時存在兩種亞型蜱傳腦炎病毒。

不同蜱傳腦炎亞型毒力和致病性不同，并且不同來源亞型分離株致病性也有明顯不同。從俄羅斯遠東和西伯利亞地區分離的Vasilchenko和Latvia-1-96西伯利亞亞型分離株致病性比遠東亞型弱，但從西伯利亞Irkutsk地區分離的Irkutsk西伯利亞亞型分離株致病性比遠東亞型毒力更強，西伯利亞亞型分離株(IR99-2f13和IR99-2f7)接種小鼠后存活率0%～10%，遠東亞型(VL99-m11，D1283，KH98-5)接種小鼠后的存活率20%～50%，并且西伯利亞亞型分離株死亡的時間比遠東亞型提前2-5 d[13]。在小鼠模型中，蒙古西伯利亞亞型分離株MGL-Selenge-13-14 毒力明顯比分離株MGL-Selenge-13-12以及俄羅斯分離株IR99-2f7弱，并且由于毒力不同造成小鼠不同的臨床癥狀[14]。本研究同時發現西伯利亞亞型與遠東亞型所導致的小鼠神經癥狀不同，西伯利亞亞型可導致小鼠四肢麻痹失去運動能力，而遠東亞型可導致小鼠后肢或一側肢體麻痹。不同亞型病毒的毒力和致病性的差異也可能與所用的動物模型不同有關。

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Isolation of tick-borne encephalitis virus Far-eastern subtype and Siberian subtype in the China-Kazakhstan border area in Xinjiang

ZHANG Gui-lin1, SUN Xiang1, LIU Ran1, ZHENG Zhong1, LIU Xiao-ming1, Yin Xiao-ping2

(1.CenterforDiseaseControlandPreventionofXinjiangMilitaryCommandRegion,Urumuqi830011,China; 2.AlashankouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Bole833418,China)

To investigate the genotype and the biological characteristics of Tick-borne encephalitis virus (TBEV) in Charles Hilary endemic foci in the China-Kazakhstan border area in Xinjiang, ticks were collected by flagging during May to June in 2012 and 2014, and were stored in liquid nitrogen. TBEV strains were isolated from tick samples by inoculating BALB/c mice and BHK-21 cells. The FE gene fragments of TBEV-Far and the S gene fragments of TBEV-Sib were detected by RT-PCR from infected mice brain tissue and BHK cells, and then subjected to sequence alignment. Totally 16 TBEV strains were isolated fromIxodespersulcatusandDermuceutersilvarum, among 13 strains were Far eastern subtype, three strains were Siberian subtype. It was first time that the TBEV-Sib was isolated in China. The Charles Hilary TBE natural foci were in the China-Kazakhstan border area, and both TBEV-Far and TBEV-Sib co-circulated.

Tick-borne encephalitis virus; TBEV-Far; TBEV-Sib; endemic foci; the border areas near Kazakhstan

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.004

國家自然科學基金項目(No.U1303104)

1.新疆軍區疾病預防控制中心，烏魯木齊 830011； 2.阿拉山口出入境檢驗檢疫局，博樂 833418 Email: xjglzhang@126.com

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. U1303104)

R373.3

A

1002-2694(2017)04-0312-04

2016-04-27 編輯：梁小潔