木質素對靈芝菌絲體生長的影響

裴海生，孫君社，王民敬，尹 騰，張秀清

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木質素對靈芝菌絲體生長的影響

裴海生1,2，孫君社2，王民敬2，尹 騰1，張秀清1※

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部規劃設計研究院，北京 100125）

為了解添加外源木質素對靈芝菌絲體生長的影響，該研究通過在靈芝培養基中添加纖維素、半纖維素和木質素，考察了外源添加木質纖維素主要組分對靈芝菌體生長的影響，發現木質素添加明顯促進靈芝菌絲體生長；進一步考察添加不同濃度木質素靈芝菌絲體生長情況以及靈芝產多糖、三萜變化規律。結果表明少量添加木質素對靈芝菌絲體生長有明顯促進作用，木質素加量為1.0%時，靈芝菌絲體生長情況最好，生物量比對照提高了56%，同時靈芝胞外多糖、胞內多糖及靈芝胞外三萜、胞內三萜的合成均有明顯提高，其中胞內多糖提高43%；4種靈芝菌株發酵產多糖、三萜結果對比分析表明1.0%木質素添加均能提高不同菌株發酵多糖、三萜含量，木質素作為營養基質在不同靈芝菌株培養過程中添加均能促進菌絲體活性物質合成。研究結果可為靈芝菌生長代謝研究及人工栽培提供科學依據和參考。

木質素；多糖；生物量；三萜；靈芝菌；液體發酵

0 引 言

靈芝（）是中國重要傳統中藥材，靈芝中含有多糖、三萜類化合物、核苷類、生物堿類和甾醇類等多種生物活性成分。其中靈芝多糖是最有效活性成分之一，是由肽多糖、葡萄糖、雜多糖等多糖均一體組成的混合物，目前已分離到的靈芝多糖有200多種，研究報道靈芝多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抑菌等生理活性[1-7]。三萜類化合物是靈芝的另一種重要化學成分，同樣具有具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節、抑菌等生理活性[8-10]。

現在靈芝的主要來源是人工段木栽培和袋料栽培。段木栽培需大量的木材，且對樹木的種類、年份要求較高，對林業和生態環境造成挑戰[11-12]。靈芝的菌絲體培養不僅是基礎研究的重要手段，也是生物活性物質生產的一種方式[13-14]。靈芝深層發酵的目標產物主要有靈芝多糖(胞外多糖、胞內多糖)、靈芝三萜(胞內三萜、胞外三萜)，至今為止已有大量關于以生物量和胞外多糖為目標產物的研究報道[15-20]。Tang等[21]比較了蔗糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖4種碳源對靈芝發酵過程中產靈芝胞內、胞外多糖和靈芝酸的影響，結果表明乳糖對靈芝菌絲的生長和靈芝酸及胞內多糖的產生有利，但高濃度的乳糖對靈芝酸的累積有抑制作用；蔗糖做碳源有利于靈芝胞外多糖的產生，但生物量較低。趙小瑞等[22]采用振蕩-靜置兩段培養法，研究了以當歸、黨參、甘草、黃芪4種甘肅道地藥材提取物作為誘導子對靈芝液態發酵過程中細胞生長及產靈芝三萜的影響，結果表明4種中草藥提取物是有效的誘導子，可促進靈芝發酵三萜產量提高。通過對菌絲體發酵培養基及發酵條件優化，菌絲體生物量、多糖及三萜均能達到較高水平，但是關于在培養基中添加木質素、纖維素和半纖維素三組分來促進菌絲體生長的研究未見報道。

靈芝栽種時常以木質素含量較高的木材為主[23]，且靈芝生長過程中主要降解基質中的木質素，鑒于此，本研究在優化靈芝液體發酵培養條件的基礎上，額外添加木質纖維素主要組成成分纖維素、半纖維素和木質素，考察外源組分的添加對靈芝菌絲體生長的影響，隨后進一步考察木質素添加量對靈芝細胞生物量、胞內多糖、三萜和胞外多糖、三萜含量的影響情況，以期為靈芝菌生長代謝研究及人工栽培提供科學依據和參考。

1 材料與方法

1.1 取 樣

靈芝菌：赤芝、紫芝，由浙江省龍泉市科達農副產品有限公司提供，是當前段木栽培的主要菌種；纖維素、半纖維素購于北京易秀博谷生物科技有限公司；木質素購于Sigma；土豆、麩皮均為市售。

1.2 靈芝菌的平板培養

固體培養基（g/L）：麩皮50，蔗糖10，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂2，大豆蛋白胨20，瓊脂20。在基礎培養基中分別加入一定量（質量分數為0.5%、1.0%、1.5%）的纖維素、半纖維素和木質素，然后調pH值為5.7并經121 ℃高壓滅菌20 min，在超凈工作臺中趁熱倒平板，待平板中培養基凝固后，按每板接100L培養4 d的靈芝菌懸濁液，放置于28 ℃的恒溫培養箱中培養6 d，然后分別測量各平板中靈芝菌落的直徑。

1.3 靈芝的液體發酵培養

發酵培養基（g/L）：麩皮50，蔗糖10，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂2，大豆蛋白胨20。木質素添加量為0、0.2%、0.5%、1%和1.5%。液體培養基的裝液量定為100 mL。發酵培養基的pH值調至5.7，滅菌后接入4 mL培養4 d的靈芝菌懸濁液，隨后28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養8 d。

1.4 靈芝菌液體培養生物量測定

按1.3中的培養方法培養靈芝菌，在培養36 h后開始取樣測定生物量，此后每隔24 h取1次樣。將100 mL靈芝培養液在已知干質量砂芯漏斗（1）上真空抽濾，用去離子水洗滌菌絲體，直至菌絲體發白并且發酵液呈無色，然后置于105 ℃烘箱中烘干至恒質量后稱質量（2），精確至0.001 g，2-1即為靈芝菌絲體干質量。

1.5 靈芝菌多糖含量的測定

發酵液中多糖含量測定：取過濾后的澄清發酵液5 mL，于50 mL離心管中，緩慢加入15 mL 95%乙醇，靜置一段時間后于4 000 r/min離心10 min，依次用無水乙醇和丙酮洗滌，最后將沉淀自然風干后，用適量的去離子水溶解定容至50 mL，取定容后的溶液1 mL用苯酚-硫酸法測定發酵液中的多糖含量。

靈芝菌絲體中多糖含量測定：發酵液靈芝菌絲體烘干后研磨并過60目篩，取過篩后的菌絲體粉末0.100 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水于100 ℃下水浴提取1 h，4 000 r/min離心10 min后取出上清液，重復提取操作，合并2次提取液，定容至50 mL后，取1 mL定容后的溶液用苯酚-硫酸法測定菌絲體中的多糖含量。

1.6 靈芝菌三萜含量的測定

發酵液中三萜含量測定：取過濾后的澄清發酵液2 mL，稀釋4倍至8 mL，然后從中取0.4 mL用香草醛-冰醋酸法測定發酵液中的三萜化合物含量。

靈芝菌絲體中三萜含量測定：將上述烘干后的靈芝菌絲體研磨并過60目篩，取過篩后的菌絲體粉末0.100 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL 95%乙醇溶液浸潤10 min，然后45 ℃超聲處理1 h，4 000 r/min離心10 min后取出上清液，再次加入10 mL 95%乙醇溶液，二次超聲提取1 h，然后4 000 r/min離心10 min后取出上清液，合并2次提取液，定容至50 mL后，取1 mL定容后的溶液用香草醛-冰醋酸法測定菌絲體中的三萜化合物含量。

2 結果與討論

2.1 纖維素、半纖維素和木質素對靈芝生長的影響

通過在固體培養基中加入不同質量分數的纖維素、半纖維素和木質素（0、0.5%、1.0%、1.5%），觀察3種組分對靈芝菌生長的影響，培養6 d后生長情況如圖1所示。

從圖1中可以看出，在培養基中外源添加不同濃度纖維素、半纖維素和木質素培養6 d后，靈芝菌長勢表現出明顯的差異，纖維素的添加對菌絲體的生長并未產生明顯的促進作用，而半纖維素、木質素的添加則明顯促進靈芝菌絲體的生長，以添加木質素最為明顯。木質素添加加量為0.5%時，靈芝菌菌落最大，并且菌絲顯得較為濃密，表明木質素的添加對靈芝菌菌體生長有一定的促進作用。隨著木質添加量的增加，靈芝菌落反而變小，當木質素添加量為1.5%時，菌落直徑明顯小于0.2%木質素添加量（圖2）。

圖2為不同木質素添加量下靈芝菌落直徑大小變化情況，從圖2中可以看出，菌落直徑隨木質素添加量的增加呈先增大后減小的趨勢，當木質素添加量為0.2%時，靈芝菌長勢最好，菌落直徑最長可達9 cm。當木質素添加量高于1.0%后，菌落直徑隨木質素添加量的增加而明顯縮小，木質素添加量為2.0%時，菌落直徑只有3 cm。由此可知，一定濃度的木質素能促進靈芝生長，但當木質素添加量過高后反而會對靈芝的生長造成一定的抑制作用，因此在靈芝培養過程中要嚴格控制木質素添加量，使靈芝菌絲體生長處于最優的水平。

2.2 木質素添加對靈芝液體培養生物量的影響

隨后在靈芝液體培養基中添加不同濃度的木質素，考察木質素添加對靈芝菌液體培養的影響。從圖3中可以看出，在培養基中添加低濃度的木質素時（0.2%、0.5%），靈芝菌初期生長速度明顯高于高濃度木質素添加時的生長速度，隨培養時間的延長，1.0%木質素添加組靈芝菌生長速度逐漸加快，在第4天達到最大生物量且高于0.2%和0.5%木質素添加組。分析其生長滯后的原因可能是1.0%木質素添加在發酵初期對靈芝生長表現出一定程度的抑制作用，菌體達到一定濃度后分泌可降解木質素的酶系，并將木質素作為其營養來源，進而生物量得到迅速提升。當木質素添加量為1.5%時，靈芝菌的生長受到明顯抑制作用，生物量要低于對照組。液態培養基中木質素添加量為1.0%時，菌體生長情況最好，生物量最高可達0.7 g/(100 mL)，比對照組高56%。

2.3 添加木質素對多糖含量的影響

木質素對靈芝液體發酵產多糖的影響分別如圖4所示。圖4為發酵液中多糖含量變化情況，可以看出靈芝發酵液多糖的含量呈先升后降趨勢。在經過1～2 d的適應期后，靈芝胞外多糖含量逐步提高增加，在第4天左右靈芝發酵液多糖含量達到最大。隨木質素添加量的增加，胞外多糖含量呈先增加后降低的趨勢，0.2%、0.5%、1.0%木質素添加量胞外多糖濃度均高于對照組，1%木質素添加胞外多糖最高，與不添加木質素相比，其最大胞外多糖產量提高了33.6%。而添加1.5%木質素胞外多糖含量反而低于對照組，可見過量添加木質素同樣會抑制靈芝菌胞外多糖的合成。

圖4b為靈芝菌絲體中多糖含量變化情況，與胞外多糖合成情況類似，隨木質素添加量增加靈芝胞內多糖含量同樣呈先增加后降低的趨勢，0.2%、0.5%、1.0%木質素添加胞內多糖含量均高于對照組，1.5%木質素添加胞內多糖含量低于對照組。添加1.0%的木質素組對靈芝菌絲體多糖的合成具有很好的促進作用，該組中的靈芝菌絲體多糖在5 d前一直呈上升趨勢，在第5天產量達到最大，為58.25 mg/g菌絲體，與對照組相比，其最大胞內多糖產量提高了43%。添加1.5%的木質素抑制靈芝胞內多糖的產量，其胞內多糖含量明顯低于未添加木質素組，分析其主要原因可能是由于過量添加木質素明顯抑制菌體生長，從而影響了胞內多糖的合成。

a. 胞外多糖含量

a. Polysaccharide content in fermentation broth

2.4 木質素添加對三萜含量的影響

木質素對靈芝液體發酵產三萜的影響如圖5所示。圖5a為發酵液中三萜含量變化情況，從圖中可以看出，發酵液中三萜含量在前4 d逐漸增加，在第4 天達到最大，后期三萜含量基本保持恒定。與對照組相比，添加木質素均能促進胞外三萜含量的增加，木質素添加量低于1.0%時，隨添加量的增加胞外三萜含量呈明顯上升趨勢。添加1.0%木質素，胞外三萜含量最高，在第4天發酵液三萜質量濃度最高達66 mg/(100 mL)，對照組三萜含量最高僅為49 mg/(100 mL)，比對照提高34.6%。木質素添加量1.5%時，胞外三萜含量要低于0.2%、0.5%、1.0%木質素添加量三萜含量，但與對照組相比三萜含量要略高。

圖5b為靈芝菌絲體中三萜含量變化情況，從圖中可以看出，木質素添加均能促進靈芝菌絲體內三萜含量的增加，隨著木質素添加量的增加菌絲體三萜含量明顯增加。木質素添加量為0.2%、0.5%時，與對照組相比菌絲體內三萜含量略有增加但差距并不明顯。當木質素添加量為1.0%時，菌絲體內三萜含量明顯增加，菌絲體內三萜質量分數最高可達到41.5 mg/g，與對照組相比三萜含量提高41%。而當木質素添加量繼續增加到1.5%時，與1.0%添加組相比靈芝菌絲體內三萜含量開始減少。

a. 胞外三萜含量

a. Triterpene content in fermentation broth

2.5 木質素添加下不同靈芝菌株活性成分含量變化情況

為進一步驗證添加木質素對靈芝菌絲體多糖合成的促進作用，選取赤芝203、野生靈芝、龍泉紫芝、金寨紫芝4種段木栽培常用菌株，液體發酵培養基中添加1.0%木質素，考察木質素添加對其發酵產胞外多糖、三萜的影響情況，結果如圖6所示。

4株靈芝菌添加木質素后多糖、三萜含量均得到明顯提高，與對照組相比多糖含量增加量在38%～43%左右，三萜含量增加在30%～38%左右，因菌株不同略有差異，其中赤芝203多糖含量與對照比提高43%，金寨紫芝三萜含量與對照相比提高38%。由此可見，木質素作為營養基質在不同靈芝菌種培養過程中添加均能促進菌絲體多糖、三萜合成。

2.6 討 論

靈芝生長及活性成分含量受靈芝品種、栽培方式、栽培基質、生長環境等因素的影響較大[24-26]。靈芝段木栽培、袋料栽培均需選用木質素含量較高的殼斗科木材、木屑或棉籽殼等，表明木質素在靈芝生長過程中起著不可或缺的作用。尹騰通過測定種植前后段木組分含量變化情況發現靈芝種植后段木中木質素質量分數減少70%以上[27]，進一步證明靈芝段木及袋料種植過程中需要以木質素組分為營養基質。而目前關于木質素對靈芝生長影響的研究報道并不多。本文通過靈芝液體培養考察木質素對靈芝菌絲體生長的影響規律，發現在相同培養條件下少量添加木質素可促進靈芝菌絲體生長及多糖、三萜合成，但與文獻報道發酵水平相比，菌絲體濃度及活性多糖、三萜含量存在一定差距[28-30]，分析其主要原因有以下幾方面：1）所選菌株為實際生產菌株，未經馴化篩選，導致菌株在液體培養過程中生長活力較低；2）為避免碳源過于豐富，影響測定結果分析，我們降低了發酵培養基中碳源濃度，使得纖維素、半纖維素、木質素組分對生長影響的差異更加明顯，這樣也導致了靈芝菌絲體發酵處于較低水平。鑒于此，后面在此研究的基礎上，需對靈芝菌種及發酵條件進一步篩選優化，以期提高整體發酵水平。

3 結 論

本文選用靈芝段木栽培生產菌株，在培養基中分別添加纖維素、半纖維素、木質素三大主要組分，主要考察3種組分添加對靈芝菌絲體生長促進作用。結果發現添加半纖維素、木質素均能促進菌絲體生長，且木質素添加長勢最好，進一步研究發現添加少量木質素能促進菌體生長及菌絲體活性物質多糖和三萜的生物合成，過量添加反而抑制菌絲體生長及活性物質的合成。當木質素添加量為1.0%時，菌絲體生長情況最好，此時胞外多糖、胞內多糖、胞外三萜、胞內三萜相應的合成情況均處于最佳，與對照組相比均有所提高，其中胞內多糖含量提高了43%。

本研究明確了靈芝菌菌絲體生長過程中添加木質素對菌體生長及活性物質合成均有明顯促進作用。如果在靈芝培養過程中補加木質素成分，靈芝子實體生長及活性成分合成會得到明顯提高，后續需在木質素的代謝和轉化途徑及廢棄木質素回收利用方面做進一步深入研究，為實現農業可持續發展服務。

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Effect of lignin on growth of

Pei Haisheng1,2, Sun Junshe2, Wang Minjing2, Yin Teng1, Zhang Xiuqing1※

(1.,,100083,; 2.,100125,)

is a typical polypore fungus used for traditional Chinese medical purposes. The active ingredients ofinclude polysaccharides, triterpene, proteins and ganoderic acid, which can be effective in the treatment of cancer, hypertension and viral infections. Therefore, it has been widely planted and used in human health products. Nowadays the main cultivation methods forwere cut-log cultivation and substitute cultivation. These two methods use abundant wood. So the cultivation ofby using abundant wood could cause destruction to the ecological environment.liquid fermentation cultivation was no only an important method for fundamental research, but also a way to product bioactive compounds. In this study, cellulose, hemicellulose and lignin were added into the media to investigate the influence of these additives on the growth of. The results showed that adding lignin or hemicellulose all could obviously promote the growth of. However, adding cellulose could not obviously promote the growth of. Most of lignin and a part of hemicellulose could be used, while the cellulose could not be used for the growth of. The effects of liquid culture media with different lignin concentrations on the growth ofwere studied. The liquid fermentation media with four different lignin concentrations (0.2%, 0.5%, 1.0%, 1.5%) were designed. The results showed that adding little lignin could promote the growth of, however, when the concentration of lignin was above 1.0%, the growth ofwas severely inhibited. Compared with the control, the growth ofwas the best with the lignin concentration of 1.0%, and its biomass was increased by 56%; the synthesis of extracellular polysaccharides and intracellular polysaccharides were increased by 33.6%, 43%, respectively; and the synthesis of extracellular triterpenoid and intracellulartriterpenoid were increased by 34.6%, 41%, respectively. It was proved that adding lignin in the process of liquid fermentation culture could increase the yield of polysaccharides and triterpenoid in four differentstrains (203, wild, Long Quan, Jin Zhai. Compared with the control, the polysaccharide contents of fourwere increased by 38%-43%, and triterpenoid contents were increased by 30%-38%, and the polysaccharide content of203 was higher than the control by 43%, and triterpenoid content of Jin Zhaiwas higher than the control by 38%. However, it will need further study to prove that adding lignin between cut-log cultivation or substitute cultivation can promote the growth ofand the synthesis of bioactive compounds.

lignin; polysaccharides; triterpenes;; liquid fermentation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.06.040

S567.3+1

A

1002-6819(2017)-06-0309-06

2017-01-04

2017-03-16

國家自然科學基金（21576142）

裴海生，男（漢族），工程師，主要從事生物技術及酶工程方面的研究。北京 農業部規劃設計研究院，100083。Email：peihaisheng2001@163.com

張秀清，女（漢族），副教授，主要從事生物技術及酶工程方面的研究。北京 中國農業大學，100083。Email：xiuqingzhang@cau.edu.cn