基于液質(zhì)聯(lián)用技術對急性血瘀證大鼠動物模型的代謝研究*

黃 爍，孫明謙，孫 蕾，劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所， 北京市中藥藥理重點實驗室,北京 100091)

基于液質(zhì)聯(lián)用技術對急性血瘀證大鼠動物模型的代謝研究*

黃 爍，孫明謙，孫 蕾，劉建勛△

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所， 北京市中藥藥理重點實驗室,北京 100091)

目的：通過基于液質(zhì)聯(lián)用技術的代謝組學方法發(fā)掘急性血瘀證大鼠動物模型的潛在生物標志物，探索該中醫(yī)證候模型的發(fā)病機制。方法：SD大鼠分為正常組和模型組，應用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀的代謝組學方法檢測急性血瘀證大鼠血清中代謝物的變化，通過PLS-DA等模式識別方法進行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果：與正常組比較，模型組的脂肪酸代謝、磷脂酰膽堿代謝、神經(jīng)鞘磷脂代謝出現(xiàn)異常。結(jié)論：急性血瘀證模型中磷脂酰膽堿、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂等成分的代謝都受到了干擾，這些代謝途徑的變化可能導致能量代謝的異常，影響血小板功能，進而導致血瘀證的發(fā)生。

血瘀；代謝組學；生物標記物； 液質(zhì)聯(lián)用

血瘀證是指人體內(nèi)血行不暢、壅阻血脈或血溢脈外、停積為瘀的證候。如何應用現(xiàn)代科學技術手段對血瘀證的科學內(nèi)涵進行闡釋，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要課題。代謝組學反映了多種因素作用下的終點效應,已經(jīng)在實驗動物模型評價中展現(xiàn)出其特色和優(yōu)勢[2-3]。其基于整體性研究和系統(tǒng)性的理念比較適合中醫(yī)藥作用的特點，將二者有機結(jié)合是非常有意義的工作[1]。本文擬采用高效液相串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(LC-TOF-MS)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對急性血瘀證大鼠模型進行代謝組學研究，發(fā)掘與血瘀證模型相關生物標志物與相關代謝途徑，從而深入探索其發(fā)病機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量(240±10)g，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司(許可證號SCXK(京)2011-0004)。

1.2 藥物及試劑

色譜純乙腈(美國Fisher 公司)、色譜純甲酸(美國J.T.BAKER公司)、純凈水(中國娃哈哈有限公司)、腎上腺素注射液(杭州和豐制藥有限公司)。

1.3 儀器

1200 HPLC 系統(tǒng)(美國Agilent公司)，LC-QTOF-MS 6520液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(美國Agilent公司)，LBY-F/S5 體外血栓形成儀(北京普利生儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組方法

實驗大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院SPF級動物房，溫度(25±2)℃，濕度(40±5)%，大鼠隨意飲食飲水。大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機分為正常對照組和急性血瘀證模型組，正常組10只，模型組12只。

2.2 急性血瘀證大鼠模型的建立

參照文獻方法[4-5]模型組按0.8 ml/kg體質(zhì)量皮下注射鹽酸異丙腎上腺素，對照組注射等容量的生理鹽水共2次，間隔4 h，于第1次注射后2 h，將大鼠放入0 ℃冰水中游泳5 min，然后取出擦干動物毛發(fā)水，禁食不禁水24 h。

2.3 大鼠體外血栓形成實驗方法

參照文獻[6-7]用硅化注射器穿刺腹主動脈取血2 ml，按照Chandler體外法立刻將血注入旋轉(zhuǎn)環(huán)內(nèi)，注入的血量充滿旋轉(zhuǎn)環(huán)1/2以下(1.8 ml)，迅速密封并置于血栓形成儀上， 旋轉(zhuǎn)10 min(37 ℃)傾出血栓，生理鹽水洗滌測量長度，再將血栓條置80 ℃烘箱恒溫烘烤3 h,恒重后稱其干重。

2.4 血液標本的收集

于造模次日腹主動脈取血5 ml, 樣品經(jīng)3000 rpm， 室溫離心 10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。

2.5 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析

2.5.1 代謝物萃取 血漿樣品在室溫下溶化后，取50 μl加入200 μl乙腈溶劑中振蕩混合均勻，室溫下靜止10 min，經(jīng)12000 rpm、 4 ℃離心 10 min，取上清液進入LC-MS 分析，進樣5 μl。

2.5.2 液相色譜條件 液相色譜為美國Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)，包括恒壓二元泵、脫氣機、自動進樣器和柱溫箱。RPLC色譜柱 (X-bridge, C18, 3 μm, 2.1×100 mm, Waters, Ireland) 用于常規(guī)分離。流動相：A相：0.1% 甲酸溶液；B相：0.1% 甲酸乙腈，梯度為 35% B; 3 min, 60% B; 15 min, 75% B;20 min, 95% B; 22 min, 35% B; 25 min stop,平衡時間3 min。 流速為0.25 ml/min，柱溫為35 ℃。

2.5.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析采用美國Agilent 6520 series Time of Flight mass spectrometer equipped with an electro-spray ionization (ESI) Interface(LC-QTOF-MS)。采集模式為正離子，掃描范圍從80 到1000 m/z，質(zhì)譜數(shù)據(jù)儲存模式為centroid。霧化氣和干燥氣均為氮氣，碰撞氣為氦氣。霧化溫度350℃，干燥氣10.0 L/min，霧化氣30 psi，毛細管電壓3500 eV。

2.6 統(tǒng)計學方法

通過Mass Hunter 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，進一步輸入到Mass profiler professor(MPP)軟件中進行分析。MPP分別采用排列、歸一化、修正80%規(guī)則、數(shù)據(jù)集分割和數(shù)據(jù)縮放等方法對數(shù)據(jù)集進行預處理，所得數(shù)據(jù)最后應用SIMICAP+統(tǒng)計軟件作進一步的 PLS-DA分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體外血栓形成實驗結(jié)果

表1顯示，血瘀模型組與空白組比較，血栓的長度、干重都出現(xiàn)明顯的差異(P<0.05,P<0.05)，說明造模成功。

表1 大鼠體外血栓形成實驗結(jié)果

注： 與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 LC-MS的代謝輪廓圖

圖1顯示，本實驗采用HPLC-TOF-MS 對急性血瘀證大鼠模型血清中的成分進行代謝組學分析。

圖1 LC-MS檢測樣品的總離子流圖 圖2 血清樣本PLS-DAscoreplots平面圖

3.3 多元數(shù)據(jù)分析

本實驗利用PLS-DA對急性血瘀證模型與正常組血清樣本進行模式識別與區(qū)分。圖2為2組血清樣本的PLS-DA score plots 平面圖，結(jié)果顯示正常組和模型組呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別，說明急性血瘀證大鼠動物模型的體內(nèi)代謝成分已經(jīng)受到干擾。PLS-DA數(shù)據(jù)模型參數(shù): R2=0.994，Q2=0.87。

3.4 潛在生物標志物的篩選

表2顯示，在 PLS-DA 分析中以 VIP>1作為標準篩選模型上2組間分離有貢獻的變量，它們在模式識別中發(fā)揮重要作用，配合以 student’s t test (P<0.05) 作進一步的篩選以獲得潛在的生物標志物。通過METLIN、HMDB等數(shù)據(jù)庫對精確分子量、同位素比等數(shù)據(jù)進行比對，共篩選出13個生物標志成分、大鼠急性血瘀證模型的潛在生物標志成分及相關代謝途徑。

表2 大鼠急性血瘀證模型的潛在生物標志成分及相關代謝途徑

4 討論

實驗結(jié)果顯示，模型組中 Arachidonyl lysolecithin，Linolenoyl lysolecithin 等磷脂酰膽堿類成分的含量大幅下降，提示在血瘀證大鼠動物模型中磷脂酰膽堿的代謝出現(xiàn)異常。在模型組中，磷脂酰膽堿的代謝速度加快，提示磷脂酶A2的活性可能上調(diào)，導致花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等成分上調(diào)，進而造成心血管疾病和血瘀的發(fā)生[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，模型組中 7-palmitoleic acid、Linolenic acid 等脂肪酸含量明顯下降，而脂肪酸和磷脂的代謝與能量的代謝密切相關，這兩類成分在模型組大鼠體內(nèi)都出現(xiàn)明顯下降，提示其能量代謝出現(xiàn)變化。造模過程中，腎上腺素會加強能量的利用和產(chǎn)熱作用，冰水刺激也會使產(chǎn)能增加，造成脂肪酸等代謝加強及大量消耗。最終導致大鼠能量物質(zhì)減少，出現(xiàn)代謝障礙，能量代謝的異常也能導致該模型氣血運行不暢，出現(xiàn)精神不振、活動減少等血瘀癥狀。脂質(zhì)代謝的紊亂可能是導致血瘀證侯的重要因素[2]。

本實驗結(jié)果顯示，在模型組中3-Dehydrosphinganine和 Dihydrosphingosine 2個神經(jīng)鞘磷脂類成分出現(xiàn)上調(diào)。神經(jīng)鞘磷脂是形成生物膜的重要脂類成分，也是細胞增殖、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。最近研究表明，神經(jīng)鞘脂類成分可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成，脂蛋白的代謝與心血管疾病密切相關[10]。神經(jīng)鞘磷脂參與動脈粥樣硬化的病理發(fā)展，在人類和動物模型中鞘磷脂積聚并形成斑塊。神經(jīng)鞘磷脂的代謝產(chǎn)物促進血管內(nèi)皮損傷，在維持動脈粥樣硬化斑塊中炎癥細胞的浸潤等促進粥樣硬化斑塊進展方面起作用[11-12]。鞘磷脂成分可以影響血小板的功能，可能改變血小板的能量代謝和信號傳導，激活血小板，這也可能是導致大鼠血瘀證的一個重要原因。總之，神經(jīng)鞘磷脂含量的增高可能導致罹患動脈粥樣硬化的風險增大，這類成分可能是急性血瘀動物模型的重要生物標志物。

本文采用代謝組學技術對急性血瘀證大鼠模型的血清樣本進行分析，結(jié)果顯示該模型中磷脂酰膽堿、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂等成分的代謝都受到干擾，這些代謝途徑的變化可能導致能量代謝的異常，影響血小板功能進而導致血瘀證發(fā)生。

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Study on Metabolism of Acute Blood Stasis Rat Model Based on the Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HUANG Shuo, SUN Ming-qian, SUN Lei, LIU Jian-xun△

(InstituteofBasicMedicalSciencesofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,BeijingKeyLaboratoryofPharmacologyofChineseMateriaMedica,Beijing100091，China) Abstract: Objective:A metabonomics approach based on liquid chromatography coupled time-of-flight mass spectrometry (LC-TOF-MS) was utilized to obtain potential biomarkers of acute blood stasis rat and investigate metabolic mechanism of this TCM syndrome animal model.Method: SD rats were divided into normal group, blood stasis model group.Reversed-phase chromatography was used to separate the endogenous metabolites in serum. Partial least-squares to latent structure-discriminat analysis (PLS-DA) were used for data analysis.Result: Good separations were observed between the normal and model group. The major disturbed metabolic pathways were fatty acids, phosphatidylcholines and sphingolipids metabolism. Conclusion:The study provided further understanding of pathologic mechanism of the TCM syndrome animal model.

Blood stasis; Metabonomics; Biomarkers; LC-MS

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2015CB554405)-基于病證結(jié)合的氣血理論研究；國家自然科學基金資助項目(81202950)-基于代謝組學技術研究中藥復方雙參通冠方的配伍與作用機制

黃 爍，醫(yī)學碩士，從事心血管藥理學的研究。

△通訊作者：劉建勛，研究員，醫(yī)學博士，從事心腦血管藥理學與新藥發(fā)現(xiàn)研究，Tel:010-62835601,E-mail:liujx0324@sina.com。

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1006-3250(2017)03-0332-03

2016-08-13