依達拉奉對腦缺血缺氧新生大鼠神經功能的影響

于沛霞，薄立軍，薛 輝，郄曉娟，徐貫杰*(.河北醫科大學第三醫院麻醉科，河北 石家莊 05005;.河北醫科大學第二醫院麻醉科，河北 石家莊 050000;.河北省邯鄲市第四醫院麻醉科，河北 邯鄲 05600)

·論 著·

依達拉奉對腦缺血缺氧新生大鼠神經功能的影響

于沛霞1，薄立軍2，薛 輝3，郄曉娟1，徐貫杰1*
(1.河北醫科大學第三醫院麻醉科，河北 石家莊 050051;2.河北醫科大學第二醫院麻醉科，河北 石家莊 050000;3.河北省邯鄲市第四醫院麻醉科，河北 邯鄲 056200)

目的觀察依達拉奉對腦缺血缺氧新生大鼠神經功能和行為的影響,探討依達拉奉保護神經功能的作用機制。方法建立新生大鼠(7 d)腦缺氧缺血損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)模型。48只SD大鼠隨機分3組，各16只，假手術組(S)僅進行手術而不造成缺氧狀態，HIBD模型組(R)持續缺氧2 h,依達拉奉組(F)于HIBD 2 h即刻腹腔注射給予依達拉奉3 mg/kg。觀察各組干預后新生大鼠神經功能評分、伊文思藍及腦組織基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)含量的變化，透射電鏡觀察病理學改變。結果R組MMP-9、2%伊文思藍(Evans blue，EB)、神經評分分值高于S組，翻身次數少于S組。F組MMP-9、EB、神經評分分值低于R組，翻身次數R組、F組少于S組，R組少于F組，差異均有統計學意義(P<0.05)。R組新生大鼠死亡1例，F組、S組無新生大鼠死亡。結論新生大鼠腦缺血缺氧后腦組織MMP-9表達增高, 血腦屏障通透性增加,自由基清除劑依達拉奉可以保護血腦屏障通透性,改善神經功能，降低死亡率，其作用可能與抑制MMP-9在損傷腦組織中的表達有關。

腦缺血；血腦屏障；基質金屬蛋白酶9

新生兒缺血缺氧造成的腦損傷是一個復雜的、多因素參與的過程,目前由于高齡產婦的增加，新生兒缺血缺氧性腦損傷的發生不斷增加，如何有效地治療新生兒缺血缺氧性腦損傷成為熱點話題。在新出生大鼠的腦缺血缺氧損傷的研究中發現新生大鼠血腦屏障的完整性起著重要的作用,血腦屏障對缺血缺氧非常敏感,可導致明顯的腦水腫和腦梗死，造成嚴重的神經功能障礙。近年來大量研究證實,蛋白酶和自由基的大量產生和釋放激活基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)是導致缺血缺氧損傷的主要致病因素[1-2]。本研究采用Rice的方法建立新生大鼠腦缺氧缺血模型[3],觀察自由基清除劑依達拉奉對新生大鼠腦缺血缺氧后血腦屏障通透性變化和MMP-9表達的影響,旨在進一步了解新生大鼠腦缺血缺氧損傷的分子機制，并為新生兒缺血缺氧性腦損傷的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生7 d的健康SD大鼠, 共48只，由河北省實驗動物中心提供(1501100)，體質量12～16 g。采用隨機數字表法分成3組: 假手術(S)組、缺血缺氧(R)組、依達拉奉(F)組，每組16只。

1.2 模型制備 Rice方法建立新生大鼠腦缺氧缺血損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)模型。7 d SD大鼠，于術前禁食6 h，自由飲水，環境溫度19～22 ℃。假手術組僅進行手術而不造成缺血缺氧；缺血缺氧組建立HIBD模型，新生大鼠行左側頸總動脈永久性結扎,2 h后置于玻璃缺氧箱中，37 ℃恒溫,輸入氧濃度為(8.0±0.1)%的氮氧混合氣體持續缺氧2 h；依達拉奉組于持續缺氧2 h即刻腹腔注射給予依達拉奉3 mg/kg。假手術組和缺血缺氧組給予生理鹽水2 mL/kg, 依達拉奉組給予依達拉奉3 mg/kg,濃度1.5 mg/mL[4]。每組均母鼠喂養24 h。

1.3 觀察指標 ①各組新生大鼠24 h后死亡率。②將新生SD大鼠缺血缺氧處理后，喂養24 h，按隨機原則每組選取8只，斷頭處死，剝離左側腦額葉皮質備用。將新生大鼠剩余腦組織用于制備腦組織勻漿3 500 r/min離心10 min后，留腦組織勻漿上清液，酶聯免疫吸附測定方法測定各組大鼠腦組織勻漿MMP-9濃度。③透射電鏡下新生SD大鼠大腦血腦屏障超微結構的改變：冰盤上將新生SD大鼠大腦額葉皮質剪成符合透射電鏡使用的組織小碎塊，經固定冷藏1 h后，在透射電鏡下觀察。④每組剩余8只新生大鼠水合氯醛麻醉后，置于動物解剖實驗臺上固定，游離左側股靜脈，留置輸液針并固定，用于注入4 mL/kg、2%伊文思藍(Evans blue，EB)生理鹽水溶液。輸注1 h后，用剪刀開胸暴露心臟，將22 ℃生理鹽水注入左心室，灌注壓為110 mmHg，觀察右心房流出液體的顏色，當液體顏色為無色時，停止灌注，立即斷頭處死新生大鼠。剝離并留取雙側大腦組織，電子天平稱質量后制成腦組織勻漿，50 ℃恒溫水浴箱保存48 h，離心機上以3 000 r/min離心15 min，取腦組織勻漿上清液用于測量EB含量。

1.4 神經功能評分 ①五點量表評估神經行為，由不知道動物分組的研究者進行操作。正常(無神經功能缺損)0分：大鼠表現正常，完全可以伸開前肢朝地抬起尾巴，晃來晃去。輕度神經功能缺損1分：起重尾巴，晃來晃去時，大鼠不能完全伸展自己的左前肢；中度神經功能缺損2分：大鼠已經減少抗側推和輕度神經行為；嚴重的神經功能缺損3分：只轉身成一個圓圈，并有輕度和中度神經行為；嚴重的神經功能缺損4分：只走路不自然，并有意識的低迷水平。②觀察新生SD大鼠翻身實驗：各組新生SD大鼠放置于動物實驗臺上，取仰臥位，助手記錄新生SD大鼠翻身時，其四肢著地所用時間，當被測SD新生大鼠不能在1 min內翻身成功，則記錄為翻身失敗。各組每只大鼠必須不間斷測試10次，結果用于統計學分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS 23.0統計學軟件處理數據。多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組各項指標比較 R組MMP-9、2% EB含量及神經功能評分分值高于S組，翻身次數少于S組。F組MMP-9、EB含量及神經功能評分分值低于R組，翻身次數R組、F組少于S組，R組少于F組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

R組新生大鼠死亡1只，F組、S組無新生大鼠死亡。

表1 3組MMP-9、EB、翻身次數、神經功能評分比較Table 1 The comparison of MMP-9,EB,turn over times and nerve function score (n=8)

*P<0.05與S組比較 #P<0.05與R組比較(SNK-q檢驗)

2.2 3組間電子顯微鏡下超微結構比較 S組：血腦屏障的結構和毛細血管的基膜完整，只有少部分線粒體嵴和膜表現為融合現象(圖1)。R組：血腦屏障的結構破壞，毛細血管的基膜出現斷裂，包膜大部分緊密連接不完整，線粒體腫脹，也表現出嵴或膜融合或消失(圖2)。F組：血腦屏障的結構較少被破壞，毛細血管的基膜較完整，包膜連接完整，大部分緊密連接存在，部分線粒體腫脹，少量嵴和膜融合或消失(圖3)。

圖1 S組大鼠血腦屏障的超微結構(TEM ×20 000)

Figure 1 The ultrastructure of blood brain barrier of a rat from S group (TEM ×20 000)

圖2 R組大鼠血腦屏障的超微結構(TEM ×20 000)

Figure 2 The ultrastructure of blood brain barrier of a rat from R group (TEM ×20 000)

圖3 Y組大鼠血腦屏障的超微結構(TEM ×20 000)

Figure 3 The ultrastructure of blood brain barrier of a rat from Y group (TEM ×20 000)

3 討 論

新生兒胎內窘迫導致的HIBD是目前嚴重威脅新生兒健康甚至生命的疾病之一。HIBD是一個復雜的級聯損傷過程，包含了能量代謝障礙、興奮性氨基酸的釋放、炎癥級聯反應、氧自由基合成釋放、內環境失衡等[5]。其中由于腦缺血缺氧導致脂質過氧化反應大量持續進行，進而導致腦組織中大量自由基產生。有文獻報道，氧自由基特別是超氧陰離子在HIBD后對腦水腫形成和腦細胞損傷有重要作用[2]。也有學者認為，HIBD過程中，大量活性氧及NO產生釋放,進而通過各種信號途徑破壞微血管的完整性，導致腦出血和水腫[6]。新生大鼠腦組織線粒體發育不成熟，ATP合成和儲備能力欠缺，同時新生大鼠ATP合成的能量來源不足，內源性的抗氧化能力不完善，導致新生大鼠腦組織對缺血缺氧更敏感[7]。新生大鼠HIBD，由于腦組織脂質含量較高，導致氧自由基的大量產生，機體不能清除，使其過氧化增強，導致了腦組織細胞損傷[8]。

本研究通過Rice方法建立新生大鼠HIBD模型，結果顯示，R組較S組，在腦缺血缺氧24 h，腦組織EB的含量增高，神經功能缺損評分增高，翻身次數減少，電子顯微鏡下結構損傷明顯，腦組織勻漿MMP-9濃度表達明顯升高。說明HIDB模型建立成功，HIBD破壞了血腦屏障，且影響到了腦的功能。因此，HIBD可能的機制是:新生大鼠腦缺血缺氧導致腦組織氧自由基大量合成釋放, 活化MMPs,激活蛋白水解酶，進而降解基底膜，造成血腦屏障破壞，導致腦損傷和腦功能障礙。

MMPs是一組Zn2+依賴的肽鏈內切酶，尤其是MMP-9參與機體的許多生理病理過程[9]。在正常生理狀態下MMPs低水平表達，而在缺血缺氧、外傷等條件下MMPs表達增加，MMPs被激活，影響組織細胞和基質蛋白的損傷和修復。在HIBD的病理條件下，MMP-9發揮主要作用。生理條件下，MMP-9以酶原proMMP-9的形式合成后，存在于正常腦組織中，proMMP-9是無活性的。如果某些特定因素，可導致proMMP-9酶原被激活，但小劑量的也會被降解酶迅速降解，因而組織中只存在極低水平的活化MMP-9[10]。但在病理條件下，如果proMMP-9被大量激活，不能被降解酶全部降解，MMP-9可以導致破壞部分細胞外基質成分，從而增加血腦屏障通透性，促進腦水腫形成，導致腦梗死加重，甚至表現為腦出血、腦損傷[11-12]。依達拉奉是一種新型自由基清除劑[13]。有大量文獻報道，依達拉奉作為自由基清除劑和抗氧化劑，能夠在腦缺血、腦外傷等條件下，降低腦組織中羥自由基的濃度[14]，抑制遲發性神經元死亡,減輕血管內皮細胞的損害和缺血性的腦水腫[15-16],目前已被廣泛應用于臨床腦外傷和腦梗死的治療。

本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，造成了新生大鼠腦缺血缺氧，于缺血缺氧結束即刻，給于腹腔注射依達拉奉 3 mg/kg，觀察大鼠腦組織EB含量、神經功能缺損、組織超微結構的變化和MMP-9的表達，結果顯示F組較R組，腦組織EB含量明顯降低，神經功能評分分值明顯減少，翻身次數明顯增多，電子顯微鏡下結構損傷明顯減輕，腦組織勻漿MMP-9濃度表達明顯降低。超微結構的組織形態學與生化指標結果，表明依達拉奉對新生大鼠HIBD模型造成的HIBD有明顯的減輕作用。本研究結果發現MMP-9濃度在新生大鼠缺血缺氧后24 h明顯升高，這說明MMP-9參與了急性HIBD過程,并進一步證實腦缺血缺氧導致的血腦屏障的開放與腦組織MMP-9活性表達增高有關。

目前大量的研究認為在HIBD的早期階段，部分蛋白酶如MMPs對大鼠血腦屏障有明顯的損害作用。結合本研究結果顯示F組新生大鼠腦組織中MMP-9的濃度較R組明顯降低，腦組織EB的滲出量減少，血腦屏障的完整性得到保護,提示依達拉奉可能通過抑制MMP-9的活化介導了新生大鼠血腦屏障的破壞,進而減輕HIBD。因此，依達拉奉于缺血缺氧結束即刻腹腔注射3 mg/kg，通過抑制氧自由基合成和釋放，并加快氧自由基的清除,抑制了MMP-9的激活，進而減輕新生大鼠血腦屏障破壞，減輕了HIBD，改善了神經功能。其機制可能與清除自由基、抑制MMP-9在損傷腦組織中表達、減輕腦水腫有關。

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(本文編輯：劉斯靜)

Effect of edaravone on neurological function of newborn rats with cerebral ischemia and anoxia

YU Pei-xia1， BO Li-jun2， XUE Hui3, QIE Xiao-juan1, XU Guan-jie1*
(1.DepartmentofAnesthesiology，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China; 2.DepartmentofAnesthesiology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China； 3.DepartmentofAnesthesiology,theForthHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056200,China)

Objective To investigate whether Edaravone has a protective effect in model for newborn rats of hypoxic-ischemia brain damage. Methods Seven-day-old(P7) SD rats 48 were randomly divided into 3 groups(n=16, each group): control group(group S), hypoxia-ischemia brain group(group R), edaravone group(group F). P7 rats were subjected to hypoxia-ischemia brain damage for 2 h. Edaravone was treated after hypoxic-ischemia brain damage in group F. After 24h, neurological deficit scores were assessed. Matrix metalloprotein-9(MMP-9) was detected by enzyme-linked immunosorbent assay in the ischemic penumbrae of the cerebral cortex. The nervous structure was detected by electron microscopic observation. The content of Evans blue(EB) in the brain of neonatal rats was determined. Results MMP-9, EB, S score in group R were higher than that of group S. Turn over times in group R were less than that of group S. MMP-9, EB, S score in group F were lower than that of group S. Turn over times in group R and group F were less than that of group S. Turn over times in group R were less than that of group F. The differences were statistically significant(P<0.05). There is one death of rat in group R, and no death in group F and S. Conclusion The expression of MMP-9 in brain tissue of neonatal rats with cerebral ischemia and hypoxia was increased, and the permeability of blood brain barrier was increased. Edaravone treatment provides neuroprotection against cerebral ischemia and hypoxia in neonatal rats by protecting blood brain barrier permeability, improving neurological function. The mechanisms for the effect might be related to the inhibition of MMP-9 expression in cerebral ischemia and hypoxia in neonatal rats.

brain ischemia； blood-brain barrier； matrix metalloproteinase 9

2016-11-21；

2016-12-14

河北省醫學科學研究重點課題(20130221)

于沛霞(1979-)，女，天津人，河北醫科大學第三醫院主治醫師，醫學碩士，從事臨床麻醉學研究。

R743.31

A

1007-3205(2017)04-0423-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.04.013

*通訊作者