時空表達可控性E2F3a轉基因小鼠模型的建立

王程遠，張 海，焦 勇，張 波（第四軍醫大學：唐都醫院泌尿外科，實驗動物中心，陜西西安70038）

時空表達可控性E2F3a轉基因小鼠模型的建立

王程遠1，張 海2，焦 勇1，張 波1（第四軍醫大學：1唐都醫院泌尿外科，2實驗動物中心，陜西西安710038）

目的：通過觀察時空表達可控性E2F3a轉基因小鼠模型，探討建立膀胱癌動物模型的合適方法．方法：培育轉基因動物品系，利用組織特異性啟動子UropakinⅡ確保轉基因表達的空間專一性，利用Doxycycline誘導系統實現轉基因表達時間上的調控．結果：經雜交后篩選出陽性純合子，能可控性地在膀胱組織中表達目的基因E2F3a．結論：利用組織特異性啟動子UropakinⅡ和Doxycycline誘導表達系統，可以建立時空表達可控性E2F3a轉基因小鼠模型．

轉基因；模型；動物；腫瘤

0 引言

基因修飾動物模型是目前生命科學領域集成度最高的綜合性研究體系之一，轉基因動物模型是建立基因修飾動物模型的重要方法，在腫瘤研究方面應用廣泛．通過實驗手段將設計的目的基因導入到動物胚胎細胞中，隨機整合入基因組，進入生殖細胞并穩定遺傳至下一代，由此獲得轉基因動物．1980年，Gordon等［1］首次報道采用顯微注射法將外源性DNA注入到受精卵的雄原核，再將受精卵移植至假孕鼠輸卵管，從所得新生小鼠中篩選出整合有外源性基因的小鼠，成功建立顯微注射法制備轉基因動物的方法．

膀胱癌是泌尿生殖系常見腫瘤，其生物學行為具有高度異質性及不可預測性，復發率高，臨床診治棘手，深入探討膀胱癌發生的分子生物學機制進而創制治療膀胱癌新型藥物已成為膀胱癌研究熱點．膀胱癌的發生、發展與細胞周期失控密切相關．E2F轉錄調節因子是一組在細胞周期調控過程中起重要作用的調控蛋白，其中E2F3基因的表達與膀胱癌分期、分級、增殖有關［2］，E2F3存在E2F3a及E2F3b兩種亞型，在細胞周期G1／S期過渡中起著關鍵作用［3］．

雖然膀胱腫瘤轉基因小鼠模型在近十年中已有所發展，但是，目前不論是在模型種類還是在與人類疾病的擬合程度上，膀胱癌模型都遠遠落后于其他惡性實體腫瘤模型［4－5］．由于膀胱癌具有由表淺型向浸潤型、由低級別向高級別轉化的過程和現象，而E2F3基因的表達與膀胱癌分期、分級、增殖有關，所以建立具有膀胱上皮組織特異性、時間可控性的E2F3小鼠膀胱癌模型對膀胱癌研究具有重要意義．

1 材料和方法

1．1 材料實驗涉及的主要材料：FVB／N小鼠、teto?Histone?GFP小鼠系購自美國JAX實驗室．限制性內切酶購自美國Fermentas公司．DNA凝膠提取試劑盒購自美國Qiagen公司．PCR產物純化試劑盒購自美國Amresco公司．

1．2 方法

1．2．1 供體雌鼠和假孕受體母鼠同步獲得 供體FVB／N雌鼠通過注射激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得，假孕受體母鼠通過正常FVB／N雌鼠與結扎FVB／N雄鼠交配產生．

1．2．2 受精卵的采集 供體FVB／N鼠注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）后，通過輸卵管壺腹部收集受精卵細胞．透明質酸酶消化后備用．

1．2．3 重組質粒的制備 采用RT?PCR法合成E2F3a cDNA，E2F3a 基 因 引 物 序 列：F primer：TGGGCTGAGTCTGTCTGAGGA，R primer：GTTGAAGC?CAAGTCTTTGGAAG，產物長度 422 bp．將 E2F3a cDNA克隆入載體pTet?on（Clontech，Mountain View，CA）構建重組載體TRE?E2F3acDNA?SV40polyA（圖1A）．為了增強E2F3a的表達，以pRL熒光素酶報告基因為載體骨架（Promega，WⅠ，USA）擴增一段嵌合內顯子插入到上述的載體中．該內顯子由源于人類β球蛋白基因第一段內含子的5'剪切位點和源于免疫球蛋白基因重鏈可變區基因內含子的3'剪切位點所組成．為了檢測外源性E2F3a在轉基因小鼠中的表達，將3XFLAG分子標記物克隆至E2F3a cDNA 5'端（圖1B），XhoⅠ酶切此克隆載體且DNA凝膠純化，回收線性化的DNA片段teto：intron：FAG：E2F3a：SV40polyA并進行純化．以緩沖液調整目的DNA的濃度在5～10 ng／μL．

圖1 UPⅡ?rtTA，teto?E2F3a轉基因小鼠載體的構建

1．2．4 受精卵細胞顯微注射及移植 純化后5～10 ng／μL的DNA通過顯微注射儀注射到FVB／N近交系受精卵細胞的原核中，注射后的受精卵細胞移植到受體動物ICR小鼠輸卵管．受精卵細胞顯微注射及移植操作步驟為：①置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦．②調節持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉換到高倍鏡（32X）下時位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵．③挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進入油界．在注射前，增加注射針的壓力可見DNA溶液泡在油內形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在．如果未見DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸打開注射器針頭．針頭重新進入油內確定DNA溶液流的存在．④移動持卵管回到受精卵下部，通過微分驅動水壓控制系統使持卵管內產生溫和的負壓，并使持卵管末端吸住受精卵．⑤對持卵管內真空進行緩慢調節，使持卵管內受精卵輕柔地旋轉，使卵內原核位于持卵管口的遠側端．⑥維持持卵管穩定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進行調節并使針與原核處于同一平面上．用注射針依次刺破透明帶、細胞外膜、前核核膜，進入核膜內，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當有彈性，應用不同的方法進行嘗試突破此結構．操作時避免與核接觸損傷核仁．⑦保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入原核中．⑧用持卵器移動受精卵到凹玻片凹內相對隔離的位置，以區分注射組與非注射組．⑨將存活受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的輸卵管（或子宮）內，飼養后鑒定是否受孕以及個體發育狀況．

1．2．5 子代鼠外源基因整合和表達的檢測 轉基因的基因組結合將通過PCR進行第一輪評估，第二輪評估將運用 E2F3a外顯子 7序列作為探針進行Southern blotting以對E2F3a轉基因拷貝數和基因組結合位點數作進一步分析（圖1）．

Southern blotting：小鼠的基因組DNA將由其尾巴活檢中提取．利用瓊脂糖凝膠電泳分離經限制性內切酶NcoⅠ消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜上，經紫外線照射固定，再與定位于3．6 kb小鼠UPⅡ啟動子的3'末端的450?bp磷32同位素標記的探針雜交（理論上會在膠片上得到兩條帶．切割后含有UPⅡ操縱子的外源DNA的長度應為1．6 kb，切割后含有內源UPⅡ操縱子的DNA長度應為5．4 kb）．用放射自顯影顯色，兩條帶的強度都將由ImageJ軟件（NIH，USA）進行定量分析．轉基因的拷貝數將由外源及內源基因兩條帶的強度對比確定．通過BamHⅠ酶切小鼠基因組DNA以確定轉基因是否被整合在基因組的唯一位點上．

依照上述同樣的實驗步驟，利用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切從teto?E2F3a小鼠系中提取的DNA．由PCR擴增E2F3a第七外顯子并用同位素標記作為探針進行雜交．如果小鼠轉基因成功，理論上會在膠片上看到長度為5．6 kb含E2F3a基因的內源性片段，和1．6 kb含有轉基因E2F3a外源片段．如同上述，轉基因整合位點的數量將由限制性切酶XbaⅠ消化所得的DNA片段和E2F3a第七外顯子同位素標記的探針雜交確定（圖1）．

1．2．6 轉基因小鼠品系的建立 初代首建小鼠將與純種FVB／N小鼠雜交以測試轉基因是否可被傳給下一代．由初代可通過遺傳傳遞的teto?E2F3a F1小鼠將與用ptTA2?4載體（Clontech）通過前述方法建立的轉基因UPII?rtTA系小鼠雜交．UPII?rtTA F1陽性的轉基因小鼠將與teto?Histone?GFP小鼠系雜交（JAX lab，USA）．將喂食含有Doxycycline（Doxycycline的作用是其必須與rtTA共同結合在teto操縱子上才可誘導teto下游克隆基因的表達）食物1，2月后的UPII?rtTA；teto?Histone?GFP小鼠按照實驗常規摘取所有組織和器官．摘取的組織和器官將即刻冷凍于液氮并包埋于OCT介質中．冷凍樣本切片后，通過Zeiss熒光顯微鏡檢測GFP在各組織中的表達以評估UPII?rtTA是否成功誘導的轉基因表達以及轉基因表達是否具有組織特異性．

2 結果

2．1 轉基因小鼠基因表型鑒定用特異引物對teto?E2F3a轉基因小鼠的基因組進行PCR擴增，發現6、10、11小鼠可擴增出大小約420 bp的條帶，與預期大小相符，表明獲得3只陽性首建鼠（圖2）．

圖2 teto?E2F3a轉基因小鼠基因表型分析（M為 marker，1～15為F0小鼠，N為陰性對照，P為陽性對照，H為空白對照）

2．2 熒光顯微鏡檢測GFP在膀胱組織中的表達

應用Zeiss熒光顯微鏡檢測GFP在F1代膀胱組織中的表達可見UPII?rtTA成功誘導E2F3a基因表達（圖3）．

圖3 熒光顯微鏡檢測F1代GFP在膀胱組織中的表達

2．3 teto?E2F3a基因表達的分析用Western Blot方法對其中2只首建鼠F1代及野生型小鼠、同窩陰性對照小鼠膀胱組織中E2F3a蛋白表達進行比較分析，發現2只首建鼠F1代膀胱組織中E2F3a蛋白表達明顯高于其他小鼠（圖4）．

圖4 膀胱組織中E2F3a蛋白表達（1為野生型對照小鼠；2，3為首建鼠 F1代；4，5為同窩陰性對照小鼠 β?actin43kDa E2F3a58kDa）

用Western Blot方法對其中1只首建鼠F1代肝、腎、膀胱、心臟、胃、脾臟、肺、骨骼肌組織中E2F3a蛋白表達進行比較，可見膀胱組織中表達明顯高于自身其他組織（圖5）．

圖5 F1代自身組織中E2F3a蛋白表達（1為肝、2為腎、3為膀胱、4為心臟、5為胃、6為脾臟、7位肺、8為骨骼肌 β?ac?tin43kDa E2F3a58kDa）

2．4 Doxycycline誘導表達系統與E2F3a蛋白表達

對轉基因小鼠按每日0．5g／kg劑量喂飼Doxycyc?line，作為正常對照（normal N），不喂飼 Doxycycline作為陰性對照，其余按1g／kg劑量喂飼Doxycycline作為實驗組，在喂飼1月、2月分別用Western Blot方法觀察E2F3a蛋白在膀胱中的表達，并進行對比分析，發現Doxycycline誘導表達系統可誘導E2F3a蛋白表達，E2F3a蛋白表達差異與Doxycycline喂飼量及喂飼時間相關（圖6、7），可見在適當的Doxycycline喂飼量下，能夠實現 Doxycycline誘導表達系統對E2F3a蛋白表達時間上的人為理想控制．

3 討論

基因修飾動物模型是人類疾病重要的動物模型，在認識基因功能、制作人類疾病動物模型、開展新藥評估、生產藥用蛋白等研發領域中具有重要支撐作用．建立腫瘤相關轉基因動物模型，目前是腫瘤研究熱點之一．膀胱癌是泌尿系統常見腫瘤，其發病率位居全身惡性腫瘤第6位，在我國泌尿系統腫瘤中，無論發病率或病死率膀胱癌均占首位［6］．由于膀胱癌的生物學行為具有很強異質性及不可預測性，易發生浸潤轉移，復發率高，臨床診治棘手［7］．阻止浸潤性膀胱癌的發生以及由低級別表淺型向高級別浸潤型惡性轉變過程是膀胱癌研究的重點．E2F3基因屬于E2F家族，定位于人體染色體6p22區域．既往研究發現在膀胱腫瘤中E2F3過表達，而且大約1／3浸潤性膀胱腫瘤的細胞浸潤早期階段就發現有E2F3過表達現象［8－9］．筆者在膀胱癌研究中觀察到E2F3的過表達，并且E2F3的高表達與浸潤性膀胱分級、分期相關［10］．膀胱癌以往的研究結果多為來自腫瘤細胞系、腫瘤組織標本等的靜態研究，由于體外和體內基因功能研究尚存在一定差異，體外基因功能研究往往不能夠完全模擬基因在體作用形式和機制，因此，建立表達或缺失特異目的基因的遺傳工程小鼠（geneti?cally modified mice，GMMs），整體動態觀察目的基因功能，是研究人類疾病發病機制、解答特定人群對某種疾病的易感性、識別藥靶、新藥篩選和療效判定等有效的手段．

圖6 喂飼Doxycycline 1月E2F3a蛋白在小鼠膀胱中的表達

圖7 喂飼Doxycycline 2月E2F3a蛋白在小鼠膀胱中的表達

小鼠uroplakinⅡ基因上游一段3．6 kb長的序列可引導癌基因在尿道上皮的特異性表達，通過膀胱上皮組織特異性uroplakinⅡ啟動子驅動位于第12密碼子突變的H?RAS等位基因而實現［11－12］．uroplakinⅡ啟動子可以特異性啟動SV40大T細胞抗原的表達，使p53和RB蛋白失活，導致小鼠產生膀胱CIS病變［13］．之后這些腫瘤進展成為侵襲性和轉移性的病變，且在組織病理學和分子生物學改變上與人類晚期膀胱癌類似．將該序列與誘導癌蛋白基因SV40T整合后構建出UPⅡ?SV40T嵌合基因，轉染小鼠可導致膀胱癌產生．四環素誘導表達系統是一種由tetra?cycline（tet）或四環素衍生物Doxycycline（Dox）參與調控的外源基因可控性表達體系，根據四環素操縱子的負調控原理，利用大腸埃希菌抗四環素操縱子的阻遏與去阻遏作用調控基因表達．由于該調控系統的調控原件源自原核生物，其調控元件不是真核細胞內源性的，和金屬離子誘導表達系統、熱激素低氧細胞因子等內源性的真核誘導表達系統相比，被誘導時不會影響真核細胞除目的基因之外的其他基因表達，并能實現基因表達時間上的人為控制，在研究特定基因與基因相關疾病動態關系方面優勢明顯［14］．活體成像技術采用熒光報告基團進行標記，研究者可動態觀察活體內特定基因表達的生物學過程，觀察腫瘤生長及轉移．綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是常見的熒光報告基團之一，是從水母體內提取出來的具有熒光性質的蛋白質，熒光性質穩定，在轉基因動物體內表達后不影響動物自身生物學特性，所得圖像資料客觀、及時、準確，較之組織化學方法受外界因素干擾小，在腫瘤研究中有重要價值．本實驗中E2F3a基因組織特異性表達通過組織特異性啟動子UropakinⅡ來實現，時間可控性通過喂食藥物Doxycycline來控制，并對E2F3a基因進行綠色熒光蛋白基團標記．建模成功后，可以在特定條件下觀察致癌因素在活體水平與膀胱癌發生、發展、惡化、轉移等疾病過程的關系，具有動態性、整體性、組織特異性、時間可控性等特點，便于篩選致癌因素和膀胱癌的相互關系．

盡管膀胱癌發生發展中一些十分重要的分子遺傳學因素已經得到了確認，但是目前膀胱癌發病機制的研究最大局限在于未能在活體內確認究竟是哪些遺傳學因素作用于膀胱腫瘤發生發展之中［15］．由于膀胱癌具有由表淺型向浸潤型、由低級別向高級別轉化的過程和現象，所以建立時間可控性、組織特異性小鼠膀胱癌模型對膀胱癌研究具有重要意義．運用具有組織特異性以及時間可控的方式誘導癌基因在特定組織表達，與人類疾病發展真實過程擬合度較高，為研究基因與基因相關疾病的動態關系創造了有利條件，在基因功能、疾病機理研究、藥效評價、藥物生產、治療靶點選擇等方面具有指導意義．

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Establishment of transgenic mouse models by controlling temporal and spatial expression of E2F3a

WANG Cheng?Yuan1，ZHANG Hai2，JIAO Yong1，ZHANG Bo1Fourth Military Medical University：1Department of Urology，Tangdu Hospital，2Laboratory Animal Center，Xi'an 710038，Shanxi Province，China

AIM：To study the dynamic processes of transgenic mouse models by controlling temporal and spatial expression of E2F3a，discuss how to establish an appropriate animal model of bladder cancer．METHODS：The binary transgenic mouse models were constructed．One was a spatial?specific promoter，and the other was an artificially controlled temporal expressing model using Doxycycline system．RESULTS：The binary transgenic mouse was produced by crossing with transgenic mouse，and an induced expression of E2F3a in bladder cells can be controlled by administering with Doxycycline．CONCLUSION：Temporal and spatial expression of E2F3a in bladder cells can be controlled artificially by using UropakinⅡpromoter and Doxycycline system，the mouse model has been successfully established in this study．

transgenic；model；animal；cancer

Q78

A

2095?6894（2017）02?21?05

2017－01－06；接受日期：2017－01－20

國家自然科學基金（31272391）

王程遠．碩士．研究方向：泌尿系腫瘤基礎與臨床．E?mail：chengyuandoctor＠163．com

張 波．副主任醫師，副教授．Tel：029?84777728 E?mail：zhangbo＠fmmu．edu．cn