苯并硫雜蒽衍生物對人宮頸癌細胞作用的拉曼光譜研究

徐 寧，董瑩瑩，魏船河，徐 玲(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

苯并硫雜蒽衍生物對人宮頸癌細胞作用的拉曼光譜研究

徐 寧，董瑩瑩，魏船河，徐 玲
(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

苯并硫雜蒽衍生物是一種可特異性與細胞核內DNA結合誘導人宮頸癌細胞(Hela細胞)凋亡的靶向小分子化合物.為了理解該靶向小分子化合物對Hela細胞的作用機制，從分子水平區(qū)分經(jīng)小分子處理和未經(jīng)處理的Hela細胞，將苯并硫雜蒽衍生物和HeLa細胞共培養(yǎng)24 h后觀察細胞的拉曼光譜變化.結果表明：苯并硫雜蒽衍生物作用24 h后，HeLa細胞代表蛋白質的主鏈和側鏈、核酸、脂類的拉曼譜帶都發(fā)生了一定的改變，經(jīng)不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理的細胞拉曼光譜間有顯著區(qū)別，其中1.6 μmol/L組尤其明顯.

苯并硫雜蒽衍生物；人宮頸癌細胞；拉曼光譜

Hela細胞是人宮頸癌細胞株，已被廣泛運用于抗腫瘤化合物的篩選.苯并硫雜蒽類分子在其母體結構引入烷氨基側鏈后，是一類水溶性好、細胞毒性低和抗腫瘤活性強的小分子化合物，具有靶向細胞核內DNA，誘導腫瘤細胞包括Hela細胞凋亡的作用[1].雖然當前用來研究細胞凋亡分子機制的主要手段是流式細胞術和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡，但該方法制備樣本過程繁瑣，需要熒光標記抗體或熒光標記探針并長時間與細胞反應，因此在細胞凋亡或其他細胞的行為等分子機制研究中的應用受到一定的限制.而拉曼光譜分析由于它的非破壞性、高度敏感性等優(yōu)點，在提供分子生化信息組成、相互作用和細胞中的結構生理條件等方面，已經(jīng)成為一個有用的工具.拉曼光譜也是分析生物材料中蛋白質、核酸、脂類以及碳水化合物等大分子結構變化的有力手段.拉曼光譜特征峰的強度、峰寬和位置可提供分子振動、轉動等信息，反映分子中不同的化學鍵或官能團[2].

為了探究拉曼光譜區(qū)分苯并硫雜蒽衍生物處理與未處理Hela細胞的可行性，在分子層面上探討其對Hela細胞誘導凋亡的作用機理，為抗癌藥物的篩選提供一種新方法和新思路，筆者對苯并硫雜蒽衍生物處理24 h后的Hela細胞進行了拉曼光譜特性研究.

1 材 料

1.1 化合物及細胞來源

苯并硫雜蒽衍生物由浙江工業(yè)大學張文教授實驗室合成贈送，分子量424.10；細胞培養(yǎng)基RPMI-1640購自吉泰生物科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司.

N-(N′-N′-二甲胺基丙基)苯并[k,l]硫雜蒽-3,4-二甲酰亞胺鹽酸鹽(N-(3-(dimethylamino)propyl)benzo[k,l]thioxanthene-3,4-dicarboximidehydrochloride)，化學式C23H21N2O2ClS+，由浙江工業(yè)大學化學生物學實驗室合成，結構式為

1.2 顯微共聚焦拉曼光譜儀

Renishawinvia Reflex型拉曼光譜儀自帶顯微鏡，使用標準陣列CCD探測器，Ar+為光源.WiRE 3.2軟件獲取光譜.

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

Hela細胞接種至裝有1640培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS))的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng).對數(shù)生長期的細胞用質量分數(shù)為0.25%的胰酶消化為單個細胞并轉移至六孔板，每孔接種5×105個細胞爬片.24 h后每孔分別加入0.4，0.8，1.6，4.0 μmol/L的苯并硫雜蒽衍生物，同時設置不加任何化合物的空白對照組.培養(yǎng)24 h后吸去上清，用PBS緩沖液洗滌兩次，加入體積分數(shù)為75%的酒精固定爬片細胞30 min，-20 ℃保存待測.

2.2 苯并硫雜蒽衍生物溶液的制備

取4.5 mg苯并硫雜蒽衍生物溶解于1 059 μL二甲基亞砜(DMSO)中，超聲微熱使樣品完全溶解，得到10 mmol/L的化合物儲存液，-20 ℃保存.處理細胞時，將苯并硫雜蒽衍生物用DMSO稀釋至所需濃度.

2.3 拉曼光譜檢測與數(shù)據(jù)分析

激發(fā)波長514 nm，物鏡50×，功率25 mW，曝光10 s，累積2次，掃描范圍為400～3 200 cm-1.將固定有細胞的載玻片置于鏡下，調整焦距將聚焦點對于細胞處.選取形態(tài)正常的Hela細胞，取細胞內任意三點獲取光譜并進行平均，每個濃度組重復選擇10個以上細胞檢測.

實驗所得的數(shù)據(jù)使用Labspec 5或wire 3.2軟件進行處理(光滑、去基底、歸一化等).origin軟件畫圖.所有光譜扣除苯并硫雜蒽衍生物所產生的熒光本底.

3 結果與分析

3.1 掃描區(qū)域以及拉曼光譜原始圖

酒精固定好的Hela細胞爬片經(jīng)顯微拉曼光譜檢測，對照組和經(jīng)1.6 μmol/L苯并硫雜蒽衍生物作用24 h后的實驗組Hela細胞的顯微圖像及拉曼光譜如圖1所示.

圖1 Hela細胞顯微圖像及其拉曼原始譜圖Fig.1 The Hela cells and their Raman original spectrum

3.2 拉曼光譜數(shù)據(jù)的處理

Wire軟件可自動或手動調平所得拉曼光譜基線，以利于互相比較.在檢測時，由于宇宙射線等原因造成原始拉曼光譜出現(xiàn)鬼峰，都用軟件去除，結果如圖2所示.

1—原始拉曼光譜；2—調基線；3—去除鬼峰圖2 拉曼原始譜預處理Fig.2 The Raman spectrum preprocessing

3.3 400～1 800 cm-1拉曼光譜峰的解析

3.3.1 不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理后的Hela細胞拉曼光譜

由于細胞在1 800 cm-1之后有很長一段拉曼光譜無反應區(qū)，這一部分的拉曼光譜隨著苯并硫雜蒽衍生物濃度的增加，熒光本底以及干涉條紋的干擾明顯增強.因此我們截取了400～1 800 cm-1部分進行分析，這一區(qū)域豐富的拉曼峰代表核酸、蛋白質以及脂類的信息.不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理后的Hela細胞拉曼光譜如圖3所示.

圖3 不同組別Hela細胞拉曼光譜(514 nm, 350～1 750 cm-1)Fig.3 The Raman spectrum of different groups(514 nm,350～1 750 cm-1)

3.3.2 拉曼峰歸屬

Hela細胞的拉曼光譜峰歸屬見表1.

表1 HeLa細胞的拉曼光譜峰歸屬Table 1 The Raman spectra peaks assigment of Hela cells

3.3.3 譜帶分析

1) 核 酸

2) 氨基酸與蛋白質

如圖4所示，570 cm-1的譜線未發(fā)生移動，但強度降低.根據(jù)既往文獻，相同分子振動能量結構產生不同的散色光，不同濃度的化合物可改變色氨酸的分子振動能量結構[13]，提示高濃度的苯并硫雜蒽衍生物破壞了Hela細胞的部分分子振動能量結構.在1 004 cm-1的位置上呈現(xiàn)的尖銳強峰代表苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)，經(jīng)苯并硫雜蒽衍生物作用后未發(fā)生頻移，說明Hela細胞中苯丙氨酸對苯并硫雜蒽衍生物不敏感.

位于1 231 cm-1的拉曼譜峰歸屬于酰胺III β-折疊結構，1 662 cm-1的拉曼譜峰歸屬于酰胺I無規(guī)則卷曲結構.加入苯并硫雜蒽衍生物后，兩個譜峰的位置未發(fā)生明顯變化，但強度增加，尤其是加入1.6 μmol/L的苯并硫雜蒽衍生物后譜峰的強度最高.說明經(jīng)苯并硫雜蒽衍生物處理后，細胞內蛋白質二級結構無規(guī)則卷曲結構和β-折疊結構比例上升，1.6 μmol/L組的改變效果最明顯.1 484 cm-1的譜峰屬于酰胺II，苯并硫雜蒽衍生物處理后譜峰強度下降，當濃度達到1.6 μmol/L時，此譜峰消失，說明高濃度的苯并硫雜蒽衍生物破壞了蛋白質酰胺II結構.

圖4 苯并硫雜蒽衍生物濃度對拉曼峰強度的影響Fig.4 The influence of Benzothioxanthene derivatives concentration on Raman peak intensity

和對照組相比，低濃度處理組細胞中1 336 cm-1(色氨酸)的譜線發(fā)生藍移，當苯并硫雜蒽衍生物濃度增加時，譜線消失，說明該小分子破壞了色氨酸的結構.

綜上所述，苯并硫雜蒽衍生物作用于Hela細胞后，拉曼光譜所展示的細胞凋亡過程主要體現(xiàn)在細胞內DNA結構的變化，而細胞內部分蛋白質含量的增加大多是因為細胞凋亡過程中細胞質中的生物化學過程、細胞容積和細胞膜發(fā)生相應的變化導致的[14].

4 結 論

當前拉曼光譜在醫(yī)學上已被用于對各種細胞，尤其是腫瘤細胞的研究.一方面，從細胞測定的拉曼光譜可以推測發(fā)生改變的基團，分子相互作用的位置與模式等；另一方面，由于拉曼光譜對物質分子結構、構象以及它們所處的環(huán)境很敏感，可從分子水平深入地研究其構象變化和相互作用的過程.不同濃度組苯并硫雜蒽衍生物作用于Hela細胞后，細胞中蛋白質的主鏈、側鏈、核酸和脂類的譜帶都發(fā)生了一定的改變，譜帶變化復雜.其中經(jīng)1.6 μmol/L苯并硫雜蒽衍生物處理的Hela細胞變化最為明顯.應用拉曼光譜研究苯并硫雜蒽衍生物對細胞的影響操作方便，樣品無需特殊處理，有助于我們理解探討化合物與腫瘤細胞的凋亡作用的分子機理，更可望發(fā)展為一種新的篩選化合物活性的有效方法.

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(責任編輯：朱小惠)

Raman spectra analysis of Hela cell treated by benzothioxanthene derivatives

XU Ning, DONG Yingying, WEI Chuanhe, XU Ling
(College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Benzothioxanthene derivatives could bind specifically to the nucleus DNA and induced apoptosis of human cervical cancer cells (Hela cells). In order to explore the mechanism of interaction, a method is established to distinguish HeLa cells which is either treated or untreated by benzothioxanthene derivatives. Changes in Raman spectrum of HeLa cells were observed after 24 hours treated by benzothioxanthene derivatives. Results indicated that after 24h treated by benzothioxanthene derivatives, Raman spectrum of HeLa cells have changed, including the bands of protein backbone, side chain, nucleic acids and lipids. There are significant differences in Raman spectra of cells of different groups, especially the spectrum of the group of 1.6 μmol/L.

benzothioxanthene derivatives; human cervical cancer cells; Raman spectra

2016-03-05

浙江省科技計劃分析測試項目(2014C37075)

徐 寧(1973—)，女，浙江湖州人，副研究員，博士，研究方向為光子生物學，E-mail：xuning@zjut.edu.cn.

O657.3

A

1006-4303(2017)02-0206-04