新型分散液液微萃取-GC/MS檢測水中三唑類農殘

李祖光，宋志宇，勞家正，聶 晶，葉靜青，韋其真，倪 琳，鄧豐濤(.浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州 3004;.聚光科技(杭州)股份有限公司,浙江 杭州 3005)

新型分散液液微萃取-GC/MS檢測水中三唑類農殘

李祖光1，宋志宇1，勞家正1，聶 晶1，葉靜青1，韋其真1，倪 琳1，鄧豐濤2
(1.浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州 310014;2.聚光科技(杭州)股份有限公司,浙江 杭州 310052)

建立了一種基于冒泡輔助的新型分散液液微萃取技術結合GC-MS用于測定水中的四種三唑類殺菌劑的分析測試方法.以低密度的甲苯作為萃取劑，替代了具有一定毒性的鹵代烷烴萃取劑；通過磷酸二氫鈉粉末和無水碳酸鈉粉末在水溶液中反應產生CO2的方式進行破乳，取代傳統的離心破乳.對影響萃取結果的影響因素進行了優化，在最優條件下，腈菌唑、戊唑醇、氟環唑和苯醚甲環唑的檢出限分別為0.024，0.011，0.014，0.012 μg/L，富集倍數為866～1 226.加標回收率在86.7%～115.8%之間，RSD(n=7)在9.93 %～17.28 %之間.實驗結果表明：冒泡輔助分散液液微萃取技術是一種簡便、高效、相對綠色環保且具有現場分析潛力的樣品前處理方法，已成功應用于自來水中三唑類殺菌劑殘留的分析.

冒泡破乳；分散液液微萃取；三唑類農藥；低密度萃取劑；氣相色譜-質譜法

農藥的使用在保障農作物豐產方面做出了重大貢獻，但如果農藥使用不當，則會對環境和農作物造成污染，影響食品和生態安全.隨著人們生活水平的提高和對農藥殘留危害意識的增強，農藥殘留的分析日益成為社會關注的熱點.三唑類農藥是一類新型的殺菌劑，不僅具有殺菌的作用，還具有調節植物生長的作用，目前在蔬菜、水果等生產中得到廣泛地應用[1]；三唑類殺菌劑是抑制銹病、白粉病、胡麻葉斑病和灰心斑病的常用農藥[2-3].隨著三唑類農藥越來越廣泛的使用，在食物和水體中已經發現三唑類農藥殘留，三唑類農藥對生態系統和人類健康的毒害作用也越來越受到關注[4-6].因此，迫切需要建立一種簡便快速，高效和綠色環保的三唑類農藥殘留分析方法應用于食品安全和環境監測.目前，對三唑類殺菌劑的檢測已經有了一些報導.例如固相萃取[7-9]，固相微萃取[10-11]等.分散液-液微萃取是一種快速、簡單的分析方法，它只需使用微量的有機萃取劑即能獲取良好的萃取結果，并用于三唑類農藥殘留的分析，例如超聲輔助乳化微萃取[12]，均質液-液萃取[13]，空氣輔助液-液微萃取[14]，硅烷化萃取容器-分散液液微萃取[15]等.

針對傳統分散液-液相微萃取技術進行改進，建立了一種快速簡便、環境友好的“冒泡輔助分散液-液微萃取”方法，結合GC-MS用于水中三唑類農殘的分析檢測.該方法使用粉末狀的CO2源(無水Na2CO3)和質子源(NaH2PO4)混合后在水中反應生成極為微小和均勻的二氧化碳氣泡，低密度的甲苯萃取劑能夠附著在氣泡上完成對三唑類農藥目標物的萃取，從而達到從水體中萃取和富集三唑類農藥的目的.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GC 2000-Mars 6 100氣相色譜-質譜聯用儀(配有電子轟擊離子源(EI))，聚光科技(杭州)股份有限公司；AL 204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SY-360型超聲波清洗器，上海寧商超聲儀器有限公司；自制分散液相微萃取玻璃裝置.

腈菌唑(99.5%)、戊唑醇(98.5%)、氟環唑(99.5%)和苯醚甲環唑(98.5%)標準試劑購自Dr. Ehrenstorfer GmbH(德國，奧格斯堡).甲苯、正己烷、環己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇和丙酮，均為分析純，采購自杭州華東醫藥股份有限公司；無水碳酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉和無水硫酸鈉采購自上海試四赫維化工有限公司；超純水，美國Millipore公司.

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

毛細管色譜柱：Rxi-5 MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度為180 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升至220 ℃，最后以10 ℃/min升至290 ℃，保持6 min.高純氦氣(99.999%)為載氣，流速為1.0 mL/min；進樣口溫度：280 ℃；不分流進樣；進樣量：1.0 μL；0.75 min后以20 mL/min進行載氣吹掃.

1.2.2 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子阱溫度180 ℃；歧管溫度為50 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描速度為3 scans/s，溶劑延遲3 min.采用SIM模式掃描：1) 腈菌唑3～15.5 min：179m/z，152m/z；2) 戊唑醇15.5～18.43 min：125m/z，250m/z；3) 氟環唑：18.43～20 min：192m/z，138m/z；4) 苯醚甲環唑20～29.0 min：265m/z，323m/z.

1.3 樣品前處理方法

1) 自來水樣處理：取杭州市下城區自來水,經0.22 μm過濾器過濾后備用.

2) 萃取步驟：將55 μL甲苯和2.2 mL乙腈混合均勻后，加入20.0 mL水樣后搖勻3 min成為奶白色的乳化溶液.準確稱取2.640 g磨成粉末狀的磷酸二氫鈉和1.060 g無水碳酸鈉，混勻，裝入自制分散微萃取裝置底部.然后，再將上述乳化溶液倒入該分散微萃取裝置;隨后反應立即開始，大量細小的二氧化碳氣泡從水體中冒出并夾帶著甲苯聚集在水的表面，隨著反應的進行，溶液逐漸澄清；待反應結束完成后，向細長管處加入去離子水抬高液面，接著用微量進樣針從窄頸取出上層甲苯有機層，轉移至裝有少量無水硫酸鈉的0.5 mL PCR管中，除去有機相中含有的微量水分.最后，用另一支進樣針抽取1 μL有機相注入GC-MS中進行檢測分析.萃取過程如圖1所示.

圖1 EA-DLLME萃取流程圖Fig.1 Schematic of triazoles extraction from tap water by EA-DLLME

2 結果與討論

2.1 EA-DLLME實驗條件優化

2.1.1 CO2源和質子源的選擇

采用無水碳酸鈉和碳酸氫鈉作為CO2源，質子源采用檸檬酸和磷酸二氫鈉，分別兩兩組合進行了四組優化實驗，保持每次生成的CO2體積相同.結果表明：當檸檬酸作為質子源時，冒泡反應比磷酸二氫鈉作為質子源時更劇烈，產生的氣泡更大，但萃取效果卻比磷酸二氫鈉差；CO2源選用碳酸鈉的萃取效果優于碳酸氫鈉，所以最終選擇無水碳酸鈉作為CO2源和磷酸二氫鈉作為質子源.

2.1.2 質子源與CO2源配比的優化

在質子源與CO2源粉末按摩爾比完全反應的基礎之上，分別進行質子源粉末過量10%(酸性)、CO2源粉末過量10%(堿性)的優化實驗.即：660.0 mg的NaH2PO4對應265.0 mg的Na2CO3，600.0 mg的NaH2PO4對應291.5 mg的Na2CO3，600.0 mg的NaH2PO4對應265.0 mg的Na2CO3的對照試驗，平行實驗兩次，結果如圖2所示.實驗結果表明質子源粉末過量10%時萃取效率更佳.

A—質子源過量10%;B—CO2源過量10%;C—化學計量比圖2 質子源與CO2源配比的優化Fig.2 The radio of proton source and carbon dioxide

2.1.3 CO2的量(粉末加入量)的優化

為了考察CO2的生成量對萃取結果的影響，選擇適量的粉末分別產生1，2，3，4，5 mol的CO2氣體量，即無水硫酸鈉的質量為265，530，795，1 060，1 325 mg，對應的磷酸二氫鈉分別為660，1 320，1 980，2 640，3 300 mg，進行實驗考察.結果如圖3所示，CO2氣體量在4 mol時萃取結果最優.當粉末的加入量越多，生成的CO2氣體越多，有利于破乳，但是加入過多粉末時，會使得溶液的離子強度和粘度增加，而影響萃取效率.

圖3 CO2量的優化Fig.3 The optimization of the amount of carbon dioxide

2.1.4 萃取劑和分散劑的選擇

萃取劑在分散液液微萃取過程中直接影響目標物的萃取效率.采用甲苯(ρ=0.87 g/mL)、環己烷(ρ=0.78 g/mL)、正己烷(ρ=0.66 g/mL)三種低密度溶劑作為萃取劑進行優化.其中，三種萃取劑在收集到相同體積上層(15±1) μL時所用體積分別為甲苯60 μL，正己烷70 μL，環己烷90 μL.綜合考慮萃取劑的用量及萃取效率，選擇甲苯作為后續實驗的萃取劑.

分散劑的選擇將直接影響“萃取劑/分散劑/水”三相乳濁液體系的形成，間接影響萃取的結果.考察了甲醇、丙酮和乙腈四種溶劑作為分散劑，在體積均為2 mL時分別進行實驗，結果如圖4所示.由圖4可知：當采用乙腈為分散劑時，萃取效率最高.

圖4 分散劑的選擇Fig.4 The selection of dispersant

2.1.5 萃取時間的優化

在EA-DLLME方法中，萃取時間是指水相溶液/萃取劑/分散劑三相體系從混合開始到冒泡反應破乳結束后所需要的時間.對萃取時間進行優化，以提高方法的效率.選擇萃取時間分別為1，2，3，4，5 min，比較萃取效率受萃取時間的影響，結果見圖5.由圖5可知：在3 min前，三唑類農藥的萃取率隨著萃取時間增加而增加，這是因為這一階段萃取時間過短，乳化作用不充分；當萃取時間大于3 min以后，萃取率下降，這是因為萃取時間過長會導致甲苯有機相的揮發損失.因此綜合考慮，選擇萃取時間為3 min.

圖5 乳化時間的優化Fig.5 The optimization of emulsification time

2.1.6 萃取劑和分散劑體積的選擇

萃取劑的用量與萃取效率和富集倍數直接相關，適當減少萃取劑的用量，可獲得更高的富集倍數，但同時需確保上層有機相有足夠的體積以便于收集.考察了萃取劑甲苯體積分別為50，55，60，65 μL時對萃取結果的影響.當萃取劑體積為50 μL時，所得到的上層有機相的量過少，不方便收集；當甲苯體積大于55 μL時，富集倍數隨著萃取劑體積的增加而下降.綜合考慮，甲苯體積為55 μL時最優.

為選擇最優的分散劑體積，設置五個不同水平(1.6，1.8，2.0，2.2，2.4 mL)進行實驗.實驗結果：2.2 mL時萃取效果最好，因此最后選擇2.2 mL作為分散劑體積.

2.2 標準曲線與檢出限

采用4種三唑類殺菌劑質量濃度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L的加標自來水為研究對象，在已優化好的條件下進行測定分析，以三唑的峰面積的比值(y)對質量濃度(x)做線性回歸方程，平行測定3次，得出線性回歸方程和相關系數，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)作為定性檢出限(LODs)和定量檢出限(LOQs)，結果見表1.四種三唑類殺菌劑的線性范圍為0.2～100 μg/L，相關系數為0.986 6～0.995 3，定性檢出限和定量檢出限分別為0.011～0.024，0.038～0.077 μg/L.為了測定該方法的相對標準偏差，本實驗選取其中一組加標質量濃度為100 μg/L的加標自來水平行測定7次，得到的RSD%值為9.93%～17.28%，富集倍數為866～1 226.

2.3 回收實驗

選用空白自來水為基質，加入不同質量濃度水平的三唑類殺菌劑標準溶液，加入質量濃度為0.2，10.0，100.0 μg/L，按優化后實驗條件進行測定分析，平行測定5次，得到相應的回收率和精密度，結果見表2.

表1 四種三唑的線性范圍、檢出限、定量限和相對標準偏差Table 1 LODs, LOQs, liner range and RSDs of four triazoles

注：1) 以100 μg/L加標自來水計算得到(n=7).

表2 回收率試驗結果(n=5)Tab.2 Results of tests for recovery

2.4 真實樣品分析

采用該方法檢測自來水樣品，以驗證方法的實用性.在最優條件下，對自來水樣品進行分析，自來水樣品中沒有測出這四種三唑類殺菌劑,自來水樣品的總離子流色譜圖(圖6)，自來水加標溶液(質量濃度10 μg/L)的總離子流色譜圖(圖7)以及加標溶液(10 μg/L)二次加標質量濃度10 μg/L后(即20 μg/L)的總離子流色譜圖(圖8).

圖6 自來水空白樣品的總離子流色譜圖Fig.6 The TIC of the unspiked tap water sample

1—腈菌唑；2—戊唑醇；3—氟環唑；4—苯醚甲環唑圖7 自來水加標溶液(10 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.7 The TIC of the spiked tap water sample with 10 μg/L of triazoles

1—腈菌唑；2—戊唑醇；3—氟環唑；4—苯醚甲環唑圖8 自來水加標溶液二次加標質量濃度的總離子流色譜圖Fig.8 The TIC of the second spiked tap water sample with 20 μg/L of triazoles

3 結 論

提出了粉末冒泡破乳-分散液液微萃取的分析方法，并成功用于自來水中三唑類農藥的測定.實驗采用自制萃取裝置，可重復利用，經濟環保；使用密度小于水的甲苯為萃取劑代替傳統分散液-液微萃取中高密度的鹵代烷烴萃取劑，降低了對環境和人體的危害；在無需離心機、超聲儀等試驗設備的條件下對目標物進行富集.該方法具有重復性好，富集倍數高，檢測限低，回收率和精密度良好，具有水樣現場分析潛力等優點，已成功應用于自來水樣的檢測.

本文得到了浙江工業大學2016年校級大學生創新創業訓練計劃項目(2016101011124)的資助.

[1] 周子燕，李昌春，高同春，等.三唑類殺菌劑的研究進展[J].安徽農業科學，2008，36(27)：11842-11844.

[2] 周炳，趙美蓉，黃海鳳.4種農藥對斑馬魚胚胎的毒理研究[J].

浙江工業大學學報，2008，36(2)：136-140.

[3] 汪愛娟，戴德江，李阿根，等.茭白胡麻斑病藥劑防治技術研究[J].中國植保導刊，2016，36(1)：68-70.

[4] RIJK E P C D，HAFMANS W T M，ESCH E V V. Multifocal ductal cell hyperplasia in the submandibular salivary glands of wistar rats chronically treated with a novel steroidal compound[J].Journal of toxicologic pathology，2003，31(1)：1-9.

[5] 馮碩立，徐明仙，高偉亮，等.超臨界色譜拆分6種唑類手性農藥[J].浙江工業大學學報，2011，39(4)：424-428.

[6] NESNOW S，WARD W，MOORE Y，et al.Discrimination of tumorigenic triazole conazoles from phenobarbital by transcriptional analyses of mouse liver gene expression[J].Toxicological sciences，2009，110(1)：68-83.

[7] 曹慧，林珍珍，陳小珍，等.固相萃取-氣相色譜/三重四極桿質譜法同時分析蔬菜中的50種農藥殘留量[J].浙江工業大學學報，2012，40(3)：280-283.

[8] BOLYGO E，ATREYA N C.Solid-phase extraction for multi-residue analysis of some triazole and pyrimidine pesticides in water[J].Fresenius iouranl analytical chemistry，1991，339(6)：423-430.

[9] LI J，DONG F，XU J，et al.Enantioselective determination of triazole fungicide simeconazole in vegetables, fruits, and cereals using modified QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) coupled to gas chromatography/tandem mass spectrometry[J].Analtica chimica acta,2001,702(1):127-135.

[10] BODAGARAY A，GARCIA-ARRONA R，MILLAN E.Optimization of solid-phase microextraction procedure coupled to GC-ECD for triazole fungicides determination in juice samples food[J].Analytical methods，2011，4(3)：293-299.

[11] BODAGARAY A，GARCIA-ARRONA R，MILLAN E.Development and application of a screening method for triazole fungicide determination in liquid and fruit samples using solid-phase microextraction and HPLC-DAD[J].Analytical methods，2013，5(10)：2565-2571.

[12] BODAGARAY A，GARCIA-ARRONA R，MILLAN E.Determination of triazole fungicides in liquid samples using ultrasound-assisted emulsification microextraction with solidification of floating organic droplet followed by high-performance liquid chromatography[J].Food analytical methods，2014,7(6)：1195-1203.

[13] FARAJZADEH M A，MOGADDAMA M R A，GHORBANPOURB H.Development of a new microextraction method based on elevated temperature dispersive liquid-liquid microextraction for determination of triazole pesticides residues in honey by gas chromatography-nitrogen phosphorus detection[J].Journal of chromatography A，2014，1347(15)：8-16.

[14] FARAJZADEH M A，KHOSHMARAM L.Air-assisted liquid-liquid microextraction-gas chromatography-flame ionisation detection: a fast and simple method for the assessment of triazole pesticides residues in surface water, cucumber, tomato and grape juices samples[J].Food chemistry，2013，141(3)：1881-1887.

[15] FARAJZADEH M A，BAHRAM M，JAFARY F，et al.Combination of Extraction by silylated vessel-dispersive liquid-liquid microextraction as a high-enrichment factor technique: Optimization and application in preconcentration of some triazole pesticides from aqueous samples followed by GC-FID determination[J].Chromatographia，2011，73：393-401.

(責任編輯：陳石平)

Determination of triazole pesticides combining effervescence-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry

LI Zuguang1, SONG Zhiyu1, LAO Jiazhen1, NIE Jing1, YE Jingqing1, WEI Qizhen1, NI Lin1, DENG Fengtao2
(1.College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.Focused Photonics Inc., Hangzhou 310052, China)

A novel method of effervescence-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(EA-DLLME)coupled with GC-MS was proposed for the determination of four triazoles in tap water. This method adopted toluene with low-density as extractant and the self-generating carbon dioxide which was produced by powder of sodium dihydrogen phosphate and anhydrous sodium carbonate as demulsification. Under the optimized conditions, the limits of detections ranged from 0.011 μg/L to 0.024 μg/L. Enrichment factors were between 866～1 226. Meanwhile the recoveries were at the range of 86.7%～115.8%, and RSDs were at the range of 9.93%～17.28%. The simple, efficient, and environmentally friendly method was successfully applied todetermine triazole in real waters.

effervescence-assisted; dispersive liquid-liquid microextraction; triazole pesticides;low-density extractant ;gas chromatography-mass spectrometry

2016-09-21

浙江省自然科學基金資助項目(LY16B050008)；浙江省科技廳公益項目(2015C32006)；國家重大科學儀器設備開發專項(2013YQ13042908)

李祖光(1971—)，男，江西上饒人，教授，博士生導師，主要從事分析化學、應用化學和農藥學等研究，E-mail: lzg@zjut.edu.cn.

O657.63

A

1006-4303(2017)02-0190-05