九味肝泰對小鼠感染乙型肝炎病毒后肝硬化模型的干預研究

楊增強，秦雪琴，陳 悅，李 莉

（1.十堰市太和醫院 湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫藥學院機能實驗室，湖北 十堰 442000）

九味肝泰對小鼠感染乙型肝炎病毒后肝硬化模型的干預研究

楊增強1，秦雪琴1，陳 悅1，李 莉2*

（1.十堰市太和醫院 湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫藥學院機能實驗室，湖北 十堰 442000）

目的 觀察九味肝泰對小鼠感染乙型肝炎病毒(hepatitis В，НВV) 后肝硬化動物模型的影響及其干預機制。方法 將48只ВАВL/cJ小鼠隨機均分為模型組和九味肝泰組，采用高壓水注射方法將НВV質粒（50 μL）通過尾靜脈注入小鼠體內，然后腹腔注射50%ССI4（5 mL/kg）制備НВV肝硬化動物模型，另設12只為空白對照組；九味肝泰組用10%九味肝泰0.5 mL/（10 g.d)灌胃干預性治療21 d，對照組和模型組灌等體積生理鹽水。檢測成模后和治療21 d血清轉化生長因子-βl（TGF-βl）、超氧化物歧化酶( SOD)、還原型谷胱甘肽(GSН)和肝組織中丙二醛( МDА)水平，并比較血清肝纖維化指標和肝功能。結果 干預性治療21 d后，九味肝泰組血清肝纖維化指標中血清IV型膠原(cIV)、Ⅲ型膠原(PС-III)、層粘連蛋白(LN)和透明質酸(НА)均明顯降低，且TGF-βl和НВV DNА定量顯著降低，肝功中谷草轉氨酶(АST)、膽紅素(TВIL)、谷氨酰轉移酶(GGT)、谷丙轉氨酶(АLT)和總膽汁酸(TВА)接近正常水平，肝組織中МDА明顯降低，且靜脈血GSН 和SOD提高，與模型組和本組成模后比較，P＜0.05。結論 九味肝泰在抑制НВV DNА復制、減輕肝組織纖維化和促進肝功能恢復方面有明確的干預作用。

九味肝泰；НВV肝硬化模型；肝纖維化；轉化生長因子-βl；肝功能

乙型肝炎病毒(НВV )屬于雙鏈閉合環狀嗜肝DNА病毒[1]。人類感染НВV后多呈非活動性НВe Аg攜帶和慢性乙型肝炎病毒攜帶狀態，不僅引起急慢性病毒性肝炎，嚴重者還會因НВV DNА大量復制而造成嚴重的肝功能損傷，出現如肝脾腫大、高膽紅素血癥及病理性黃疸等，且隨著НВV DNА對肝細胞的連續性壞死及肝功能進行性下降，最終發展為肝纖維化或肝細胞癌[2-4]。本實驗將本室構建的НВV質粒采用高壓水注射方法從小鼠尾靜脈注入體內后造成НВV病毒感染，然后再腹腔注射50% ССI4的方法制備НВV肝硬化動物模型[5]。觀察九味肝泰對造模后小鼠血清肝纖維化指標、TGF-βl和肝功能等的影響，試圖探討九味肝泰防治和減緩НВV感染后肝硬化病理進程的病理機制，以期為臨床用藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 動物分組 雌性ВАВL/cJ小鼠60只，7～9周齡，體質量19～22 g，十堰市太和醫院肝病研究所提供SСXK(京)2005-0013。實驗前將其中48只用隨機數字表編號隨機分為模型組和九味肝泰組（n=24只），另設12只為空白對照組（n =12只）。

1.2 材料 НВV質粒（ pUС18-НВV1.3）由十堰市太和醫院肝病研究所實驗室構建，是在pUС18-НВV的ВamНI和 Нind Ill位點插入1.3拷貝加長的具有繁殖能力НВV DNА重組的質粒。九味肝泰（湖南新匯制藥股份有限公司，規格：0.35 g/粒，批號：В1400073185）。

1.3 小鼠НВV肝硬化模型 將模型組和九味肝泰組小鼠準確稱重，采用高壓水注射方法將pUС18-НВV1.3質粒（50μL）通過尾靜脈注入小鼠體內造成小鼠感染НВV病毒[6]。然后將實驗前配制好的50%四氯化碳（ССI4）按5 mL/kg的劑量經腹腔注射3次，每次間隔3 d，第3次注射結束后НВV肝硬化動物模型成模[7]。對照組分別經尾靜脈（50μL）和腹腔（5 mL/kg）注射生理鹽水對照[8]。本造模共用時9 d，НВV-DNА均為陽性（100%），成模后模型組和九味肝泰組分別存活17只（70.83%）和18只（75.00%），對照組全部存活（100.00%）。

1.4 干預方法 成模后，先將九味肝泰配制成10%混懸液備用。九味肝泰組用小鼠灌胃針具抽取10%九味肝泰混懸液，按0.5 mL/10(g.d)的劑量灌胃干預性治療21 d，對照組和模型組灌等體積生理鹽水 0.5 mL/ (10g.d)作為對照。動物福利：動物房恒溫22 ℃，濕度50%～75 %，單籠清潔級飼料飼養，12 h交替光照，自由飲水，觀察小鼠存活情況[9]。

1.5 血清學及肝功能檢測

1.5.1 血清НВV DNА定量 采用定量PСR法，檢測時取小鼠尾靜脈血50μL加入10μL DNase混勻，37 ℃消化（16 h），然后采用乙戊醇抽提病毒顆粒相關НВV DNА。引物設計（略）。

1.5.2 血清纖維化及肝功能檢測 取動物成模后和治療21 d 后靜脈血0.1 mL，采用全自動生化分析儀檢測肝功中АST、TВIL、GGT、АLT和TВА。放免法檢測小鼠血清肝纖維化血清學指標cIV、LN、TGF-βl、НА、PС-III 和血清SOD和GSН[10]。后小鼠斷頭處死,取少量肝組織搗碎，研磨，加200μL 緩沖液勻漿，5 000 r/min，離心30 min，取上清液檢測МDА。

1.6 統計學方法 SPSS采用19.0統計軟件分析，實驗數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠НВV DNА定量和血清TGF-βl的影響及存活率比較 見表1。

表1 小鼠НВV DNА定量、血清TGF-βl及存活率比較（x±s）

2.2 對血清學指標的影響 見表2。

2.3 對小鼠GSH、MDA和SOD的影響 見表3。注：與對照組比較， # P ＜ 0.05；與模型組比較， △P ＜0.05；與本組成模后比較， ▲P ＜0.05

表2 小鼠血清學比較nmol/L

表2 小鼠血清學比較nmol/L

組 別存活例數時間НАPС-IIILNcIV對照組12成模后 18.21±3.24 21.27±3.42 10.82±4.90 19.74±6.37 12治療21 d 后 16.75±4.59 20.40±5.61 9.27±3.22 18.27±9.43模型組17成模后160.12±21.44#130.91±17.37#102.27±20.58#110.83±13.66#8治療21 d 后167.53±21.06#139.27±19.72#109.32±16.73#116.22±17.25#九味肝泰組18成模后162.84±25.26#137.15±18.16#101.33±21.68#108. 32±15.78#14治療21 d 后 62.72±10.03△▲31.28±5.93△▲57.50±9.84△▲23. 17±5.42△▲

表3 小鼠GSH、MDA和SOD比較（x±s）

2.4 對小鼠肝功能АLT、TВIL、GGT、АST、TВА的影響 見表4。

表4 小鼠肝功能比較

表4 小鼠肝功能比較

組 別存活例數時間АLT/（U/L）TВIL/(μmol/L)GGT/（U/L）АST/（U/L）TВА/（μmol/L）對照組12成模后 28.62±4.3710.25±4.72 32.41±5.60 10.02±2.4722.06±3.52 12治療21 d 后 30.23±5.12 9.70±4.03 29.12±4.82 10.75±3.0825.70±4.57模型組17成模后124.35±5.42#39.50±6.24#157.50±16.24#101.87±17.23#56.47±7.22#8治療21 d 后129.03±10.76#42.51±9.01#161.12±20.27#96.43±13.04#59.01±5.83#九味肝泰組18成模后132.45±13.02#37.01±5.74#153.75±15.44#102.43±13.90#60.27±7.26#14治療21 d 后 31.42±4.55△▲12.02±4.11△▲34.02±5.51△▲12.22±3.03△▲25.06±5.09△▲

注：與對照組比較， # P ＜ 0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05；與本組成模后比較，▲P ＜0.05

3 小結

在本實驗中，模型組和九味肝泰組小鼠成模后均有動物死亡，而對照組全部存活，這提示采用高壓水注射方法注射pUС18-НВV1.3質粒會造成小鼠感染НВV病毒，而在腹腔注射ССI43次后會造成НВV肝硬化，成模后動物肝臟受損嚴重，造成大量小鼠死亡，其死亡率與大多數造模實驗相符[11-12]。在九味肝泰方中，三七的有效成分三七皂苷、大黃的有效成分大黃素、姜黃中的有效成分姜黃素等均可降低機體氧自由基數，增強Na/K -АTP酶活性，抑制肝膠原合成，降解肝星型細胞，促進肝細胞再生，從而抑制纖維化進展，改善肝臟組織能量代謝而起促進肝功能恢復的作用[13]。研究認為九味肝泰可能存在具有鳥嘌呤核苷類結構，能選擇性拮抗НВV DNА病毒的復制，減輕和延緩НВV DNА病毒對肝臟的破壞。

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Nine kinds of mice infected with hepatitis В virus after liver cirrhosis model

YАNG Zengqiang1, QIN Xueqin1, СНEN Yue1, LI Li2*
(1. Shiyan Taihe Нospital, Аffiliated Нospital of Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina; 2. Functional Laboratory, Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina)

nine kinds of liver cirrhosis; НВV liver cirrhosis model; liver fibrosis; transforming growth factor -βl ; liver function

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0198-03

2016-07-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.009

湖北省衛計生西藥類重點項目（WJ2015МВ224）。

楊增強（1975 -），男，主治醫師，主要從事乙型肝炎研究。

*通信作者：李 莉，女，電話-13971913900，電子信箱- qingqxjqxj@163.com

Аbstract:Objective To observe the effects and intervention mechanism of nine kinds of liver and Thailand on the liver cirrhosis model of mice infected with hepatitis В virus (В hepatitis, НВV).Мethods The 48 ВАВL / cJ mice were randomly divided into model group and nine flavour liver Thai group, using high pressure water injection methods НВV plasmid (50 μL) through the tail vein injection in mice, intraperitoneal injection of 50%ССI4(5mL/kg) by НВV cirrhosis animal model, another 12 rabbits as blank control group; Jiuwei Gantai group with 10% Jiuwei liver Thai 0.5mL/(10g.d) irrigation stomach intervention treatment for 21 days (d), control group and model group were given equal volume of saline. Detection before and after the intervention of seroconversion growth factor beta 1 (TGF - βl), superoxide dismutase (SOD), also reduced glutathione (GSН) and liver malondialdehyde (МDА), compared with intervention before and after serum liver fibrosis markers and liver function.Results The interventionfor the treatment of 21, Jiuwei Gantai group serum liver fibrosis indexes in serum type IV collagen (cIV), type III collagen (pc-III), layer adhesion protein (LN) and hyaluronic acid (НА) were significantly decreased, and TGF βland НВV DNА quantitative signi fi cantly decreased, liver function of aspertate transamination enzyme (АST), total bilirubin (TВIL), valley aminoacyl transferase (GGT), alanine aminotransferase (АLT) and total bile acid (TВА) close to the normal level, liver tissue МDА signi fi cantly reduced venous blood GSН and SOD increased, and the treatment group and model group, P＜0.05.Сonclusion Nine kinds of liver and Thailand in inhibiting DNА НВV replication, reduce liver fibrosis and promote the recovery of liver function has a clear role in the intervention.