抑癌基因ARHI在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

張海燕 李鐵軍 陳 亮 姜 偉

抑癌基因ARHI在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

張海燕①李鐵軍②陳 亮③*姜 偉②

目的：探討抑癌基因ARHI在三陰性乳腺癌(TNBC)中的表達及臨床意義。方法：選擇150例TNBC患者及135例非TNBC患者，用免疫組織化學SP法檢測癌組織中ARHI的表達，觀察ARHI在兩種乳腺癌中表達的差異。結果：抑癌基因ARHI蛋白在TNBC組織中的表達率為32.0%，在非TNBC組織中的表達率為47.4%，兩者比較差異有統計學意義(x2=4.444，P＜0.05)。抑癌基因ARHI在TNBC中的表達與腫瘤大小、臨床分期及腋下淋巴結轉移均顯著相關，其表達率差異有統計學意義(x2=8.326，x2=9.382，x2=5.259；P＜0.05)；ARHI的表達與乳腺癌家族史及組織學分級無顯著相關性，其表達率差異無統計學意義(x2=0.172，x2=4.584；P＞0.05)。ARHI在非TNBC中的表達與臨床分期相關，其表達率差異無統計學意義(x2=6.155，P＜0.05)；ARHI在非TNBC的表達與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史、腋下淋巴結轉移及組織學分級無顯著相關性，其表達率差異無統計學意義(x2=0.002，x2=0.946，x2=0.653，x2=0.031，x2=0.991；P＞0.05)。結論：抑癌基因ARHI在TNBC中的表達缺失更為顯著，提示ARHI的表達可能成為判斷TNBC浸潤進展及預后的指標之一。

三陰性乳腺癌；非三陰性乳腺癌；抑癌基因；ARHI；免疫組織化學

張海燕,女,(1980- ),碩士，副教授、副主任護師。滄州醫學高等專科學校護理系，研究方向：護理教育及臨床護理。

三陰性乳腺癌 (triple-negative breast cancer，TNBC)屬于乳腺癌中惡性程度最高的類型，即雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor recepto，Her-2)均不表達[1]。TNBC對于內分泌治療和Her-2的靶向治療無效，化療是目前唯一有效的治療手段。TNBC與非TNBC比較尚無更好的治療手段，因此預后差，且易轉移復發。近年來，新型的靶向藥物層出不窮，針對乳腺癌的新型靶向藥物的研究成為目前研究的熱點。一種新的腫瘤抑制基因ARHI(aplasia ras homologue member I)/NOEY2參與細胞周期調控和信號通路的傳導，負向調節細胞生長，誘發自噬及促進細胞休眠和凋亡。有研究發現，其在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝細胞癌及胃癌等多種腫瘤組織中表達下調或缺失，提示抑癌基因ARHI可能參與了上述腫瘤的發生發展過程[2]。本研究將非TNBC作為對照，探討ARHI蛋白在TNBC中的表達，分析兩者之間表達的差異，并探討ARHI蛋白與TNBC臨床病理特征之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年10月至2016年8月于河北省滄州市中心醫院住院治療的150例TNBC患者及135例非TNBC患者的細胞蠟塊。TNBC患者均為女性；年齡29～76歲，平均年齡44.6歲；組織學分級為Ⅰ級48例，Ⅱ級50例，Ⅲ級52例；臨床腫瘤TNM分期為Ⅰ期40例，Ⅱ期53例，Ⅲ期57例；乳腺癌家族史44例；腋下淋巴結轉移患者64例。非TNBC患者均為女性；年齡25～70歲，平均年齡45.2歲；組織學分級為Ⅰ級35例，Ⅱ級54例，Ⅲ級46例；臨床腫瘤TNM分期為Ⅰ期38例，Ⅱ期60例，Ⅲ期37例；腋下淋巴結轉移患者58例；乳腺癌家族史48例。所有患者均接受規范的治療。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：經病理檢測雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及Her-2均為陰性的TNBC女性患者。

(2)排除標準：經病理檢測ER、PR及Her-2其中任意一項為陽性的非TNBC女性患者。

1.3 免疫組織化學檢測

標本進行常規10﹪甲醛固定、常規脫水、浸蠟、包埋及切片。切片厚度為4 μm。采用免疫組織化學SP法進行檢測，依據說明書操作。ARHI兔多克隆單克隆抗體試劑盒購自美國SANTA CRUZ公司。

1.4 ARHI的判斷指標

采用每一切片中隨機選取10個高倍鏡視野、每個高倍鏡視野計數為100個細胞的方法判定。染色強度等級：淺黃染為1分，中度黃染為2分，強度黃染為3分；陽性細胞的百分率：陽性細胞≤5﹪為0分，5﹪～25﹪為1分，26﹪～50﹪為2分，＞50﹪為3分；將兩者的結果綜合分析：0分計為陰性(-)，1～2分計為弱陽性(+)，3～4分計為中度陽性(++)，5～6分計為強陽性(+++)；將CD55蛋白的(-)、(+)組計為低表達組，將CD55蛋白的(++)、(+++)組計為高表達組。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件包進行數據統計學處理。計數資料應用x2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARHI蛋白在TNBC與非TNBC中的表達比較

ARHI蛋白在TNBC組織中的表達率為32.0﹪，在非TNBC組織中的表達率為47.4﹪，兩者比較差異有統計學意義(x2=4.444，P＜0.05)，見表1。

表1 ARHI蛋白在不同乳腺癌組織類型中的表達比較

2.2 ARHI蛋白表達與TNBC臨床病理特征的關系

在TNBC患者的臨床病理特征中，ARHI的表達與腫瘤大小、臨床分期及腋下淋巴結轉移均顯著相關，其表達率比較差異有統計學意義(x2=8.326，x2=9.382，x2=5.259；P＜0.05)；ARHI的表達與患者的乳腺癌家族史及組織學分級無顯著相關性，其表達率比較差異無統計學意義(x2=0.172，x2=4.584；P＞0.05)，見表2。

2.3 ARHI蛋白表達與非TNBC臨床病理特征的關系

在非TNBC患者的臨床病理特征中，ARHI的表達與臨床分期相關性，其表達率比較差異有統計學意義(x2=6.155；P＜0.05)；ARHI的表達與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史、腋下淋巴結轉移及組織學分級無顯著相關性，其表達率比較差異無統計學意義(x2=0.002，x2=0.946，x2=0.653，x2=0.031，x2=0.991；P＞0.05)，見表3。

3 討論

TNBC是乳腺癌的特殊類型，侵襲性強，預后較差，且缺乏針對性的有效治療策略，內分泌治療及針對Her-2基因的分子靶向治療無效。近年來對TNBC的基礎與臨床等方面的研究越來越多，已經成為國內外學者關注的重點。因此，針對ARHI基因的研究有助于惡性腫瘤的預防和治療。無論是在TNBC還是在非TNBC中均存在ARHI的表達缺失，而有關ARHI在TNBC與非TNBC中表達的差異以及與臨床病理特征的區別，未見臨床報道。

表2 ARHI蛋白表達與TNBC臨床病理特征的關系

表3 ARHI蛋白表達與非TNBC臨床病理特征的關系

Yu等[1]利用差異顯示PCR，確定了ARHI在正常卵巢和乳腺上皮細胞持續表達，而在卵巢癌和乳腺癌表達缺失，通過轉染重新表達ARHI后能抑制乳腺癌和卵巢癌細胞的生長。41﹪的卵巢癌和乳腺癌被發現存在雜合性喪失的基因。Bao等[2]使用雙腺病毒的系統，在已經失去ARHI表達的卵巢癌和乳腺癌細胞中重新表達ARHI，ARHI的再表達癌細胞的抑制生長，侵襲力下降，并誘導其凋亡。Hisatomi等[3]通過實時PCR分析發現，所有非癌乳腺組織中均檢測到ARHI/NOEY2，而在26例乳腺癌組織中，其中有2例沒有檢測到，10例乳腺癌組織ARHI/NOEY2 mRNA的顯著減少，12例ARHI/ NOEY2表達丟失或明顯減少。提示ARHI/NOEY2 mRNA表達的減少可能在乳腺癌的發病機制中起重要作用。白雪等[4]收集臨床80例乳腺癌患者癌組織、40例癌旁乳腺組織和20例正常乳腺組織，采用免疫組織化學法和RT-PCR法檢測ARHI基因在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織及正常組織中的表達，顯示與正常組織和癌旁組織相比較，ARHI蛋白和ARHImRNA水平在乳腺癌組織中的表達均明顯降低，并且兩者隨組織病理分級的升高而降低，有淋巴結轉移的低于無淋巴結轉移者，但在不同組織學類型中的表達差異無統計學意義。Wang等[5]采用免疫組織化學法和原位雜交ARHI在乳腺導管原位癌，浸潤性乳腺癌和鄰近的正常乳腺上皮細胞中的表達，得出ARHI mRNA和蛋白在所有的正常乳腺上皮細胞中檢測到，ARHI的表達主要是在細胞質和很少存在于細胞核。通過組織化學分析，DCIS中ARHI表達下調41%，浸潤性癌下調70%，表明ARHI表達在DCIS中是顯著下調，并且ARHI的表達進一步降低與乳腺癌進展相關。本研究顯示，ARHI蛋白在TNBC組織中的陽性表達率明顯高于非TNBC組織，提示無論TNBC還是非TNBC中均存在著ARHI蛋白的表達缺失；并且TNBC中ARHI的表達缺失明顯高于非TNBC，說明ARHI的表達缺失在參與TNBC的發生發展過程中較非TNBC發揮著更加重要的作用。本組還顯示：無論是在TNBC還是在非TNBC中，ARHI的蛋白表達均與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史及組織學分級無顯著相關，而與腋下淋巴結轉移有相關性，表明隨著惡性度的增加，ARHI的蛋白表達逐漸下降，并且在TNBC中，ARHI蛋白表達缺失又與臨床分期有相關性，提示ARHI的表達缺失可能在TNBC的惡性演變過程中較非TNBC扮演著更為重要的角色。此外，在其他惡性腫瘤中同樣見到ARHI的異常表達。陳若琨等[6]腦組織切片的免疫組織化學染色顯示，高級別膠質瘤ARHI陽性表達率(35.34%和30.16%)明顯低于正常腦組織(94.07%)及低級別膠質瘤(93.08%和82.11%，P＜0.01)，提示ARHI蛋白的陽性率與腦膠質瘤的惡性程度成反比。彭麗等[7]采用免疫組織化學檢測72例甲狀腺癌組織和癌旁組織以及40例正常組織中ARHI蛋白表達水平，并比較其表達水平和甲狀腺癌分級、預后等病理參數關系。結果顯示甲狀腺癌組織中ARHI陽性率為48.6%，顯著低于癌旁組織中的69.4%和正常組織中的95.0%，差異有統計學意義。路新卿等[8]分別應用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫印跡法證實ARHI可明顯的誘導胰腺癌細胞發生凋亡，ARHI表達下調可能在胰腺癌的發生發展中起了重要的作用。毛沖沖等[9]采用免疫組織化學SP法檢測10例正常腦組織、30例低級別膠質瘤(Ⅰ級、Ⅱ級)和39例高級別膠質瘤(Ⅲ級、Ⅳ級) ARHI的表達情況，證實 ARHI可能成為判斷星形膠質細胞瘤惡性程度、侵襲性及預后的有效指標。

張再興等[10]研究得出喉鱗癌組織ARHI蛋白陽性表達率低于癌旁組織，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期者，有淋巴結轉移喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率低于無淋巴結轉移者，病理分級高中分化喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率高于低分化者。李黎博等[11]通過構建pEGFP-ARHI表達載體，實驗表明在ARHI低表達的胃癌細胞系MKN-28中表達重組質粒pEGFPARHI能夠抑制細胞的增殖、侵襲和遷移能力。Chen等[12]試驗表明，ARHI在膠質瘤組織以及在4種惡性神經膠質瘤細胞系被顯著下調。Lu等[13]通過免疫組化和原位雜交法檢測57例細胞石蠟包埋手術切除腫瘤標本和患者相應正常胰腺組織中ARHI的表達，結果發現，ARHI mRNA在正常對照胰腺組織中的陽性率和蛋白表達率分別為84.2%和82.5%，而在癌組織中均為52.6%；mRNA在腫瘤組織中的陽性率和蛋白表達率顯著降低。胡珊珊等[14]研究表明，ARHI在78.3﹪胰腺癌組織中表達缺失或下調，ARHI基因抑制胰腺癌細胞株增殖，抑制胰腺癌裸鼠荷瘤的生長，抑制胰腺癌裸鼠荷瘤中血管生成和相關蛋白VEGF和CXCL8的表達。Huang等[15]通過實時RT-PCR分析HCC樣本ARHI的基因表達，與癌旁非癌組織比較，HCC中ARHI的基因表達下調78.6%。上述研究均表明ARHI在喉鱗癌、胃癌、膠質瘤、胰腺癌以及肝癌也存在明顯缺失，腫瘤可能與乳腺癌有著類似的發病機制，ARHI蛋白可能在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要作用。

ARHI的表達缺失可能與TNBC及非TNBC的發生及發展均有相關性，而與TNBC的相關性更強；ARHI可能是影響TNBC及非TNBC預后的因素，而影響TNBC的作用更加明顯。因此，ARHI有可能成為判斷TNBC浸潤進展及預后的指標之一，在乳腺癌中發揮著重要的作用。對于ARHI的研究會進一步深入，為腫瘤的診斷和治療提供新思路和方法。

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Expressions and clinical significances of tumor suppressor gene ARHI in triple-negative breast cancer(TNBC)

ZHANG Hai-yan, LI Tie-jun, CHEN Liang, et al//
China Medical Equipment,2017,14(4):120-123.

Objective: To investigate the expressions and significances of tumor suppressor gene aplasia ras homologue member I (ARHI) in triple-negative breast cancer (TNBC). Methods: To select 150 patients with triple-negative breast cancer and 135 patients with non-triple-negative breast cancer as the research cases. The expressions of ARHI was detected by immunohistochemistry Streptavidin-Peroxidase (SP) method for 150 cases TNBC and 135 cases non-TNBC, and the different expressions of ARHI in two types of breast cancer were observed and compared. Results: The positive expression of ARHI was 32.0% in the TNBC tissues and was 47.4% in non-TNBC tissues, and the difference between them indicated statistical significance (x2=4.444, P<0.05). The expression of ARHI in TNBC was significantly related with tumor size, clinical stage and axillary lymph node metastasis (x2=8.326, x2=9.382, x2=5.259; P<0.05), while its expression did not show significant correlation with family history of breast cancer and histologic grade (x2=0.172, x2=4.584; P>0.05). The expression of ARHI was significantly related with clinical stage of non-TNBC (x2=6.155, P<0.05), while it did not show correlation with age, tumor size, family history of breast cancer, axillary lymph node metastases and histologic grade (x2=0.002, x2=0.946, x2=0.653, x2=0.031, x2=0.991; P>0.05). Conclusion: The expression deletion of ARHI has more significant in triplenegative breast cancer, and this result suggests that expression of ARHI may be used as one of the indicators in determining the invasive progress and prognosis of TNBC.

Triple-negative breast cancer; Non-triple-negative breast cancer; ARHI; Immunohistochemistry

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.04.032

1672-8270(2017)04-0120-04

R737.9

A

2016-12-02

①滄州醫學高等專科學校護理系 河北 滄州 061001

②滄州市中心醫院教學處 河北 滄州 061001

③滄州市中心醫院腫瘤外二科 河北 滄州 061001

*通訊作者：chenliangsy@sina.com

[First-author’s address] The Department of Nursing, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China.