截?cái)嘈虯poE對(duì)β-淀粉樣蛋白代謝的影響

董 翔 常 庚 趙 莉 周慧玲

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116011)

截?cái)嘈虯poE對(duì)β-淀粉樣蛋白代謝的影響

董 翔 常 庚 趙 莉 周慧玲

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116011)

目的 探討截?cái)嘈?trauncated)載脂蛋白(Apo)E對(duì)β-淀粉樣蛋白代謝的影響。方法 對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染后制備條件培養(yǎng)基，利用熒光法檢測(cè)全長(zhǎng)ApoE4和truncated-ApoE4與Aβ42的結(jié)合能力，并對(duì)與Aβ42結(jié)合復(fù)合物對(duì)SDS的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，利用熒光顯微鏡對(duì)truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4對(duì)影響N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ42情況進(jìn)行觀察。結(jié)果 當(dāng)Aβ42濃度≤100 nmol/L時(shí)，truncated-ApoE4組熒光強(qiáng)度均低于全長(zhǎng)ApoE4組；進(jìn)行含SDS聚丙烯凝膠電泳時(shí)，兩組均在6 kD的位置處出現(xiàn)條帶，而在43 kD處的條帶明顯變窄，truncated-ApoE4組大約是原來的30%，ApoE4組大約為原來的55%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；truncated-ApoE4組N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ42數(shù)量均少于全長(zhǎng)ApoE4組(P<0.05)。結(jié)論 truncated-ApoE4與Aβ42結(jié)合能力減弱，形成的復(fù)合物穩(wěn)定性降低，可以顯著影響N2a細(xì)胞對(duì)Aβ42的結(jié)合和攝取作用，抑制truncated-ApoE4產(chǎn)生為AD預(yù)防和治療提供新的研究方向。

阿爾茨海默病；載脂蛋白E；截?cái)嘈虯poE；β-淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(AD)是最為常見的癡呆類型〔1，2〕，由于患者出現(xiàn)失憶、認(rèn)知障礙、執(zhí)行障礙、行為改變等神經(jīng)退變性改變，給患者日常生活造成嚴(yán)重影響，而且導(dǎo)致患者死亡風(fēng)險(xiǎn)大為增加，同時(shí)，給家庭和社會(huì)帶來十分巨大的負(fù)擔(dān)〔3〕。目前，AD確切的誘發(fā)因素和病理作用機(jī)制尚未十分清楚。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是腦中淀粉樣前體蛋白在β-分泌酶作用下的裂解產(chǎn)物，以Aβ40和Aβ42為主，且Aβ42具有更強(qiáng)的聚集、疏水和神經(jīng)毒作用〔4〕，研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，AD的主要病理改變是出現(xiàn)大量的腦淀粉樣沉淀，而Aβ是主要成分，Aβ在誘發(fā)AD發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。載脂蛋白(Apo)E是星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種糖蛋白，對(duì)神經(jīng)元修復(fù)和再生起重要作用，有研究指出〔6〕，ApoE4與腦淀粉樣沉淀共同存在，且ApoE4頻率與淀粉樣沉淀形成程度呈正比，同時(shí)，ApoE4能夠與Aβ形成復(fù)合物。截?cái)嘈?truncated)-ApoE4是ApoE4基因C末端272～299位氨基酸殘基被蛋白酶水解后的片段，研究表明〔7〕，AD患者老年斑大量存在的不是全長(zhǎng)ApoE4，而是truncated-ApoE4。本研究對(duì)truncated-ApoE4對(duì)Aβ代謝影響進(jìn)行探討，并分析truncated-ApoE4對(duì)N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a購(gòu)自上海信則生物，pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4由大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。抗載脂蛋白E購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，Covance Beta Amyloid β-淀粉樣蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Covance公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記兔抗羊IgG均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，ECL底物發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物，G-418和硫酸葡聚糖凝膠柱購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，β淀粉樣肽/Aβ42抗體購(gòu)自瑞士Bachem公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將N2a細(xì)胞用FBS培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下用培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，2 d換液一次，細(xì)胞豐度達(dá)到80%左右時(shí)，用0.125%胰酶進(jìn)行消化后，用于傳代或試驗(yàn)。用OPTI-MEM將2.7 μg純化的pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4質(zhì)粒稀釋至250 μl，取Lipofectamine2000 5 μl稀釋至250 μl，37℃下放置5 min，兩者進(jìn)行混勻后，37℃靜置20 min后，加入到含OPTI-MEM 1.5 ml的含N2a細(xì)胞的6孔板中混勻，37℃培養(yǎng)6 h，換含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使用濃度為800 μg/ml G418進(jìn)行篩選2 w，3 d換液一次。繼續(xù)用濃度為400 μg/ml G418進(jìn)行篩選30 d，成熟細(xì)胞即為成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.2.2 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4條件培養(yǎng)基的制備和純化 將成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4的N2a細(xì)胞分別置于250 ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下生長(zhǎng)到80%細(xì)胞豐度時(shí)，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌2次，并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)孵育2 h。用無血清培養(yǎng)基洗滌1次后，于無血清培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行收集，保存在1 mmol/L EDTA+0.01%NaN3+10 mmol/L aprotinin+10 mmol/L benzamidine溶液中。每周進(jìn)行2次收集，連續(xù)30 d。利用離心機(jī)采用2 000 r/min離心10 min，12 000 r/min離心20 min，并利用硫酸葡聚糖凝膠柱離子交換色譜法對(duì)全長(zhǎng)ApoE4和truncated-ApoE4進(jìn)行純化。

1.2.3 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42的結(jié)合能力檢測(cè) 利用熒光法對(duì)全長(zhǎng)ApoE4和truncated-ApoE4與Aβ42的結(jié)合能力進(jìn)行檢測(cè)。取純化的全長(zhǎng)ApoE4或truncated-ApoE4溶解于pH7.4的0.1 mol/L的Tris溶液中，分別制備成濃度為5 nmol/L的溶液，并檢測(cè)熒光強(qiáng)度。加入Aβ42使其終濃度分別為10、20、50、100、200和500 nmol/L，進(jìn)行平衡25 min后，分別檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.4 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合復(fù)合物對(duì)SDS穩(wěn)定性檢測(cè) 取凍存條件培養(yǎng)基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCL緩沖液中進(jìn)行混勻孵育2 h，分別制備ApoE4、truncated-ApoE4與Aβ42結(jié)合復(fù)合物。取一部分復(fù)合物在不含SDS聚丙烯凝膠板上進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，利用Covance Beta Amyloid β-淀粉樣蛋白1-16(6E10)單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)；另取一部分在含有SDS聚丙烯凝膠板上進(jìn)行電泳，檢測(cè)方法同上。

1.2.5 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4對(duì)N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ42影響檢測(cè) 取凍存條件培養(yǎng)基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCl緩沖液中進(jìn)行混勻孵育2 h，①取35 μl混合液加入無血清培養(yǎng)基并定容至3 ml，在4℃條件下對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行孵育30 min，棄上清加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，利用PBS沖洗3次，每次5～10 min，加入1∶200比例稀釋?duì)碌矸蹣与?Aβ42抗體進(jìn)行過夜孵育后，PBS沖洗3次，每次5～10 min，加入1∶50稀釋的TRITC標(biāo)記山羊抗兔lgG室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5～10 min，甘油封片后，對(duì)細(xì)胞結(jié)合能力進(jìn)行觀察。②取35 μl混合液加入無血清培養(yǎng)基并定容至3 ml，在37℃條件下對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行孵育60 min，棄上清加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定20 min，利用PBS沖洗3次，每次5～10 min，用含0.3%Triton X-100的PBS進(jìn)行破膜5～10 min后，其余步驟同細(xì)胞結(jié)合能力檢測(cè)試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 truncated-ApoE4、全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合能力情況 利用熒光法對(duì)truncated-ApoE4、全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合能力進(jìn)行檢測(cè)， truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4均能與Aβ42以飽和方式進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)Aβ42濃度≤100 nmol/L時(shí)，truncated-ApoE4組熒光強(qiáng)度均低于全長(zhǎng)ApoE4組，見表1。

表1 不同Aβ42濃度下truncated-ApoE4組和ApoE4組熒光強(qiáng)度變化情況

2.2 truncated-ApoE4、全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合復(fù)合物對(duì)SDS穩(wěn)定性 利用含SDS和不含SDS的聚丙烯凝膠對(duì)truncated-ApoE4、全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合復(fù)合物穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行不含SDS聚丙烯凝膠電泳時(shí)，兩組均能夠在43 kD的位置進(jìn)行凝聚，出現(xiàn)粗的凝聚條帶。當(dāng)進(jìn)行含SDS聚丙烯凝膠電泳時(shí)，兩組均在6 kD的位置處出現(xiàn)條帶，而在43 kD處的條帶明顯變窄，truncated-ApoE4組大約是原來的30%，ApoE4組大約為原來的55%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：不含SDS聚丙烯凝膠電泳；B：含SDS聚丙烯凝膠電泳圖1 truncated-ApoE4、全長(zhǎng)ApoE4與Aβ42結(jié)合復(fù)合物對(duì)SDS穩(wěn)定性

2.3 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4對(duì)N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ42影響 由圖2A和圖2B可知，truncated-ApoE4組N2a細(xì)胞結(jié)合Aβ42數(shù)量顯著少于全長(zhǎng)ApoE4組(P<0.05)；由圖3A和圖3B可知，truncated-ApoE4組N2a細(xì)胞攝取Aβ42數(shù)量顯著少于全長(zhǎng)ApoE4組(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4對(duì)N2a細(xì)胞結(jié)合Aβ影響

圖3 truncated-ApoE4和全長(zhǎng)ApoE4對(duì)N2a細(xì)胞攝取Aβ影響

3 討 論

研究表明〔8〕，老年斑、神經(jīng)元缺失、神經(jīng)纖維纏結(jié)等是AD主要病理改變。而Aβ是老年斑的重要組成成分，其在腦組織中過度表達(dá)、聚集和沉淀能夠加速老年斑的形成，從而加快AD病程進(jìn)展〔9〕。ApoE是在神經(jīng)元修復(fù)和再生起重要作用一種糖蛋白，能夠調(diào)節(jié)Aβ的代謝、聚集和沉淀，可以和Aβ結(jié)合成可溶性的復(fù)合物，并能抵抗SDS的變性作用，ApoE4是ApoE的一個(gè)亞型，能夠增加AD的患病風(fēng)險(xiǎn)，可能與其影響Aβ聚集沉淀有關(guān)〔10〕，truncated-ApoE4是ApoE 4是蛋白酶水解產(chǎn)物，有研究指出〔11〕，truncated-ApoE4在AD病程中的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于ApoE 4。本研究對(duì)truncated-ApoE4和ApoE 4對(duì)Aβ代謝作用，以及對(duì)N2a細(xì)胞結(jié)合和攝取Aβ的影響進(jìn)行了系統(tǒng)探討，鑒于腦組織中Aβ以Aβ40和Aβ42為主要組成，且Aβ42具有更強(qiáng)的聚集、疏水和神經(jīng)毒作用〔4〕。

本研究說明truncated-ApoE4與Aβ42結(jié)合能力顯著低于全長(zhǎng)ApoE4的結(jié)合作用，truncated-ApoE4的結(jié)合產(chǎn)物對(duì)SDS變性作用顯著降低，出現(xiàn)了大量的游離Aβ42，并且游離的Aβ42進(jìn)行了聚集，出現(xiàn)了凝聚條帶，提示游離的Aβ42更具有聚集的特性〔12〕。本研究顯示truncated-ApoE4可以影響N2a細(xì)胞對(duì)Aβ42的結(jié)合和攝取作用，進(jìn)一步從分子水平上說明了truncated-ApoE4對(duì)Aβ42代謝的影響作用。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

常 庚(1981-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事癡呆研究。

董 翔(1975-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病及癡呆研究。

R743

A

1005-9202(2017)07-1621-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.023