姜黃素增強脂多糖跨膜轉運的機制及其抗動脈粥樣硬化作用

周音頻 寧 琳 向立權 吳永才 楊義航 黎 明

(重慶市涪陵區中心醫院心內科，重慶 408000)

姜黃素增強脂多糖跨膜轉運的機制及其抗動脈粥樣硬化作用

周音頻 寧 琳 向立權 吳永才 楊義航 黎 明

(重慶市涪陵區中心醫院心內科，重慶 408000)

目的 探究姜黃素增強脂多糖(LPS)跨血管內皮細胞的轉運機制及其抗動脈粥樣硬化作用。方法 采用TER法檢測姜黃素處理后心肌細胞通透性的變化，放射法檢測姜黃素處理的心肌細胞內LPS流出率， Western印跡法檢測心肌細胞內小窩蛋白(Cav)-1的表達，qRT-PCR法檢測姜黃素作用后的小鼠心肌細胞內層VCAM-1、ICAM-1的基因表達。結果 與對照組比較,不同濃度姜黃素處理后的心肌細胞單層電阻值逐漸增加；心肌細胞膜內的LPS流出率下降，隨著姜黃素濃度升高，其流出率逐漸降低，與劑量濃度呈負相關。與對照組相比，姜黃素處理后Cav-1蛋白表達量均下降，隨著時間的延長表達量逐漸降低，在藥量濃度范圍內呈負相關。姜黃素處理過的心肌細胞內VCAM-1、ICAM-1基因表達量均升高且與姜黃素濃度呈負相關，隨著姜黃素藥物作用濃度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因表達量逐漸降低。結論 姜黃素通過提高細胞通透性加強LPS在小鼠心肌內皮細胞轉運，并且通過調控VCAM-1、ICAM-1基因抑制動脈粥樣硬化的形成。

姜黃素；心肌細胞；脂多糖;小窩蛋白-1;動脈粥樣硬化

姜黃素是從植物Curcuma longa L.中提取到的多酚物質，難溶于水，易溶于乙醇、氯仿等有機溶劑〔1〕。臨床研究證明，姜黃素在抗腫瘤、治療心血管疾病方面具有良好的效果〔2〕。Chang等〔3〕研究發現姜黃素通過抑制MDR1蛋白的表達可誘導口腔癌細胞凋亡且對牙齦的毒性小。趙秀峰等〔4，5〕證實姜黃素對小鼠心肌缺血性細胞損傷具有保護作用。本文主要對姜黃素增強脂多糖(LPS)跨膜轉運的機制及其抗動脈粥樣硬化作用進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料 體重約為150 g的健康小鼠20只由第三軍醫大學動物實驗室飼養；姜黃素由重慶市中藥研究所提供。

1.2 實驗試劑及器材 胎牛血清，Gibco公司；DMEM，Invitrogen公司；胰酶，Thermo Scientific 公司；RPMI-1640培養基，Gibco公司；MTT，華美公司；兔抗大鼠 p-Caveolin-1、GAPDH 等一抗抗體，北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG，北京博勝經緯科技有限公司；聚丙烯酰胺、Tris-HCl、NC膜，Amersham公司；EDTA，Amresco公司；Transwell小室，北京優尼生物科技有限公司；MERS00002型跨膜細胞電阻儀，美國Millipore 公司；SYBRTM Premix Ex TaqⅡ，Takara公司;Bio-Red熒光定量PCR儀，Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌細胞的培養 將20只小鼠隨機分為五組，每組4只。對照組灌輸生理鹽水，治療組和模型組小鼠提前3 d給予脂多糖(LPS)喂養，治療組分別灌輸姜黃素(0.3 g/L)一倍藥量、兩倍藥量、三倍藥量、四倍藥量，2次/d，5 d后將小鼠用4%水合氯醛麻醉，麻醉后將小鼠解剖取出心臟，迅速置于100 ml PBS溶液中，清洗3次，用無菌剪刀去除心臟表面的組織血管等，用PBS溶液清洗后，將組織用剪刀剪成1 mm3大小的組織塊放入錐形瓶，加入2 g/L的胰酶置于37℃搖床100 r/min培養30 min，將上層細胞懸浮液用移液槍吸取后，加入含10%胎牛血清的DEME，混勻后得到心肌細胞，將細胞置于37℃、5%CO2的培養箱中，當細胞貼壁數目達到80%時加入0.5%胰酶溶液進行消化，按照1∶3進行傳代培養，培養的第三代細胞用于后續實驗。

1.3.2 采用TER法檢測姜黃素作用后心肌細胞通透性的變化 在體外將不同藥量處理后的5組小鼠心肌細胞接種于DMEM液體培養基37℃培養1 d，加入胰酶消化細胞，使細胞濃度為1.5×105個/ml，取100 μl接種于六孔板置于Transwell上室中，上下室內均加入500 μl DMEM培養液，上室中細胞培養分為5組，每組四個重復，細胞培養至單層，用電阻儀檢測上下室之間的電阻值，觀察細胞通透性的變化。

1.3.3 放射法檢測含藥的心肌細胞的通透性 將體外5組培養生長到對數期的細胞接種于加入〔3〕H標記LPS的DMEM液體培養基中，培養1 d待反應結束后加入不含血清DMEM液體培養基漂洗2次，加入含5%BSA的DMEM液體培養基和載體蛋白apoA-I后連續培養6 h，設置陰性對照為不加載體蛋白apoA-I，分別收集上清培養基和破裂細胞，用0.22 μm的微孔過濾器過濾，PBS溶液清洗2次，取上清和裂解細胞液200 μl，用液閃計數儀測定上清、細胞及陰性對照細胞〔3〕H內毒素放射量，內毒素的流出率=(上清〔3〕H內毒素放射量-陰性對照量)/(總〔3〕H內毒素放射量)。

1.3.4 Western印跡法檢測小窩蛋白(Cav)-1蛋白的表達 參照Triton-100細胞裂解液膜蛋白試劑盒進行裂解后細胞內Cav-1蛋白的提取，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的測定，配置8%的分離膠與5%的濃縮膠，蛋白樣品中加入1/2體積的SDS上樣緩沖液，每孔上樣蛋白10 μg，Marker 5 μl，50 V電壓30 min，待指示劑進入分離膠后100 V電壓至電泳結束。以兔抗鼠Cav-1、PKC、P-ERM、ERM抗體作為一抗，4℃過夜轉膜，用PBS-T洗膜4次，按照(1∶5 PBS-T稀釋)加入二抗，室溫下反應1 h，用PBS-T洗膜4次。用ELC試劑盒檢測發光劑顯影，之后采用凝膠成像儀保存圖像。

1.3.5 qRT-PCR檢測姜黃素作用后細胞內皮ICAM-1、VCAM-1基因表達 采取最佳姜黃素處理濃度1.2 g/L灌喂治療組小鼠后提取心肌組織內皮RNA，參照RNA試劑盒進行操作，參照cDNA反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄，根據ICAM-1的序列設計引物序列：正義:5′-AGGTATCCATCCATCCCACA-3′，反義：5′-AGT-GTCTCATTCCCACGGA-3′；VCAM-1的引物:反義:5′-CGGTCATGGTCAAGTGTTTG-3′，正義:5′-GAGATCCAGGGGAGATGTCA-3′。內參β-actin序列：反義:5′-CGTTGACATCCGTAAAGA-3′，正義:5′AGCCACCAATCCACACAG-3′。反應體系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，ddH2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板1 μl。在Bio-Red熒光定量PCR儀上按照反應程序94℃變性3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40個循環；95℃ 1 min進行反應，以β-actin基因為內參，采用2-ΔΔcq算法進行基因表達數據的分析。

1.4 統計學分析 使用GraphPad Prism 5 統計學軟件行方差分析并繪圖。

2 結 果

2.1 TER法檢測姜黃素作用心肌細胞后單細胞層的電阻值 對照組隨著時間的增加，細胞膜的通透性并未發生明顯的變化。與對照組比較，姜黃素處理后的心肌細胞層的電阻值降低，并且隨著姜黃素濃度增加，細胞的通透性逐漸升高。見表1。

2.2 放射法檢測含藥的心肌細胞〔3〕H LPS流出率 姜黃素作用后的小鼠心肌細胞膜內的LPS流出率與對照組相比下降；隨著姜黃素濃度的升高，流出率逐漸降低，與劑量濃度呈現負相關。見表1。

組別電阻值TER(Ω,×cm2)流出率(%)對照組19.21±0.6311.74±0.46模型組31.52±0.397.69±0.570.3g/L姜黃素28.68±0.5410.23±0.741)0.6g/L姜黃素22.59±0.751)12.38±0.651)0.9g/L姜黃素18.52±0.761)14.37±0.362)1.2g/L姜黃素15.27±0.662)16.07±0.262)

與對照組相比：1)P<0.05；2)P<0.01

2.3 姜黃素作用后對心肌細胞Cav-1蛋白表達的影響 與對照組相比，姜黃素處理后Cav-1蛋白表達量均下降，且隨著時間的延長，表達量逐漸降低，在藥量濃度范圍內呈負相關，表明姜黃素處理后轉運蛋白Cav-1量降低,減少了細胞的炎癥反應。見圖1。

a:對照組；b：模型組;c:治療組+0.3 g/L姜黃素;d:治療組+0.6 g/L姜黃素;e：治療組+0.9 g/L姜黃素;f:治療組+1.2 g/L姜黃素；下圖同圖1 姜黃素處理后細胞膜內Cav-1蛋白的表達

2.4 姜黃素作用后細胞內皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表達量 與對照組(1.02±0.82，1.00±0.85)不做任何處理的心肌細胞對比，LPS處理過的心肌細胞內VCAM-1、ICAM-1蛋白表達量(1.98±0.62,2.34±0.18)均升高，且與姜黃素濃度呈負相關；隨著姜黃素藥物作用濃度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因和蛋白的表達量逐漸降低(0.3、0.6、0.9、1.2 g/L姜黃素組分別為1.74±0.15，1.49±0.36；1.25±0.62，1.28±0.14；0.96±0.56，0.89±0.21；0.73±0.17，0.80±0.11)。表明姜黃素可能通過調控VCAM-1、ICAM-1基因抑制動脈粥樣硬化的形成。見圖2。

圖2 姜黃素作用后細胞內皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表達

3 討 論

姜黃素通過抑制LPS誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的產生，進而抑制過氧化物的產生起到消炎的作用〔6〕。有研究表明姜黃素能夠抑制血管生成，其主要通過抑制腫瘤細胞的增殖進而促進血管內皮細胞遷移，并且對血管的抑制具有特異性〔7〕。

體內發生炎癥反應時，LPS、TNF-α會使內皮細胞產生間隙，細胞通透性升高〔8〕。本研究通過TER法檢測單細胞層的電阻值，表明心肌細胞的通透性升高，姜黃素可能通過增加心肌細胞的通透性使LPS在內皮細胞膜間運輸。TER法(跨膜電阻測定)一般分為兩種：接觸式與非接觸式培養〔9〕，兩者區別在于組織內皮細胞和組織細胞接種于培養室的兩側，二者之間的細胞間物質是否可以進行自由交換〔10〕,接觸式培養主要研究組織細胞之間的相互作用，非接觸式培養研究細胞間物質的運輸，張水華等〔11〕通過非接觸式培養法測定血腦屏障模型的TER。TER法關鍵的技術操作在于組織細胞單層細胞的培養及接種濃度的確定，若非單層細胞或細胞濃度過高，均會影響實驗結果〔12〕。Cav-1是位于胞膜上的凹陷囊狀結構，體內廣泛存在，主要參與細胞增殖、腫瘤、凋亡等生命活動〔13〕。已有研究證實，Cav-1基因沉默會導致細胞通透性增強〔14〕。Jie等〔15〕研究發現腦缺血后,Cav-1的表達升高，從而誘導claudin-5的表達,表現出腦部組織水腫。本實驗結果表明姜黃素通過抑制Cav-1蛋白的表達，降低了膜上LPS等大分子的運輸，增強細胞的自我保護能力，但對于具體參與抑制Cav-1蛋白的信號路徑尚未清楚，還需要進一步深入研究。

放射性核素標記法是檢測微量物質的一種實驗方法，具有操作簡單、靈敏度高、作用范圍廣，在醫學及生物界廣泛應用〔16〕。本實驗表明姜黃素可能是通過抑制LPS跨膜轉運而對細胞進行保護。同位素標記法實驗也存在局限性：(1)標記后的化合物其生化結構穩定性降低，(2)輻射后化合物自身分解，(3)標記的原子會因為結構的不穩定發生移動造成實驗錯誤〔17〕。因此，在實驗操作過程中要控制好放射標記物反應的時間。 動脈粥樣硬化是常見的心腦血管疾病之一，伴隨著炎癥反應的發生，尋找新型抗動脈粥樣硬化藥物是當前主要任務〔18〕。姜黃素除了在治療心血管病方面發揮著重要的作用外，在抑制動脈粥樣硬化方面也起到了良好的效果〔19〕。 研究發現他汀類藥物具有抗動脈粥樣硬化的作用，主要是通過抑制GTP酶的表達而起到消炎的作用〔20〕。P 選擇素抑制劑 PSI-697能有效降低小血管表皮白細胞的聚集，減小表面脂塊的大小，起到消炎及抗動脈粥樣硬化的作用〔21〕。 ICAM-1、VCAM-1基因在動脈粥樣硬化的炎癥反應中起著關鍵重要作用，負責血管內皮表面白細胞的遷移、聚集。ICAM-1、VCAM-1基因表達量升高可促進內皮細胞之間黏附，進而在血管表面形成脂塊。本實驗表明姜黃素通過調節心肌細胞表皮ICAM-1、VCAM-1基因的表達來抑制炎癥的產生，從而抑制動脈粥樣硬化的產生。姜黃素作為良好的心血管、逆腫瘤中藥，具有廉價、高效、對人體副作用好，體外實驗誤差小等優點。

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〔2016-08-08修回〕

(編輯 郭 菁)

重慶市醫學科研計劃項目(No.2013-1-056)

周音頻(1969-)，男，博士， 副主任醫師，主要從事心內科疾病研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)07-1617-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.021