B7-H4分子在肺癌中的表達及其與Treg細胞的關系

王 鑫 劉 潔 李虎子

(天津醫科大學總醫院腫瘤內科，天津 300052)

B7-H4分子在肺癌中的表達及其與Treg細胞的關系

王 鑫 劉 潔1李虎子2

(天津醫科大學總醫院腫瘤內科，天津 300052)

目的 探討肺癌小鼠中B7-H4分子的表達與調節性T細胞(Treg)的變化及兩者之間的相關性。方法 C56BL/6雌性小鼠24只隨機分成對照組和肺癌組各12只。對照組小鼠皮下注射0.1 ml無菌生理鹽水；肺癌組小鼠皮下注射濃度為1×107/ml的0.1 ml Lewis肺癌細胞株懸液，于注射后14 d處死小鼠，通過蘇木素-伊紅(HE)染色驗證肺癌模型；酶聯免疫吸附(ELISA)檢測肺癌組織以及腹腔來源的巨噬細胞培養上清中白細胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ的分泌量；流式細胞術檢測小鼠肺癌組織以及腹腔來源的巨噬細胞表面B7-H4的表達以及脾臟、淋巴結中Treg細胞的比例及數量；并進一步分析其相關性。結果 與對照組比，肺癌組小鼠高表達B7-H4分子，并且分泌更多的IL-10、TNF-α以及較少的IFN-γ(P<0.05)；肺癌小鼠的脾臟、淋巴結中的Treg細胞比例以及總數均顯著高于對照組(P<0.05)；Treg細胞的絕對數與B7-H4的蛋白表達水平呈顯著正相關(r=0.64，P<0.05)。結論 在肺癌中，B7-H4分子高表達并與Treg細胞相互作用，對腫瘤的免疫調節發揮作用。

B7-H4；調節性T細胞；肺癌；白細胞介素-10

大多數肺癌患者就診時已是中晚期，治療效果較差，術后5年生存率低于15%〔1，2〕。研究表明惡性腫瘤患者的免疫處于耐受或缺陷狀態，機體通過改變表面分子的表達水平、分泌抑制性細胞因子及封閉表面抗原等方式逃避機體的免疫機制從而發生發展〔3，4〕。B7-H4分子是最近研究發現的一種與腫瘤免疫逃逸相關的分子，在正常組織中有大量mRNA水平的表達，但是蛋白質水平的表達較低，而在腫瘤細胞中，B7-H4分子在mRNA水平以及蛋白水平均高表達，可以通過抑制T細胞增殖和細胞因子分泌對T細胞的免疫應答進行負性調控〔5，6〕。調節性T細胞(Treg)是在腫瘤免疫耐受過程中發揮著重要作用的一種CD4+T細胞亞群，其關鍵轉錄因子為FoxP3，主要分泌的抑制性因子為白細胞介素(IL)-10、轉化生長因子(TGF)-β和IL-35等〔7，8〕。Treg細胞通過產生的IL-10能夠抑制肺癌腫瘤細胞的增殖。本研究分析B7-H4在肺癌組織中的表達以及Treg細胞比例和數量的變化，分析兩者之間可能存在的聯系，探討B7-H4在肺癌免疫逃逸機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組及構建肺癌模型 24只6～8 w的C56BL/6雌性小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，SPF級實驗室飼養，約15～20 g。小鼠肺癌細胞株Lewis購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，在本實驗室常規傳代培養，取對數生長期細胞，用胰酶消化，離心后收集細胞，調整細胞密度為1×108個/ml。隨機分成對照組及肺癌組，取小鼠Lewis肺癌細胞系培養后收集細胞，用生理鹽水重懸后臺盼藍染色，細胞活力>95%，取細胞進行計數，調整濃度為1×107/ml。肺癌組小鼠12只，皮下注射肺癌細胞株懸液0.1 ml，濃度為1×107/ml；對照組小鼠12只，皮下注射0.1 ml無菌生理鹽水。兩組小鼠于接種后14 d斷頸處死。兩組小鼠的體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 組織病理切片 取小鼠腫瘤組織最大面，避開過多的壞死組織部分，連續切片，厚度約2～3 mm，用4%甲醛固定，常規石蠟包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察組織病理。

1.3 流式細胞術測B7-H4的表達 荷瘤小鼠的肺癌組織用Ⅳ型膠原酶37℃消化后，過100目無菌濾網，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸細胞，濃度為2×106/ml，貼壁1.5 h后收集貼壁細胞；腹腔巨噬細胞用PBS作為腹腔灌洗液收集，收集后2 000 r/min離心10 min，取出后棄上清，將得到的細胞用完全1640重懸，置于孵箱5%CO2，37℃培養，24 h后用PBS洗去非黏附細胞，對貼壁細胞反復吹打得到腹腔巨噬細胞，經流式檢測其純度達到90%以上。用APC-F4/80、PE-B7-H4(購自美國BD公司)染色后分析，取正常小鼠、荷瘤小鼠腹腔來源的巨噬細胞，用PE-B7-H4孵育30 min，4℃，PBS洗滌2次后，重懸細胞，4%多聚甲醛固定后用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。

1.4 流式細胞術檢測調節性T細胞的比例 通過斷頸將小鼠處死，提取小鼠脾臟、腸系膜淋巴結，研磨制成單細胞懸液，并進行白細胞計數，調整細胞懸液濃度，并取2×106個細胞用PE-CD4、FITC-CD25、APC-FoxP3(購自美國BD公司)標記Treg細胞，避光孵育后PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定后進行流式細胞學檢測，采用FlowJo分析得出Treg細胞占總CD4+T細胞的比例，并換算出Treg細胞的數量。

1.5 酶聯免疫吸附(ELISA)檢測IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ的分泌量 按照ELISA試劑盒(購自R&D公司)說明書，將上述取得的巨噬細胞采用完全培養基在體外培養24 h，收集培養上清，梯度稀釋后加入包被好的反應孔中，37℃孵育1 h后洗滌，在反應孔中加入稀釋后的酶標抗體，37℃孵育1 h后加入顯色液，37℃孵育30 min后終止反應，用酶標儀(Bio-Rad model 550)在450 nm處檢測OD值。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD多重比較及Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 HE染色驗證肺癌模型的建立 皮下接種肺癌細胞株，成瘤率100%，并且在14 d后進行剖殺，取腫瘤組織進行HE染色，在顯微鏡下觀察到癌細胞被纖維組織分隔成大小不等的癌巢，癌細胞呈圓形或橢圓形，細胞大小不等，胞質呈偏嗜堿性。見圖1。

圖1 肺癌組織HE染色

2.2 流式細胞術檢測小鼠B7-H4分子的表達 同型對照小鼠B7-H4表達(0.6±0.3)%，對照組巨噬細胞B7-H4分子表達非常微弱〔(2.4±0.5)%〕，而荷瘤小鼠腹腔來源及腫瘤組織來源的巨噬細胞B7-H4表達〔(20.3±2.0)%,(17.2±3.1)%〕均明顯高于正常小鼠腹腔來源的巨噬細胞上的B7-H4表達(P<0.05)。

2.3 各組巨噬細胞分泌的IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較 肺癌組巨噬細胞分泌的IL-10〔肺癌組織：(506±10)pg/ml，腹腔：(562±18)pg/ml〕、TNF-α〔肺癌組織：(1 605±139)pg/ml，腹腔：(1 780±115)pg/ml〕水平明顯高于對照組〔(254±13)pg/ml、(527±28)pg/ml〕(P<0.05)，而IFN-γ水平〔肺癌組織：(95±8)pg/ml，腹腔：(172±10)pg/ml〕明顯低于對照組〔(738±40)pg/ml〕(P<0.05)。

2.4 流式細胞術檢測脾臟、淋巴結中Treg細胞的比例和數量 肺癌組小鼠脾臟以及淋巴結中的Treg細胞比例〔(13.7±1.8)%、(16.2±2.8)%〕以及數量〔(720±97)×103,(350+15)×103〕均顯著高于對照組〔(3.3±0.4)%、(4.9±0.4)%；(312±68)×103,(119±21)×103〕(P<0.05)。

2.5 B7-H4分子表達水平與Treg細胞絕對數的相關性 Treg細胞的絕對數即小鼠脾臟、淋巴結中Treg細胞的總數與B7-H4分子的蛋白表達水平呈顯著正相關(r=0.64，P<0.05)。

3 討 論

Treg細胞有著獨特的免疫負調節作用，當Treg細胞過多時，機體中的正常免疫系統受到抑制，將無法正常發揮免疫效應，而當Treg細胞過少時，則會發生自身免疫性疾病〔9〕。研究發現，腫瘤患者體內免疫效應降低，免疫缺失與患者體內更多的CD4+CD25+FoxP3+的Treg細胞密切相關〔10〕。提示在肺癌發生發展的過程中，Treg細胞占總CD4+T細胞的比例不斷增加，將增強機體其他免疫細胞的抑制作用，而機體免疫效應細胞的能力減弱，腫瘤得以進一步發展，增加了腫瘤細胞發生免疫逃逸的可能。B7-H4分子作為新近發現的負性調節分子在腫瘤中的作用逐漸受到關注，研究發現，在結腸癌、侵襲性導管癌等腫瘤中B7-H4分子高度表達，并且可以抑制效應T細胞的功能。本實驗研究發現正常小鼠腹腔來源的巨噬細胞僅微弱表達B7-H4分子，而荷瘤小鼠無論是腹腔來源還是腫瘤組織來源的巨噬細胞均高表達B7-H4分子，提示在肺癌形成的微環境中B7-H4分子可能發揮著重要的作用。本文進一步檢測了多種炎癥因子，結果提示B7-H4分子可能是通過分泌IL-10、TNF-α等細胞因子作用于T細胞發揮免疫逃逸的作用。另外，進一步觀察了免疫抑制細胞Treg在肺癌小鼠脾臟、淋巴結中的變化，結果提示B7-H4分子在腫瘤發生發展中與Treg細胞之間可能存在相互作用的關系，B7-H4分子可能是通過分泌大量的IL-10、TNF-α作用于Treg細胞對免疫調節發揮作用的。然而，B7-H4分子到底是否通過細胞因子IL-10、TNF-α作用于Treg細胞還有待進一步的研究。本研究為腫瘤免疫逃逸現象的機制研究提供了新的實驗依據，并為肺癌治療提供了新的靶標。

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10 Cao C，Ma T，Chai YF，etal.The role of regulatory T cells in immune dysfunction during sepsis〔J〕.World J Emerg Med，2015；6(1)：5-9.

〔2016-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

1 天津市第三中心醫院呼吸科 2 天津中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科

劉 潔(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事呼吸道腫瘤研究。

王 鑫(1985-)，男，碩士，住院醫師，主要從事呼吸、泌尿腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1611-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.018