大鼠結膜杯狀細胞的體外培養及鑒定

何 敏 趙長青 武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫科大學第二醫院眼科，山西 太原 030001)

大鼠結膜杯狀細胞的體外培養及鑒定

何 敏 趙長青1武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫科大學第二醫院眼科，山西 太原 030001)

目的 體外分離、培養大鼠結膜杯狀細胞，觀察其形態、結構等生物學特征。方法 取大鼠穹隆部結膜，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中行組織塊培養，5～7 d后酶消化法傳代。觀察原代及傳代細胞的形態及生長情況，并應用特殊免疫組化染色方法分別對原代、傳代培養的杯狀細胞進行鑒定，用ImageJ軟件計算細胞純度。結果 倒置相差顯微鏡下可見杯狀細胞呈鵝卵石樣，5～7 d在組織塊周圍形成環狀結節。免疫組化結果顯示，培養的原代細胞角蛋白(CK)4染色陰性，CK7染色陽性，且CK7陽性細胞數占(97.3±2.0)%。傳代杯狀細胞中，絕大多數凝集素UEA-I染色為陽性，陽性細胞占(91.2±2.7)%。結論 大鼠穹窿部結膜可以成功培養出杯狀細胞，傳代細胞仍保持原代細胞特性，且純度較高。

結膜杯狀細胞；細胞培養

結膜上皮是構成眼表的重要結構，它不僅是眼表抵御外界環境干擾的一道屏障，而且對于維持眼表的健康、維持視覺質量都起到重要作用。結膜上皮由復層鱗狀上皮細胞和杯狀細胞組成，它們除了可以分泌水和電解質，還分泌黏蛋白。其中杯狀細胞分泌的大分子糖蛋白是淚膜的主要成分，也是構成淚液中可溶性黏液的主要部分，對于維持眼表的健康意義重大。越來越多的實驗證明，杯狀細胞不僅參與分泌黏蛋白，而且黏蛋白的分泌受到組胺、白介素、上皮生長因子等調節〔1～3〕，它已被認為是一種免疫細胞，參與了眼表的免疫反應〔4〕。因此對于杯狀細胞的研究已經成為近年來研究的熱點。

對于結膜杯狀細胞體外培養的研究國外學者已有較多報道〔5～7〕，但國內只有較少的學者對人和兔的結膜杯狀細胞進行了研究〔8，9〕。因為人的正常結膜組織來源有限，因此本實驗通過對大鼠的結膜杯狀細胞進行分離、培養、傳代及鑒定，為進一步深入研究杯狀細胞的病理生理特性提供可靠的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，出生后4～6 w，體重125～150 g，山西醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物及所有實驗得到了山西醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑 RPMI1640培養基來源于美國BioWhittaker公司，抗細胞角蛋白(CK)7鼠抗體來源于美國Santa Cruz生物技術公司，抗細胞CK4兔抗體來源于美國Abcam生物技術公司，交聯FITC的凝集素UEA-I來源于美國Pierce公司，胎牛血清來源于美國Hyclone公司。Cy3抗鼠IgG，Cy2抗兔IgG來源于美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.3 方法

1.3.1 結膜杯狀細胞的分離、培養及傳代 大鼠于CO2室箱內約1～2 min后致死，斷頭，從雙眼取穹窿部結膜。將取下的組織放于盛有完全RPMI 1 640 培養基(包含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 μg/ml青鏈霉素，10 mmol/L Hepes緩沖液，1 mmol/L丙酮酸鈉，1%100×非必需氨基酸混合物)的塑料器皿中，于顯微鏡下將結膜下脂肪及筋膜組織剔除，并將其切割成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，更換培養液后備用。取六孔板，每孔加0.5 ml的完全RPMI 1 640培養基。將分割好的結膜組織塊分散放于培養皿底部，每孔約8～10塊組織，然后放于37℃含95% O2、5% CO2的孵箱內。48 h后，小心補充0.5 ml的培養基，防止組織塊松動、漂浮。3 d后全量換液。

1.3.2 結膜杯狀細胞的傳代 5～7 d后，取出培養皿，在顯微鏡下用標記筆標出組織塊周圍的杯狀細胞，并用刮板將成纖維細胞刮除。吸出培養皿底部的組織塊及培養液，用PBS液清洗3次，每次約加入1 ml。然后室溫下加入1 ml Versene液8～10 min，以分散細胞。吸出Versene，每孔加入0.25 mol/L的胰蛋白酶1～1.5 ml，在37℃孵育箱內放置約10 min。然后每孔加入完全培養液 1.5 ml，終止消化。用吸管反復輕柔吹打1～2 min。將混合液吸入50 ml離心管，用離心機1 000 r/min，離心10 min，吸除上清液，加入完全RPMI 1640培養液，反復吹打5 min，重懸細胞，然后接種于24孔或6孔板，每孔約0.5 ml或者1.0 ml，接種密度為每孔(5～10)×104。初始換液24～48 h，以后2～3 d換液一次。待細胞鋪滿80%后使用。

1.3.3 大鼠結膜杯狀細胞的鑒定

1.3.3.1 形態學檢查 在光學顯微鏡下觀察原代及傳代杯狀細胞的形態、大小、生長情況并進行拍照。

1.3.3.2 原代杯狀細胞鑒定及純度分析 將大鼠結膜上皮組織塊直接種植在盛有載玻片的培養皿上原代培養，7 d后吸出培養液，用1×PBS液清洗1次，加入1 ml甲醇固定15～30 min，然后吸出甲醇，用1×PBS液漂洗3次。再加入2 ml 1×PBS液放于4℃冰箱保存待用。將固定好的載玻片取出，放于固定架上，浸于盛有1×PBS液的燒杯中，于搖床上清洗5 min。將載玻片放入 2%BSA 封閉液中，在搖床上輕搖30 min～2 h。 取出載玻片，將1∶100的含CK7 抗體和CK4抗體的0.2% BSA稀釋液浸滿載玻片表面，放置于濕盒內于4℃冰箱孵育過夜。1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對照組。取出載玻片，在搖床上用1×PBS液漂洗3次，每次10 min。制備新的BSA稀釋液，室溫下加入1∶300的Cy3和Cy2混合液孵育1 h(避光)。再用1×PBS液漂洗3次，用含有DAPI的封片劑封片。在暗箱內風干過夜，次日在熒光顯微鏡下觀察。選取組織塊和環狀細胞結節外圍之間3、6、9、12點鐘的等距位置，用ImageJ 1.48v軟件計算DAPI核染色陽性的總細胞數及CK7 和CK4 陽性細胞，并計算各自百分比。

1.3.3.3 傳代杯狀細胞的鑒定及純度分析 將消化后的細胞接種在盛有載玻片的培養皿上，然后固定(方法同上)。將1∶100的含CK7 抗體的稀釋液浸滿載玻片表面，1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對照組，放置于濕盒內于4℃冰箱孵育過夜。在1 ml稀釋液中加入2 μl UEA-I(與FITC熒光素共軛)抗體。600 μl上述UEA-I溶液加入2 μl Cy3(2抗)制備成Cy3混合液。孵育1 h(避光)。封片后熒光顯微鏡下觀察。隨機選取4個鏡下視野，用ImageJ 1.48v軟件計算DAPI核染色陽性的總細胞數、UEA-I 陽性細胞及CK7陽性細胞，并計算各自所占百分比。

2 結 果

2.1 杯狀細胞分離、生長及形態 在細胞培養的24 h內，組織塊周邊可見有貼附的細胞。36～48 h后，鵝卵石樣的杯狀細胞清晰可見。在原代培養的5～7 d，杯狀細胞圍繞在組織塊周圍形成環形結節(圖1)。但并不是每一個組織塊都形成環形結節，在5 d左右的時間將未生長出細胞的結節去除，此外有些組織塊在生長至3～5 d時在環形結節的外圍可見有梭形的成纖維細胞。為了使細胞得以純化，這些成纖維細胞在傳代時需要被仔細刮除。杯狀細胞呈鵝卵石樣，大小相近，在顯微鏡下可見其表面有小滴，這是其分泌的黏蛋白。隨著杯狀細胞的增生，蛋白小滴也增多。當細胞增生到一定程度后，即原代培養5～7 d后，用酶消化法傳代，傳代的細胞在形態上與原代相似。

圖1 大鼠穹隆結膜組織塊在含10%胎牛血清的RMPI 1640培養液中培養7 d后形成的環狀結節(×40)

2.2 原代杯狀細胞CK7和CK4鑒定及純度分析 培養的原代細胞CK4陰性、CK7染色陽性，證明培養的細胞為杯狀細胞(圖2)。對3個不同來源的結膜組織的標本進行染色計算，CK7陽性細胞占(97.3±2.0)%，CK4陽性細胞占(0.1±0.1)%。在正常老鼠IgG 陰性對照組中未見熒光染色陽性。

2.3 傳代細胞UEA-I和CK7鑒定及純度分析 對3個不同來源的結膜組織的標本進行染色計算，傳代培養的一代杯狀細胞中UEA-I染色陽性細胞占(91.2±2.7)%，CK7染色陽性細胞占(92.4±3.2)%，進一步證明傳代后的杯狀細胞仍保留有原來的功能和特性，且具有較高純度。見圖3。

A.培養的細胞核被DAPI染為藍色;B.CK4 染色，陽性細胞胞漿中間絲染為綠色，但培養的細胞染色為陰性;C.CK7 染色，陽性細胞胞漿中間絲染為紅色;D.ABC融合后的圖像圖2 原代培養結膜杯狀細胞的鑒定(×200)

圖3 一代結膜杯狀細胞的鑒定(×400)

3 討 論

隨著環境及生活方式的改變，干眼、過敏性結膜炎等眼表疾病也越來越受到人們關注。其中，杯狀細胞在維持眼表的完整性及在眼表疾病免疫調節中的作用也開始被人們認識。為了進一步研究杯狀細胞的結構、功能以及它對于環境、物理、化學等因素影響的變化，需要我們建立一個優質的體外細胞模型。本實驗研究取材于大鼠的上下穹窿部結膜，相對于球結膜和瞼結膜，穹窿部結膜的杯狀細胞增生能力更高〔10〕。使用加入L-谷氨酰胺、抗生素、小牛血清的RPMI 1640培養基后，大鼠結膜的杯狀細胞可以在24 h內就從穹窿結膜組織中分離出來，并增生形成環狀結節。因為杯狀細胞分泌黏蛋白，使得杯狀細胞與培養皿黏附緊密，因此在傳代時需要加入乙二胺四乙酸(Versense)，使得貼服的細胞更容易離散。培養5～7 d時有些組織塊的環形細胞結節周邊可見有梭形的成纖維細胞增生，因此在傳代過程中，要仔細刮除這些成纖維細胞，使細胞得以純化，實驗證明傳代后的細胞仍然完整保留有杯狀細胞標記和功能活動，且純度較高。

CK是一種中間絲，它是一類存在于上皮細胞中的結構蛋白，具有極高的保守性和組織分化特異性，與上皮細胞的增殖分化密切相關。其中CK7是分泌性上皮細胞的標志物，不僅是一些上皮惡性腫瘤細胞的標記物，而且在正常組織中也是杯狀細胞的特異標志〔11〕。CK4是復層鱗狀上皮細胞的標志物，見于舌、會厭及食道上皮組織，在結膜組織中，它是非杯狀細胞的復層鱗狀上皮細胞的特異標志〔12〕。本實驗通過免疫組化染色，證明所培養細胞是結膜杯狀細胞。

凝集素UEA-I是一種高分子量的糖復合物，它是杯狀細胞分泌產物中糖蛋白上的L-巖藻糖，存在于細胞體內，染色陽性表現為繞核分布的胞質著色，呈囊泡狀〔13〕。我們發現，傳代的杯狀細胞的UEA-I及CK7陽性率均在90%以上，且形態和原代相似，進一步表明經過酶消化法傳代的杯狀細胞仍具有原代杯狀細胞的形態和特性，一般傳3～5代杯狀細胞形態及功能未發生改變，一代的杯狀細胞性狀更穩定，常用于體外實驗研究〔5〕，可以作為細胞模型用于進行體外生物學研究。

本研究表明，選取大鼠的穹窿部結膜，可以分離和培養出結膜杯狀細胞，且消化傳代后的細胞仍然完整保留有杯狀細胞的標記和功能，且純度較高，可以為今后進一步研究杯狀細胞相關的眼表疾病提供有效的細胞模型。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 徐 杰)

山西省回國留學人員科研資助項目(2016-062)

1 山西醫科大學第二醫院耳鼻喉科

趙長青(1961-)，男，教授，主任醫師，博士，主要從事變應性鼻炎的發病機制研究。

何 敏(1975-)，女，碩士，講師，主要從事眼表疾病及眼免疫研究。

R33

A

1005-9202(2017)07-1585-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.009