DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B4過表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系*

張成海閆少春鄒明新居紅格

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B4過表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系*

張成海①④閆少春②鄒明新③居紅格④

目的：探究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）在腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制。方法：收集2012年1月至12月15例內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院術(shù)前均未結(jié)予放化療并行腎癌根治術(shù)患者的組織標(biāo)本，均經(jīng)病理證實(shí)為ccRCC。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡、聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制酶分析法和甲基化特異PCR等方法檢測(cè)ccRCC組織中DNMT的mRNA表達(dá)，及ccRCC組織中整體甲基化（global methylation）水平和抑癌基因RASSF1A甲基化和表達(dá)水平。結(jié)果：ccRCC組織中DNMT3B4的mRNA表達(dá)增加，同時(shí)其蛋白含量也相應(yīng)增加。ccRCC患者癌組織中DNA重復(fù)序列Alu的甲基化水平0.106±0.04較癌旁組織中0.115±0.03低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而腫瘤抑制基因RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化，其mRNA和蛋白的表達(dá)均降低。結(jié)論：DNMT3B4基因過表達(dá)可能與染色體不穩(wěn)定以及RASSF1A基因低表達(dá)有關(guān)，在ccRCC的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要的角色。

腎透明細(xì)胞癌 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 Alu RASSF1A

全世界每年確診的成人惡性腫瘤中腎癌的發(fā)病率占2%～3%［1］。腎癌最常見的病理類型為腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC），其中腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為最主要的一種類型，占RCC的60%～85%［2］。DNA甲基化主要是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）調(diào)控，有催化活性的DNMT又分為DNMT1、DNMT3A與DNMT3B。DNMT1在DNA復(fù)制過程中主要起到維持甲基化的作用，而DNMT3A與DNMT3B主要負(fù)責(zé)從頭（de novo）甲基化來修飾未甲基化的DNA［3］。癌細(xì)胞中DNA發(fā)生異常甲基化，其DNMT的表達(dá)也往往發(fā)生異常。Robertson等［4］發(fā)現(xiàn)腫瘤中DNMT3B的表達(dá)顯著增加，而DNMT1與DNMT3A只是輕微的增加。DNMT3B在不同類型腫瘤中的顯著增加表明其在腫瘤的形成過程中扮演著重要的角色［5］。

通過對(duì)RCC中多基因甲基化分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化常導(dǎo)致多個(gè)抑癌基因同時(shí)被沉默［6］。另有研究表明，在RCC中LINE-1與Alu重復(fù)序列的甲基化水平發(fā)生顯著變化［7］。因此可見，DN?MT在RCC的DNA甲基化過程中起到了重要的作用。由于DNMT3B有近40種異構(gòu)體，因此本研究旨在探討DNMT3B異構(gòu)體與ccRCC之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2012年1月至12月內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的15例ccRCC患者的組織標(biāo)本，患者年齡為38～75歲，所有患者術(shù)前均未予任何放化療，均經(jīng)病理證實(shí)為ccRCC。排除有嚴(yán)重的急性感染或同時(shí)患有其他腫瘤的患者。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.1.2 主要試劑 DNA抽提試劑盒和Rnaeasy Mini Kit試劑盒（美國Qiagen公司），反轉(zhuǎn)錄SuperscriptⅢ試劑盒（美國Invitrogen公司），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），BCA試劑盒（美國Pierce公司），抗DN?MT3B抗體（美國Novus公司），抗RASSF1A和抗βactin抗體（美國Abcam公司），DNA甲基化試劑盒（美國Zymo公司），Mbol I內(nèi)切酶（大連Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR 使用Rnaeasy Mini Kit提取總RNA，SuperscriptⅢ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列見表1。在7900型快速實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)型系統(tǒng)進(jìn)行（美國，ABI公司）。各靶基因的CT值通過內(nèi)參基因β-actin的CT值均一化，即△CT=CTtarget-CTβ-actin，各靶基因的相對(duì)豐度值以△△CT值表示，△△CT=2-ΔCT。

1.2.2 蛋白印記檢測(cè) 使用RIPA裂解液于冰上提取蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，取40 μg的蛋白進(jìn)行電泳。恒流30 mA電泳2 h，恒流400 mA冰浴中轉(zhuǎn)膜3 h，10%脫脂奶粉封閉1 h，4℃搖床，分別孵育抗DNMT3B、抗RASSF1A和抗β-actin的一抗過夜，次日TBST洗膜后分別孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗1 h，再次TBST洗膜后曝光，并用ImageJ進(jìn)行灰度分析。以β-actin為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)蛋白印跡中各條帶的相對(duì)豐度值。

1.2.3 基因整體甲基化水平檢測(cè) 重復(fù)序列Alu甲基化水平即代表基因整體甲基化水平。按照DNA抽提試劑盒提取癌組織與癌旁組織中基因組DNA，再按照DNA甲基化試劑盒說明書操作進(jìn)行甲基化修飾。以甲基化的DNA作為模板，聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制酶分析法（COBRA）分析Alu基因甲基化水平，PCR擴(kuò)增Alu基因。Alu正向引物序列為5'-GATCTTTTTATTAAAAATA TAAAAATTAGT-3'；Alu反向引物序列為5'-GATCCCA AACTAAAATACAATAA-3'［8］。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)10 U/μL Mbol I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR擴(kuò)增獲得的目的條帶通過Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描及分析。Alu基因甲基化率=甲基化條帶的灰度值/甲基化條帶的灰度值+非甲基化條帶的灰度值。

1.2.4 甲基化特異性PCR檢測(cè) 通過甲基化特異性PCR（MSPCR）檢測(cè)15例ccRCC患者的癌組織及癌旁組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。根據(jù)Greenspan等［9］報(bào)道設(shè)計(jì)MSPCR的引物和設(shè)置MSP?CR反應(yīng)條件，并分別設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，0.5 μg/mL的溴化乙錠染色，紫外凝膠分析儀觀察并拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

表1 引物序列（續(xù)表1）Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 ccRCC患者的癌組織與癌旁組織中DNMT的mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ccRCC患者的癌組織與癌旁組織中DNMT1、DNMT3A與總DNMT3B的mRNA表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），而DNMT3B4在癌組織中mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05），其他DNMT3B異構(gòu)體mRNA在ccRCC患者的癌組織與癌旁組織中表達(dá)未見顯著性差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組織中DNMT3B4的mRNA表達(dá)Figure 1 Real-time PCR analysis of DNMT3B4 mRNA levels in ccRCC and adjacent normal tissues

2.2 ccRCC患者的癌組織與癌旁組織中DNMT3B4的蛋白表達(dá)

蛋白印跡檢測(cè)15例ccRCC患者癌組織與癌旁組織中DNMT3B4的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示5例患者的癌組織中DNMT3B4的蛋白陽性表達(dá)，而其癌旁組織中只有1例DNMT3B4的蛋白陽性表達(dá)（圖2）。

2.3 ccRCC患者的癌組織與癌旁組織中基因整體甲基化變化

15例ccRCC患者的癌組織及癌旁組織中Alu基因的相對(duì)甲基化水平分別為0.106±0.04及0.115± 0.03，癌組織中Alu基因甲基化水平比癌旁組織低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.4 ccRCC患者中RASSF1A的mRNA與蛋白表達(dá)

MSPCR法檢測(cè)ccRCC患者中癌組織與癌旁組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率分別為（0.745± 0.11）%與（0.692±0.12）%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4A、4B），但RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平輕微上調(diào)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ccRCC患者癌組織與癌旁組織中RASSF1A基因的mRNA表達(dá)量。ccRCC癌組織與癌旁組織中RASSF1A的mRNA相對(duì)豐度值分別為0.032±0.009和0.0923±0.028，二者比較具有顯著性差異（P＜0.05，圖4C）。蛋白印跡檢測(cè)RASSF1A蛋白分子量為39 kDa（圖4D）。ccRCC相應(yīng)組織和癌旁組織中RASSF1A蛋白對(duì)β-actin的相對(duì)豐度值分別為0.547± 0.099和0.105±0.0451（圖4E），與癌旁組織相比，ccRCC蛋白的相對(duì)豐度值降低了2倍多，具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 蛋白印跡檢測(cè)ccRCC組織DNMT3B4的蛋白表達(dá)Figure 2 Western blot analysis of DNMT3B4 expression in ccRCC and adjacent normal tissues

圖3 ccRCC組織中Alu序列甲基化水平分析Figure 3 Methylation of Alu sequences in both ccRCC and adjacent normal tissues

圖4 ccRCC組織中RASSF1A表達(dá)及甲基化水平檢測(cè)Figure 4 RASSF1A expression and methylation in ccRCC and adjacent normal tissues

3 討論

DNA甲基化常以一些特定模式出現(xiàn)在癌細(xì)胞中，這種模式稱為“DNA甲基化簽名”，并作為許多癌癥的標(biāo)志物［10］。到目前為止，究竟是哪種DNMT導(dǎo)致RCC的DNA甲基化發(fā)生模式轉(zhuǎn)變尚不清楚。本研究通過檢測(cè)ccRCC癌組織與癌旁組織中DNMT1、DN?MT3A、DNMT3B以及DNMT3B六種異構(gòu)體的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，只有DNMT3B4的mRNA過表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)DNMT3B4蛋白水平高表達(dá)，結(jié)果顯示DNMT3B4過表達(dá)與ccRCC密切相關(guān)。因此，DNMT3B4過表達(dá)在ccRCC的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

有關(guān)DNMT與DNA甲基化模式轉(zhuǎn)變關(guān)系的報(bào)道結(jié)論不一。Ostler等［11］研究表明DNMT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與癌細(xì)胞中DNA的甲基化水平無關(guān)；但其他研究表明DNMT3B在不同類型腫瘤組織中過表達(dá)，并且對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化起到重要作用［4，12-13］。結(jié)論的差異解釋為有的研究檢測(cè)某種特定異構(gòu)體而有的研究檢測(cè)總DNMT3B［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在ccRCC癌組織及癌旁組織中DNMT1、DNMT3A與總DNMT3B的mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而DNMT3B4的mRNA過表達(dá)。DNMT3B3是細(xì)胞中占主導(dǎo)地位的異構(gòu)體［14］，DNMT3B有近40種異構(gòu)體，如果只有一個(gè)或多個(gè)異構(gòu)體發(fā)生改變，而且該異構(gòu)體相對(duì)于DN?MT3B3的豐度值低，在ccRCC癌組織及癌旁組織中總DNMT3B的mRNA水平表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究驗(yàn)證了DNMT3B4的mRNA相對(duì)豐度值與總DNMT3B的mRNA相對(duì)豐度值比例為1/1000，因此DNMT3B4過表達(dá)可能引起DNA甲基化模式的改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種DNMT3B的異構(gòu)體形式，DNMT3B異構(gòu)體根據(jù)是否具有DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性分為有轉(zhuǎn)移酶活性和無轉(zhuǎn)移酶活性［3］兩類。DN?MT3B4由于不含保守序列IX與X，導(dǎo)致其缺乏DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，該保守序列主要負(fù)責(zé)調(diào)控酶的活性，因此DNMT3B4主要對(duì)DNA甲基化起到負(fù)調(diào)控的作用。本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC的重復(fù)序列Alu基因甲基化水平降低，DNMT3B4過表達(dá)能夠誘導(dǎo)Alu等重復(fù)序列發(fā)生低甲基化而導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，甚至發(fā)生重排繼而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

DNMT3B4過表達(dá)也可能誘導(dǎo)抑癌基因發(fā)生高甲基化。Duymich等［15］認(rèn)為，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中均會(huì)出現(xiàn)DNA甲基化異常，該異常部分由具有轉(zhuǎn)移酶活性的DNMT3B蛋白調(diào)節(jié)，而無轉(zhuǎn)移酶活性的DN?MT3B異構(gòu)體可能是作為調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。但本研究并未發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在ccRCC癌組織與癌旁組織間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究的樣本例數(shù)較少有關(guān)。

總之，本研究通過檢測(cè)ccRCC組織中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B以及DNMT3B的六種異構(gòu)體表達(dá)發(fā)現(xiàn)，只有DNMT3B4過表達(dá)并可能引發(fā)DNA整體甲基化水平降低和抑癌基因RASSF1A甲基化變化，進(jìn)而參與ccRCC的發(fā)生發(fā)展。

[1] Aron M,Nguyen MM,Stein RJ,et al.Impact of gender in renal cell carcinoma:an analysis of the SEER database[J].Eur Urol,2008,54 (1):133-140.

[2] Becket E,Chopra S,Duymich CE,et al.Identification of DNA Methylation-Independent Epigenetic Events Underlying Clear Cell Renal Cell Carcinoma[J].Cancer Res,2016,76(7):1954-1964.

[3] Shao G,Zhang R,Zhang S,et al.Splice variants DNMT3B4 and DNMT3B7 overexpression inhibit cell proliferation in 293A cell line[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim,2015,51(2):210.

[4] Robertson KD,Uzvolgyi E,Liang G,et al.The human DNA methyltransferases(DNMTs)1,3a and 3b:coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors[J].Nucleic Acids Res, 1999,27(11):2291-2298.

[5] Chen MF,Lu MS,Lin PY,et al.The role of DNA methyltransferase 3b in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer,2012,118 (16):4074-4089.

[6] Shenoy N,Vallumsetla N,Zou Y,et al.Role of DNA methylation in renal cell carcinoma[J].J Hematol Oncol,2015,8:88.

[7] Avissar-Whiting M,Koestler DC,Houseman EA,et al.Polycomb group genes are targets of aberrant DNA methylation in renal cell carcinoma[J].Epigenetics,2011,6(6):703-709.

[8] Yang AS,Estécio MR,Doshi K,et al.A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite PCR of repetitive DNA elements[J].Nucleic Acids Res,2004,32(3):e38.

[9] Greenspan EJ,Jablonski MA,Rajan TV,et al.Epigenetic alterations in RASSF1A in human aberrant crypt foci[J].Carcinogenesis,2006, 27(7):1316-1322.

[10]Fleischer T,Klajic J,Aure MR,et al.DNA methylation signature (SAM40)identifies subgroups of the Luminal A breast cancer samples with distinct survival[J].Oncotarget,2017,8(1):1074-1082.

[11]Ostler KR,Davis EM,Payne SL,et al.Cancer cells express aberrant DNMT3B transcripts encoding truncated proteins[J].Oncogene, 2007,26(38):5553-5563.

[12]Kanai Y,Saito Y,Ushijima S,et al.Alterations in gene expression associated with the overexpression of a splice variant of DNA methyltransferase 3b,DNMT3b4,during human hepatocarcinogenesis[J]. J Cancer Res Clin Oncol,2004,130(11):636-644.

[13]Saito Y,Kanai Y,Sakamoto M,et al.Overexpression of a splice variant of DNA methyltransferase 3b,DNMT3b4,associated with DNA hypomethylation on pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99 (15):10060-10065.

[14]Su X,Lv C,Qiao F,et al.Expression pattern and clinical significance of DNA methyltransferase 3B variants in gastric carcinoma[J].Oncol Rep,2010,23(3):819-826.

[15]Duymich CE,Charlet J,Yang X,et al.DNMT3B isoforms without catalytic activity stimulate gene body methylation as accessory proteins in somatic cells[J].Nat Commun,2016,7:11453.

（2016-12-15收稿）

（2017-03-22修回）

Relationship between the overexpression of DNA methyltransferase 3B4 and clear cell renal cell carcinoma

Chenghai ZHANG1,4,Shaochun YAN2,Mingxin ZOU3,Hongge JU4
1Department of Surgical Oncology,Inner Mongolia Bao Gang Hospital,Baotou 014010,China;2Biomedicine Research Center and Basic Medical Department,Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China;3Faculty of Biology Science and Technology,Baotou Teachers,College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China;4Department of Pathology,First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia,Baotou 014010,China

Mingxing ZOU;E-mail:zoumingxin@126.com

Objective:To determine the molecular role of DNA methyltransferase(DNMT)in kidney tumorigenesis.Methods:Tissue samples consisted of 15 cancer tissues and 15 matched adjacent tissues from clear cell renal cell carcinoma(ccRCC)patients who had undergone nephrectomy in 2012 at the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Science and Technology University of Inner Mongolia were collected.Real-time PCR,Western blot,combined bisulfite restriction analysis(COBRA)and methylation specific PCR were used in this study.Real-time PCR was used to examine the mRNA expression levels of DNMT.The global methylation level,DNA methylation level,and the expression of the antioncogene RASSF1A in ccRCC tissues were concurrently detected.Results:Both mRNA and protein levels of DNMT3B4,a splice variant of DNMT3B,were elevated in renal cell carcinoma tissue compared with those in control tissue.Additionally,Alu was hypomethylated in ccRCC tissue(0.106±0.04)compared with control tissue(0.115±0.03)(P＜0.05).Furthermore,the methylation of the promoter for RASSF1A,a tumor-suppressor gene,moderately increased in renal cell carcinoma tissue.By contrast,RASF1A expression decreased.Conclusion:DNMT3B4 overexpression may play an important role in human kidney tumorigenesis via chromosomal instability and the decreased expression of RASSF1A.

clear cell renal cell carcinoma,DNA methyltransferase,Alu,RASSF1A

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.06.422

①內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院腫瘤外科（內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市014010）；②內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；③內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；④內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81360316）資助

鄒明新 zoumingxin@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360316)

張成海 專業(yè)方向?yàn)槟[瘤綜合治療。

E-mail：yanshaochunby@163.com