楊樹次生壁纖維素合酶的表達與互作模式分析

魏凱莉，周厚君,江 成,趙巖秋，宋學勤,2*，盧孟柱,2

(1.國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091; 2.南方現代林業協同創新中心，南京林業大學,南京 210037)

楊樹次生壁纖維素合酶的表達與互作模式分析

魏凱莉1，周厚君1,江 成1,趙巖秋1，宋學勤1,2*，盧孟柱1,2

(1.國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091; 2.南方現代林業協同創新中心，南京林業大學,南京 210037)

[目的]纖維素的合成在木材形成過程中具有重要的作用，纖維素合酶(Cellulose Synthase，CESA)是參與纖維素合成的關鍵酶。由于3種CESA形成一個有功能的纖維素合酶復合體，而楊樹中包含CESA4、CESA7A、CESA7B、CESA8A和CESA8B5種次生壁CESA，本文從這5種CESA的表達模式與互作分析入手，探討了其在次生壁纖維素合成中的工作模式。[方法]利用RNA-seq與基因芯片數據進行基因表達分析，揭示5種次生壁CESA在根、莖、葉組織的表達模式與次生維管再生過程中的表達變化。利用啟動子驅動的GUS轉基因材料GUS染色分析與實時定量PCR揭示5種次生壁CESA在各個組織的表達模式與在激素處理下的響應模式。利用熒光素酶互補實驗揭示CESA7A、CESA7B、CESA8A與CESA8B之間的互作模式。[結果]基因表達分析表明，楊樹5種次生壁CESA基因在楊樹成熟莖中高表達，尤其在次生維管組織發育的后期高表達，表明其主要參與木材次生壁纖維素的合成。對啟動子驅動的GUS轉基因材料觀察表明，CESA4、CESA7B、CESA8A和CESA8B的GUS信號在楊樹莖和葉中較強，但這些次生壁CESA的表達模式存在一定的差異，這種差異在葉脈中表現地尤為明顯。此外，在赤霉素GA3和細胞分裂素6-BA處理下，楊樹次生壁CESA的表達量顯著上調；在生長素NAA、油菜素內酯BR和乙烯處理下，楊樹次生壁CESA的表達量下調，但不同的CESA對激素響應的表達量變化幅度存在差異。熒光素酶互補實驗表明，楊樹次生壁CESA7B和CESA8B、CESA7B和CESA8A、CESA7A與CESA8B之間存在互作，說明它們之間可以形成復合體。[結論]這些數據顯示楊樹5種次生壁CESA基因在不同組織與不同激素處理下的表達變化存在一定的差異，而它們之間均能互作，提示楊樹5個次生壁CESA基因雖然具有同等的能力形成功能性的纖維素合酶復合體，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式，進而會導致木材成分的差異。

纖維素合酶CESA;次生壁;表達分析;互作;激素;楊樹

纖維素是植物細胞壁的主要多糖類組成成分[1]。根據細胞壁的組成成分和形成方式，可將植物細胞壁分為初生細胞壁和次生細胞壁[1]。初生細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠，通常在細胞板形成后開始沉積。木本植物木質部細胞在初生細胞壁形成后，進一步分化形成次生細胞壁。次生細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，構成了木材的主要成分[2]。纖維素是由D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的多聚物，其分子結構非常簡單，但合成機制卻極其復雜[3]。高等植物中纖維素的合成是在位于細胞膜上的纖維素合酶復合體(Cellulose Synthesis Complex，CSC)完成的，其中纖維素合酶(Cellulose Synthase/CESA)是CSC的主要組成成分，是參與纖維素合成的關鍵酶[3]。植物的CESA基因最早從棉花(Gossypiumhirsutum)纖維中被克隆得到[4]，隨后，其他植物中的CESA基因相繼被報道。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組包含10個CESA基因，水稻(Oryzasativa)中含有8個CESA基因[5-6]。CESA蛋白序列高度保守，含有8個跨膜結構域，2個在N端，6個在C端[3]。在第2和第3跨膜域之間存在一個胞質環區，該胞質區里含有一些與底物結合與催化相關的殘基，這些殘基構成了一個保守的D,D,D,Q/RXXRW(天冬氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺-X-X-精氨酸-色氨酸)結構[3]。

目前的研究結果認為，3種CESA蛋白形成一個有功能的CSC[7]。擬南芥中負責次生壁纖維素合成的CSC是由CESA4、CESA7和CESA8組成，負責初生壁纖維素合成的CSC由CESA1、CESA3和CESA6及其類似基因CESA2/CESA5/CESA9組成[5, 8-14]。雙分子熒光互補和酵母雙雜實驗證實，CESA4可與自身互作，且CESA4、CESA7和CESA8之間可以相互作用[15]，而免疫共沉淀、雙分子熒光互補和酵母雙雜實驗證明，初生壁CESA1、CESA3和CESA6自身以及相互之間可以相互作用[11, 16]。隨后，Pull-down實驗證實所有次生壁纖維素合成相關CESA基因之間存在互作關系[13, 17]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.2 生物信息學分析

從TAIR (http://www.arabidopsis.org/)和Phytozome (http://www.phytozome.net/poplar.php)網站獲取擬南芥和楊樹的CESA基因家族的序列信息。采用MEGA 5.0軟件中基于遺傳距離的鄰近結合法(Neighbor Joining，NJ)構建進化樹。根據擬南芥AtCESA鋅指結構和跨膜結構域信息(http://www.uniprot.org/)，手工繪制楊樹CESA鋅指結構和跨膜結構域位置圖。依據楊樹次生壁CESA基因的基因號(PtCESA4：Potri.002G257900；PtCESA7A：Potri.006G181900；PtCESA7B：Potri.018G103900；PtCESA8A：Potri.011G069600；PtCESA8B：Potri.004G059600)在已報道的楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq數據[23]與剝皮再生過程再生組織表達量的基因芯片數據[24]中進行檢索，獲得基因的表達數據。楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq實驗方法詳見Liu等的方法[23]，簡略而言，使用RNeasy Plant Mini 試劑盒和RNase-free DNase I試劑盒(Qiagen)提取楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的總RNA，交由公司完成測序。剝皮再生過程再生組織表達量的基因芯片數據的實驗方法詳見Tang等的方法[24]，簡略而言，取生長時間一致的毛白楊在同一時間進行莖干的環剝，剝皮后第0、7、10、12、16、18和21 d用無菌刀片刮取樹干表面再生組織，利用Affymetrix系統平臺進行基因芯片的雜交、洗染和掃描。

1.3 植株激素處理及qRT-PCR分析

分別用0.1 mol·L-1NAA，0.1 μmol·L-16-BA，10 μmol·L-1赤霉素(Gibberellin，GA3)，1 nmol·L-1油菜素內酯(epibrassinolide，BR)和1 μmol·L-1乙烯(ethylene)，對組培培養4 w的84K植株進行處理。處理方法為，選取生長狀態一致的84K組培苗，去除培養基，將根部置于上述濃度的激素溶液中，在處理0 h、3 h、6 h時取樣進行次生壁CESA的表達量分析。取樣部位為組培苗的莖。所有的試劑購于Sigma-Aldrich。在qRT-PCR實驗中，取激素處理后的84K莖段，使用RNeasy Plant Mini 試劑盒和RNase-free DNase I試劑盒(Qiagen)提取總RNA。每個樣品取2 μg RNA使用SuperScript III first-strand synthesis system(Invitrogen)合成cDNA第一鏈。定量PCR的引物使用Primer 3軟件設計，按照SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒(TaKaRa)使用說明書準備反應混合液，實時定量PCR反應在7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)或Roche 480實時熒光定量PCR儀(Roche)上進行。PtACTIN作為內參，一次qRT-PCR實驗包含四次技術重復。所有實時定量實驗至少重復三次。實驗所用qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 熒光素酶互補報告體系

熒光素酶互補報告體系所用載體由中科院遺傳所周奕華老師課題組惠贈。按照文獻中操作步驟進行熒光素酶互補報告實驗[25]，簡言之，將克隆得到的次生壁PtCESA蛋白CDS序列通過酶切連接的方法分別構建到包含熒光素酶蛋白N端序列的NLuc載體或C端序列的Cluc載體，構建好的載體通過農桿菌GV3101介導轉化本氏煙草葉片，培養3 d后，在葉片上涂布熒光素，利用IndiGO 軟件檢測熒光信號。

1.5 GUS染色分析

GUS的組織化學染色按照如下步驟進行[23]：培養4 w的轉基因組培苗，在預冷的90%丙酮中固定約2 h。固定結束后，在冰上將組織材料使用GUS染色緩沖液(50 mmol·L-1sodium phosphate (pH7.0)，2 mmol·L-1potassium ferrocyanide，2 mmol·L-1potassium ferricyanide，10 mmol·L-1EDTA，0.2% Triton X-100 (v/v))洗滌3次，再轉移至GUS染色液(染色緩沖液添加20% (v/v) methanol和1 mM X-Gluc)，于37℃溫浴12 h后，使用70%乙醇脫色。對CESA4、CESA7B、CESA8A與CESA8B基因啟動子驅動的GUS轉基因材料，每一個轉基因材料至少選擇5個株系進行GUS染色，每個轉基因材料的染色至少重復三次，以保證結果的可靠性。

2 結果與分析

2.1 楊樹次生壁CESA基因的進化關系和蛋白結構

楊樹5個次生壁CESA基因，包含1個CESA4基因，2個CESA7基因和2個CESA8基因，這些基因的序列與擬南芥次生壁CESA基因的序列相似性很高 (圖1A)。基因的蛋白結構分析是研究基因功能的基礎。有報道表明鋅指結構在CESA之間的互作中起重要的作用，跨膜結構域是CESA形成三維結構的基礎[3]。楊樹次生壁CESA的結構分析發現，楊樹和擬南芥次生壁CESA的鋅指結構和跨膜結構的位置高度保守 (圖1B)。楊樹5個次生壁CESA的N端均含有鋅指結構，楊樹CESA4、CESA7A、CESA8A和CESA8B也與擬南芥的CESA4、CESA7和CESA8一樣，均含有8個跨膜結構域，而楊樹CESA7B的C端則缺少6個跨膜結構域。

A 擬南芥和楊樹CESA基因的系統進化樹；B 擬南芥和楊樹CESA蛋白的結構圖。圖中標示了鋅指結構和跨膜結構域。A The phylogenetic tree of CesA genes from Arabidopsis and Populus; B Schematic representation of zinc finger and transmembrane domains AtCesAs and PtCesAs. Zinc finger domain and transmembrane domains was marked on the protein sequence.圖1 楊樹與擬南芥次生壁CESA基因的進化關系與蛋白結構分析Fig.1 The phylogenetic relationship and topology of CesA genes

2.2 楊樹次生壁CESA在不同組織及次生維管發育中的表達特征

基因表達分析研究有助于揭示基因的功能。為了獲得楊樹不同次生壁CESA基因的表達模式，檢測了它們在不同組織及次生維管再生過程中的基因表達情況。楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq數據分析表明，楊樹次生壁CESA基因在幼嫩葉、幼嫩莖、成熟莖以及根組織中均有可觀的表達，但在成熟莖中表達量最高(圖2A)。值得注意的是，CESA8A在各個組織中的表達量均較其他幾個CESA基因低(圖2A)。隨后，通過對次生維管再生實驗系統中不同時期再生組織基因表達的基因芯片數據分析表明，楊樹次生壁CESA基因在剝皮12 d后的再生組織(木質部分化階段)的表達量不斷提高，與它們參與木材形成過程中次生壁纖維素合成的功能相吻合(圖2B)。另外，在這一過程中，5個楊樹次生壁CESA基因的變化趨勢一致，變化幅度相差不大。相對而言，CESA8A在再生組織中的表達量較其他幾個CESA基因略低。

A 楊樹次生壁CESA基因在幼嫩葉(YL)、成熟葉(ML)、幼嫩莖(YS)、成熟莖(MS)和根(R)中的表達分析；B 楊樹次生壁CESA基因在剝皮后0(D00)、7(D07)、10(D10)、12(D12)、16(D16)、18(D18)和21(D21)d的再生組織中的表達分析。

A The expression of secondary wallPtCESAsin young leave (YL), mature leave (ML), young stem (YS), mature stem (MS) and root (R); B The expression of secondary wallPtCESAsin the regeneration tissue at 0 (D00), 7 (D07), 10 (D10), 12 (D12), 16 (D16), 18 (D18) and 21 days (D21) after debarking.

圖2 楊樹次生壁CESA基因在不同組織和次生維管再生過程中的表達模式

Fig.2 The expression of secondary wallPtCESAsin different tissues and in the regeneration of secondary vascular system

2.3 基于啟動子驅動GUS表達的轉基因楊樹中次生壁CESA的表達模式

為了檢測楊樹次生壁CESA基因的組織表達特異性，創制了次生壁CESA基因啟動子驅動GUS表達的轉基因植株。通過GUS染色分析發現，在PPtCESA4::GUS、PPtCESA7A::GUS、PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉基因植株的莖和葉中，均檢測到較強的GUS信號(圖3)。在莖段中，頂端節間的GUS信號明顯較基部節間的強。PPtCESA4::GUS、PPtCESA7A::GUS、PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉基因植株之間，在葉中的GUS信號存在一定的差異。PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉基因植株在整個葉片中均觀測到了GUS信號(圖3B和3C)，而PPtCESA4::GUS和PPtCESA7A::GUS轉基因植株在葉脈中則基本上未檢測到GUS信號(圖3A和3D)。

2.4 楊樹次生壁CESA對激素處理的響應

許多研究表明，激素可誘導CESA基因的表達[25-26]。利用赤霉素GA3、萘乙酸NAA、油菜素內酯BR、細胞分裂素6-BA和乙烯處理84K楊幼苗，檢測了莖中次生壁CESA對激素的響應模式。結果顯示，GA3和6-BA使楊樹次生壁CESA的表達量上調，其中GA3的作用更顯著(圖4A和4D)。NAA、BR和乙烯處理下，楊樹次生壁CESA的表達量下調，其中BR的作用相對顯著(圖4)。就5個楊樹次生壁CESA基因的表達量變化對激素的響應而言，PtCESA4的表達量變化最顯著，PtCESA7A較PtCESA7B的表達量變化顯著，PtCESA8B較PtCESA8A的表達量變化顯著。

2.5 楊樹次生壁CESA間的互作

遺傳學研究證實正常行使功能的CSC中含有3種CESA蛋白[27]。擬南芥中負責次生壁纖維素合成的CSC是由CESA4、CESA7和CESA8組成。在楊樹中有5個次生壁CESA，其中1個CESA4、2個CESA7和2個CESA8。為了確定楊樹中的2個CESA7和2個CESA8在與CESA4形成復合體的過程中究竟是幾率均等還是有所偏好，對它們之間的互作情況進行了檢測。如圖5所示，在熒光素酶互補報告體系中，相對于對照，PtCESA7B和PtCESA8B，PtCESA8A和PtCESA7B，PtCESA8B和PtCESA7A的組合表現出強的熒光信號，表明上述次生壁CESA可以互作形成二聚體，因此，PtCESA7A和PtCESA7B、PtCESA8A和PtCESA8B可能具有相同的能力形成有功能的CSC。

A PPtCESA4::GUS轉基因楊樹；B PPagCESA7B::GUS轉基因楊樹；C PPagCESA8A::GUS轉基因楊樹；D PPagCESA7A::GUS轉基因楊樹。標尺=1 cm。A PPagCESA4::GUS-expressing poplar plants; B PPagCESA7B::GUS-expressing poplar plants; C PPagCESA8A::GUS-expressing poplar plants; D PPagCESA7A::GUS-expressing poplar plants. Bar = 1 cm.圖3 楊樹次生壁CESA基因啟動子驅動GUS表達轉基因楊樹的GUS染色分析Fig.3 GUS staining assay of Populus secondary wall PtCESAgenepromoters

A 赤霉素GA3；B 生長素NAA；C 油菜素內酯BR；D 細胞分裂素6-BA；E 乙烯利。A The expression of PtCESA4, 8A and 8B under GA3 treatment; B The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under NAA treatment; C The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under BR treatment; D The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under 6BA treatment; E The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under ethylene treatment.圖4 不同激素處理3 h、6 h后楊樹次生壁CESA基因的表達變化Fig.4 The response of secondary wall CESA genes to 3 h and 6 h hormone treatment

A 本氏煙草葉表面農桿菌注射位置以及所轉化的組合示意圖。NLuc：熒光素酶N端，CLuc：熒光素酶C端；CESA X 與CESA Y 代表轉化組合中的兩個CESA; B CESA組合轉化后的熒光素酶熒光檢測。Luc：熒光素酶熒光信號；BF：明場；Merge：熒光信號與明場圖像的疊加。A. The general scheme showed the constructs and their infiltrated location used in the split-luciferase complementation assay. NLUC: the split N terminal of luciferase; CLUC: the split C terminal of luciferase; CESA X and CESA Y: two different secondary wall PtCESAs. B. The fluorescence signal detected after the transformation of different secondary wall PtCESA combination. Luc: the fluorescence signal; BF: bright field; Merge: the merged image of Luc and BF.圖5 熒光素酶互補試驗分析楊樹次生壁CESA成員間的互作Fig.5 The split-luciferase complementation assay showed the imteraction between secondary wall PtCESAs.

3 討論

纖維素合成需要纖維素合酶不同成員形成復合體，正常行使功能的CSC需要3種CESA蛋白[28]。本論文研究了楊樹中5個次生壁纖維素合成相關的CESA基因的表達模式與互作模式，為揭示木本植物木材形成過程中5個次生壁CESA的作用提供了線索。研究結果表明，楊樹5個次生壁CESA基因在楊樹成熟莖中高表達，尤其在次生維管組織發育的后期高表達；CESA4、CESA7B、CESA8A和CESA8B的GUS信號在楊樹莖和葉中較強，但這些次生壁CESA的表達模式存在一定的差異；楊樹次生壁CESA的表達量被赤霉素和細胞分裂素上調，被生長素、油菜素內酯和乙烯下調；楊樹次生壁CESA7B和CESA8B、CESA7B和CESA8A、CESA7A與CESA8B之間存在互作。這些數據提示楊樹5個次生壁CESA基因雖然都能夠參與形成CSC，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式。

參與次生壁纖維素合成的CSC需要由3種次生壁纖維素合成的CESA蛋白組成[15]。在擬南芥中，AtCESA4、AtCESA7與AtCESA8組成有功能的CSC，參與次生壁纖維素合成[13]。在水稻中，與AtCESA8、AtCESA4與AtCESA7同源的OsCESA4、OsCESA7與OsCESA9組成有功能的CSC，參與次生壁纖維素合成[29]。而在楊樹中，有5個參與次生壁纖維素合成的CESA，其中包括了1個CESA4、2個CESA7和2個CESA8，它們有多達4種組合方式形成CSC，以參與次生壁纖維素的合成。RAN-seq與基因芯片的分析表明，楊樹次生壁CESA基因在楊樹成熟莖以及次生維管發育的后期即木質部形成時期表達量較高，提示它們在木材形成過程發揮重要作用。在這5個基因中，PtCESA8A的表達量略低，推測它被招募進入木材形成過程的CSC的機會略低。揭示楊樹多個次生壁CESA以及多種次生壁纖維素合成CSC的存在，可為理解纖維素合成的質與量控制提供基礎，進而為木材材性的多樣性改良提供了潛在可能性。

基因結構分析發現，楊樹5個次生壁CESA基因N端都具有鋅指結構，為它們的互作提供了結構基礎[15]。隨后的熒光素酶互補實驗也證實了這一點。CESA通常含有8個跨膜結構域，2個位于N端，6個位于C端[3]。然而，PtCESA7B的C端缺少6個跨膜結構域，不同于其它CESA，這種特殊的結構會否影響纖維素的合成目前尚不清楚。

楊樹次生壁CESA啟動子驅動GUS轉基因楊樹的GUS染色分析表明，這些基因的組織表達模式存在一定的差異。例如，PtCESA8A和PtCESA7B轉基因株系整個葉片中均檢測到了GUS信號，而PtCESA4和PtCESA7A轉基因株系葉脈中則基本上未檢測到GUS信號，此結果與Naoki等的研究結果一致[21]。這種差異提示在葉脈的發育中包含PtCESA7A的CSC作用應該大于包含PtCESA7B的CSC。另外，Naoki等的研究結果顯示，PtCESA8B在木質部中高表達，而PtCESA8A則在根冠高表達；PtCESA7B在葉、葉柄、根冠和幼莖中表達量比PtCESA7A高，而PtCESA7A和PtCESA7B的表達量在成熟莖木質部中無明顯差異[21]。這種組織表達的差異暗示，可能由不同的CESA組合形成不同的CSC，以參與不同組織器官的發育。

楊樹次生壁CESA基因對不同激素處理的表達和響應存在較大差異。赤霉素GA3和細胞分裂素6-BA上調楊樹次生壁CESA的表達，而NAA，BR和乙烯下調楊樹次生壁CESA的表達。其中，PtCESA4基因的表達量變化最顯著，PtCESA7A較PtCESA7B基因的表達量變化顯著，PtCESA8B又較PtCESA8A基因的表達量變化顯著。這一結果提示，由PtCESA4、PtCESA7A和PtCESA8B組成的CSC，在激素處理的響應中可能貢獻更大。

熒光素酶互補實驗結果表明，PtCESA7A、PtCESA7B、PtCESA8A和PtCESA8B之間可以相互作用。擬南芥次生壁CESA成員之間可以兩兩互作，形成二聚體，這種互作是其形成CSC的基礎[15]。因此，PtCESA7A與PtCESA7B、PtCESA8A與PtCESA8B具有同等的幾率形成有功能的CSC。然而，PtCESA7A與PtCESA7B、PtCESA8A與PtCESA8B在組織表達、激素響應上存在一定的差異，這些差異可能使得在不同組織、不同激素作用下，次生壁CSC招募不同的CESA成員參與次生壁纖維素的合成。CSC的多樣性可以多方面影響細胞壁中的纖維素含量，從而導致木材材性差異。

4 結論

楊樹5種次生壁CESA基因具有同等的能力形成功能性的纖維素合酶復合體，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式。

[1] Keegstra K.Plant cell walls[J]. Plant physiology, 2010, 154(2):483-486.

[2] Mellerowicz E J, Sundberg B.Wood cell walls: biosynthesis, developmental dynamics and their implications for wood properties[J]. Current opinion in plant biology, 2008, 11(3):293-300.

[3] Somerville C.Cellulose synthesis in higher plants[J]. Annual review of cell and developmental biology, 2006, 22:53-78.

[4] Pear JR, Kawagoe Y, Schreckengost WE,etal. Higher plants contain homologs of the bacterial celA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(22):12637-12642.

[5] Arioli T, Peng L, Betzner AS,etal.Molecular analysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis[J]. Science, 1998, 279(5351):717-720.

[6] Wang L, Guo K, Li Y,etal. Expression profiling and integrative analysis of the CESA/CSL superfamily in rice[J]. BMC plant biology, 2010, 10:282.

[7] Doblin MS, Kurek I, Jacob-Wilk D,etal. Cellulose biosynthesis in plants: from genes to rosettes[J]. Plant & cell physiology, 2002, 43(12):1407-1420.

[8] Persson S, Paredez A, Carroll A,etal. Genetic evidence for three unique components in primary cell-wall cellulose synthase complexes in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(39):15566-15571.

[9] Cano-Delgado A, Penfield S, Smith C,etal. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant journal, 2003, 34(3):351-362.

[10] Scheible WR, Eshed R, Richmond T,etal. Modifications of cellulose synthase confer resistance to isoxaben and thiazolidinone herbicides in Arabidopsis Ixr1 mutants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(18):10079-10084.

[11] Desprez T, Juraniec M, Crowell EF,etal. Organization of cellulose synthase complexes involved in primary cell wall synthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(39):15572-15577.

[12] Bischoff V, Desprez T, Mouille G,etal. Phytochrome regulation of cellulose synthesis in Arabidopsis[J]. Current biology, 2011, 21(21):1822-1827.

[13] Taylor NG, Howells RM, Huttly AK,etal. Interactions among three distinct CesA proteins essential for cellulose synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(3):1450-1455.

[14] Turner SR, Somerville CR.Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall[J]. The Plant cell, 1997, 9(5):689-701.

[15] Timmers J, Vernhettes S, Desprez T,etal. Interactions between membrane-bound cellulose synthases involved in the synthesis of the secondary cell wall[J]. FEBS letters 2009, 583(6):978-982.

[16] Carroll A, Mansoori N, Li S,etal. Complexes with mixed primary and secondary cellulose synthases are functional in Arabidopsis plants[J]. Plant physiology, 2012, 160(2):726-737.

[17] Atanassov, II, Pittman JK, Turner SR.Elucidating the mechanisms of assembly and subunit interaction of the cellulose synthase complex of Arabidopsis secondary cell walls[J]. The Journal of biological chemistry, 2009, 284(6):3833-3841.

[18] Djerbi S, Lindskog M, Arvestad L,etal. The genome sequence of black cottonwood (Populustrichocarpa) reveals 18 conserved cellulose synthase (CesA) genes[J]. Planta, 2005, 221(5):739-746.

[19] Kumar M, Thammannagowda S, Bulone V,etal.An update on the nomenclature for the cellulose synthase genes in Populus[J]. Trends in plant science, 2009, 14(5):248-254.

[20] Suzuki S, Li L, Sun YH,etal.The cellulose synthase gene superfamily and biochemical functions of xylem-specific cellulose synthase-like genes in Populus trichocarpa[J]. Plant physiology, 2006, 142(3):1233-1245.

[21] Takata N, Taniguchi T.Expression divergence of cellulose synthase (CesA) genes after a recent whole genome duplication event in Populus[J]. Planta, 2015, 241(1):29-42.

[22] Song D, Shen J, Li L.Characterization of cellulose synthase complexes in Populus xylem differentiation[J]. The New phytologist, 2010, 187(3):777-790.

[23] Liu B, Zhang J, Wang L,etal. A survey of Populus PIN-FORMED family genes reveals their diversified expression patterns[J]. Journal of experimental botany, 2014, 65(9):2437-2448.

[24] Tang F, Wei H, Zhao S,etal. Identification of microRNAs Involved in Regeneration of the Secondary Vascular System in Populus tomentosa Carr[J]. Frontier in plant science, 2016, 7:724.

[25] Huang D, Wang S, Zhang B,etal.A Gibberellin-Mediated DELLA-NAC Signaling Cascade Regulates Cellulose Synthesis in Rice[J]. The Plant cell, 2015, 27(6):1681-1696.

[26] Xie L, Yang C, Wang X.Brassinosteroids can regulate cellulose biosynthesis by controlling the expression of CESA genes in Arabidopsis[J]. Journal of experimental botany, 2011, 62(13):4495-4506.

[27] Kumar M, Turner S.Plant cellulose synthesis: CESA proteins crossing kingdoms[J]. Phytochemistry, 2015, 112:91-99.

[28] McFarlane HE, Doring A, Persson S.The cell biology of cellulose synthesis[J]. Annual review of plant biology, 2014, 65:69-94.

[29] Tanaka K, Murata K, Yamazaki M,etal. Three distinct rice cellulose synthase catalytic subunit genes required for cellulose synthesis in the secondary wall[J]. Plant physiology, 2003, 133(1):73-83.

(責任編輯：張 研)

Interaction and Expression of Secondary WallCESAsinPopulus

WEIKai-li1,ZHOUHou-jun1,JIANGCheng1,ZHAOYan-qiu1,SONGXue-qin1,2,LUMeng-zhu1,2

(1.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2.Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

[Objective]Cellulose synthesis is important for the wood formation of woody plant.CESAsplay important roles in the cellulose synthesis.Since that three kind of CESAs constitute a functional cellulose synthesis complex and five secondary wall CESAs existed in the poplar genome, we examined the expression pattern and interaction of theseCESAsinPopulustoreveal the work model of them in secondary wall cellulose synthesis.[Method]RNA-seq and microarray data analysis were used to examine the expression profile of the five secondary wallCESAsin root, stem and leaf, and in the regeneration of secondary vascular bundle, respectively. Promotor driving GUS expression assay and qRT-PCR were carried out to reveal the tissue expression pattern and hormone response of the five secondary wallCESAs. Firefly luciferase complementation assay was used to check the interaction between CESA7A, CESA7B, CESA8A and CESA8B.[Result]Expression analysis showed that all the five secondary wallCESAsexhibited high expression in the mature stem and preferred to express in the later stage of stem development, suggesting that they involved in the secondary wall synthesis during wood formation. Promotor driving GUS expression assay ofCESA4,CESA7B,CESA8AandCESA8Bdemonstrated high expression of these secondary wallCESAsin stem and leaf, and some differences, however, were existed in the detail expression pattern, especially in leaf veins. In addition, the expression of secondary wallCESAswere upregulated during GA3and 6-BA treatment, while down-regulated during NAA, BR and ethylene treatment. The expression variation of theseCESAsin response to different hormones were different. Firefly luciferase complementation assayshowed that CESA7A and CESA7B could interact with CESA8A and CESA8B, indicating that they parallelly determine the final secondary wall cellulose synthesis complex.[Conclusion]The five secondary wallCESAsshowed different expression from one another in different tissue and under different hormone treatment. However, these CESAs could interact with each other.Thesedata suggest that poplar secondary wall CESAs could form the cellulose synthesis complex in equal possibility, but the complex might be varied in different tissues and in response to different hormones, which might have an effect on the wood chemical composition.

CESA; Secondary cell wall; Expression analysis; Interaction; Hormone;Populus

2016-04-28 基金項目： 國家重點基礎研究發展計劃(“973”計劃)形成層干細胞維持、分化以及次生木質部發育的調控機制(2012CB114503)。 作者簡介： 魏凱莉，碩士在讀。主要研究方向：林木遺傳育種。E-mail : wkl19911228@163.com * 通訊作者：宋學勤，博士。主要研究方向：林木遺傳育種。E-mail : xqsong@caf.ac.cn

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.009

S792.11

A

1001-1498(2017)02-0245-09