重金屬脅迫下白骨壤數字基因表達譜分析

袁長春，莫健新，袁柳嬌，余如鳳，劉 倩，鐘軍弟，劉鍇棟

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

重金屬脅迫下白骨壤數字基因表達譜分析

袁長春1*，莫健新1，袁柳嬌1，余如鳳1，劉 倩2，鐘軍弟1，劉鍇棟1*

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

[目的]從轉錄組水平研究重金屬污水脅迫處理下白骨壤的基因表達變化，以揭示白骨壤響應重金屬污染脅迫的機制。[方法]采用基于高通量測序的數字基因表達譜(DGE)技術對重金屬污水脅迫處理組和對照組白骨壤材料進行轉錄組測序分析。[結果]與對照組相比，重金屬處理下白骨壤共有10 459個差異表達基因，其中，8 685個表達量上升，1 774個表達量下降。MeV聚類表明：大部分基因在重金屬處理樣本中的表達量受到極大的誘導。GO功能注釋發現，差異表達基因主要定位于葉綠體以及細胞內各種膜結構，參與“細胞代謝”、“細胞組分的組合和生物合成”、“對刺激的響應”等過程。KEGG 代謝通路分析顯示，差異表達基因分布于126條Pathways，涉及“核糖體”、“光合作用”、“乙醛酸鹽代謝”、“丙酮酸代謝”等途徑。重金屬脅迫還促進萜類、黃酮類化合物生物合成的關鍵酶基因(牻牛兒基焦磷酸合酶(0009238)、黃酮醇合成酶(0001833))的表達，進而促進白骨壤有效成分的積累；顯著誘導細胞分裂素水解酶編碼基因CKX7(0057124)、油菜素內脂信號轉導組分基因BSK(0043741)等的表達，進而提高白骨壤對重金屬脅迫的適應能力。此外，轉錄因子分析發現，bHLH、NAC、MYB-related和WRKY在重金屬脅迫中發揮重要作用。實驗選取8個與環境刺激響應密切相關的基因，通過qRT-PCR驗證了它們在重金屬污水脅迫處理下的表達差異，結果與數字基因表達譜分析的結果較一致，證實了差異表達基因數據的有效性。[結論]重金屬處理影響了白骨壤大量的新陳代謝、光合作用、小分子酸合成、激素合成與信號轉導及次生代謝產物合成相關基因的表達。

白骨壤；重金屬脅迫；數字基因表達譜(DEG)；差異表達基因；機制

隨著我國沿海地區工農業的快速發展以及城市化區域的不斷擴大，工農廢水和生活污水的排放量越來越大。大量污水涌入江河海灣造成了很大的環境壓力[1]。紅樹濕地系統處在陸地向海洋的過度帶，對各種污染物有很強的吸附能力，具有凈化污水、沉積污染物的能力[2-4];然而，污水排放對紅樹植物的正反影響效應存在較大的爭議。一方面，污水排放能為紅樹植物帶來豐富的營養物質，促進紅樹的生長；另一方面，污水中重金屬污染物的脅迫作用對紅樹植物存在一定的不利影響，減緩紅樹植物的生長發育。因此，探究紅樹植物響應污染脅迫的機制是當前研究的熱點[5]。有研究表明，紅樹植物能夠通過多種途徑應對重金屬脅迫,如：根部發達的凱氏帶可以防止重金屬離子向地上部分轉運；植物體內的小分子有機酸等物質可以將重金屬沉淀于細胞壁或局限于液泡等細胞器；通過增強植物體自身抗氧化系統活性或促進各種抗氧化物質合成來清除重金屬脅迫下產生的大量活性氧自由基[6-8];然而，這些研究大多停留在生理層面，從分子層面分析重金屬脅迫處理對紅樹植物生長影響的研究鮮有報道[9-10]。

數字基因表達譜(DGE)是一種高效的高通量測序技術，DEG能用于分析某一物種特定組織在特定條件下基因的表達情況。通過對差異基因涉及到的生物學過程進行搜索、比較和分析，可預測基因的表達模式和蛋白質的功能等信息。目前，已有學者利用該技術在轉錄水平分析了美洲黑楊(PopulusdeltoidesMarsh)、泡泡刺(NitrariasphaerocarpaMaxim.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)等植物基因表達譜[11-13]。如，賴曉娟等[14]通過分析壇紫菜(PyropiahaitanensisRhodophyta)的數字基因表達譜，篩選出了256個上調表達基因和3 820個下調表達基因，證明了高溫脅迫對壇紫菜的生長發育有一定的抑制作用，但同時也誘導了補救途徑。

作為常見的紅樹林優勢樹種白骨壤(Avicenniamarina(Forssk?l) Vierhapper)廣泛分布于陸地向海洋過渡的潮間帶，在我國分布于海南、廣東、廣西等省的濱海地區。白骨壤能耐受一定濃度的污染脅迫，可在污水污染的潮間帶生長[15]。有研究表明，白骨壤模擬濕地系統可對污水起到很好的凈化效應，在栽種白骨壤植物的土壤子系統中，重金屬積累含量顯著降低[16]。進一步研究表明，白骨壤正是通過調控濕地系統中氮、磷的分配、循環達到凈化作用[17-18]。周涵韜等[19]通過mRNA差異顯示技術，分離得到了白骨壤耐鹽相關cDNA，為揭示白骨壤鹽脅迫響應機制打下了基礎。本文采用基于高通量測序的數字基因表達譜技術研究污水脅迫處理下白骨壤的基因表達變化，從分子層面分析白骨壤對重金屬污染脅迫的耐受機制，為深入研究重金屬污水脅迫對紅樹植物生長的影響機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

Hoagland營養液；人工污水；Trizol試劑盒(TaKaRa, 大連，中國)；瓊脂糖；寡聚(dT)-纖維素；片段化緩沖液(fragmentation buffer)；dNTPs；六堿基隨機引物；RNase H；DNA polymerase I；QiaQuick PCR試劑盒；EB緩沖液；PrimeScriptTMRT Master Mix (TaKaRa，大連，中國)；SYBR Green supermix；PCR儀型：Bio-Rad CFX96 touchTM。

1.2 白骨壤材料處理和收集

1.3 總RNA提取和基因表達譜測序

采用Trizol法提取污水脅迫處理組和對照組白骨壤葉片樣品的總RNA，對照和處理各3份生物學重復；然后，將對照和處理的各自3份RNA樣品等量混合，由廣州基迪奧公司構建測序文庫，采用Illumina HiSeqTM 2000平臺進行轉錄組測序。

1.4 差異表達基因的篩選

基因的表達量由比對到基因表達區域序列的readcount頻率來估算，通過edgeR軟件對得到的readcount數據進行差異分析，以篩選差異表達基因。本實驗差異基因篩選標準為P-value<0.05，|log2Fold Change|>1，其中，Fold Change 為污水脅迫處理樣本與對照樣本中各基因表達量的比值。對于差異表達基因，其log2Fold Change>0時，認為該差異表達基因是上調的；反之，若log2Fold Change <0，則認為該差異表達基因是下調的。

1.5 Gene Ontology (GO) 基因功能注釋和KEGG代謝通路分析

采用GO數據庫(http：//www.geneontology.org/)對污水脅迫處理下白骨壤的差異表達基因進行GO功能富集顯著性分析。采用GOseq方法計算得到一個特定的P-value。一般校正后的P-value≤0.05，表示差異表達基因在該GO中出現了富集。同時，使用KOBAS(2.0)軟件對差異基因進行KEGG 代謝通路富集性分析，當FDR(錯誤發現率)≤0.05時，表示該通路中差異表達基因富集顯著。

1.6 qRT-PCR驗證

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

分析白骨壤數字基因表達譜測序數據發現，重金屬污水脅迫處理樣品和對照樣品測序所得數據，經過濾篩除含有接頭和低質量部分后，得到高質量Clean reads的比例分別為98.26%、98.23%，證明測序質量較高。將得到的Clean reads與參考基因比對，對照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本分別有89.20%和87.45%的Clean reads可比對上參考基因，這為白骨壤轉錄組序列的注釋打下了結實的基礎。測序結果提交到Genebank，登錄號為SRA487295。

飽和度是用來衡量單一樣本測序得到的基因數量是否覆蓋全基因組的標準，檢測所得的基因數量隨測序量的增加而增加，當測序量接近基因組的大小時，其檢測到的基因總數達到峰值，表明檢測到的基因數已基本覆蓋全基因組。本研究中，對照樣本和污水脅迫處理樣本的Reads數量超過10 M時，檢測到的基因數量趨于飽和，而實驗中2個樣品的測序量分別為25.26、25.64 M，證明絕大部分基因已被檢測到。隨機性分析表明：各樣本的Reads呈正態分布，具有很高的隨機性。上述結果表明：本次測序結果能夠較好地反映各樣本中基因表達的真實情況，可用于分析重金屬污水脅迫處理下白骨壤基因的表達變化。

2.2 差異表達基因篩選

MeV聚類分析顯示：聚在同一類的基因表達量在對照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本間差異極大，大部分基因表現為在污水脅迫處理樣本中的表達量比對照樣本中的高。

通過比較對照樣品與重金屬污水脅迫處理樣品基因表達譜，共篩選出10 459個差異表達基因，其中，有8 685個基因表達量增加，1 774個基因表達量減少，表明重金屬污水脅迫處理極大的誘導了白骨壤基因的表達。

2.3 差異表達基因GO功能顯著性富集分析

將白骨壤差異表達基因比對到GO數據庫，共得到2 041條terms，其中，“分子功能”514條，占25.18%；“細胞組分”202條，占9.90%；“生物學過程” 1 325條，占64.92%。以P-value≤0.01為標準篩選極顯著富集條目，共得到230條，其中，“分子功能”39條，“細胞組分”46條，“生物學過程”145條。對差異表達基因GO功能分類發現，大部分類別中，表達量上調的基因數比表達量下調的基因數多，其中，與“生物學過程”相關的差異表達基因主要涉及“代謝過程”、“對刺激因素的響應”、“區域化”、“生物調節”等過程，與“分子功能”相關的差異表達基因主要與“結構分子活性”、“轉運體活性”、“催化活性”、“結合活性”等分子活性相關，與“細胞組分”相關的差異表達基因主要與“細胞器組分”、“細胞組分”、“大分子復合物”、“膜組分”等結構相關。此外，重金屬污水脅迫處理還提高了白骨壤的“抗氧化因子”、“蛋白質結合轉錄因子”、“核酸結合轉錄因子”、“電子載體”、“鳥嘌呤核苷酸交換因子”等關鍵因子的活性，進而影響“生物粘附”、“ 信號傳導”、“ 多細胞調節”等過程。

2.4 KEGG 代謝通路顯著性富集分析

通過KEGG 代謝通路富集分析，可以揭示差異表達基因參與的主要生理活動途徑。結果表明：重金屬污水脅迫處理下，白骨壤差異表達基因輻射到126條Pathway中。從表2可以看出：在P≤0.05顯著性富集的20條Pathway中，富集在“核糖體途徑”的基因數量最多，共有409個差異表達基因；其次是“碳代謝途徑”，富集了303個差異表達基因。“乙醛酸鹽代謝”途徑、“光合生物固碳途徑”和“丙酮酸代謝途徑”也是3個顯著性富集的代謝途徑，分別富集了107、103、113個差異表達基因，占差異表達基因總數的6.32%、6.08%、6.67%。此外，在“苯丙環素的生物合成”、“氮素代謝”、“光合作用”、“脂肪酸代謝”、“氨基酰-tRNA的生物合成”、“半乳糖代謝”等途徑也富集了一定數量的差異表達基因。

表2 KEGG代謝通路富集分析

2.5 污水脅迫處理對白骨壤激素合成、運輸和信號途徑基因的表達調控

植物激素是一類參與植物生長發育、代謝和環境響應的重要化學物質[20]。通過對白骨壤DEG分析，得到了生長素、乙烯、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內脂等一系列激素相關基因的表達差異情況，并分析了污水脅迫對上述基因的影響。結果(表3)表明：在污水脅迫處理下，一個生長素上調小RNA基因SAUR(0052024)顯著上調。多個乙烯信號途徑基因也得到了分析，其中，乙烯不敏感3基因EIN3(0016997)的表達保持穩定，而乙烯響應轉錄因子1基因ERF1(0013995)的表達受到污水脅迫的明顯誘導。眾多細胞分裂素基因的表達受到污水脅迫的顯著影響，如細胞分裂素脫氫酶7基因CKX7(0057124)的表達顯著上調，而一個富含組氨酸的磷酸轉移蛋白1基因AHP1(0029198)的表達受到極大的抑制。另一個內源細胞分裂素相關基因玉米黃質環氧化酶基因ZEP(0021189)在污水脅迫處理下表達水平也顯著上調。在脫落酸途徑中，一個脫落酸不敏感5基因ABI5(0061511)的表達顯著上調。最后筆者發現，油菜素內脂的一個信號轉導組分基因——油菜素內酯信號激酶基因BSK(0043741)的表達受到極大的誘導。

表3 激素相關基因在污水脅迫下的表達變化

2.6 污水脅迫處理影響白骨壤刺激代謝關鍵酶編碼基因的表達

通過KEGG分析發現：污水處理可顯著影響白骨壤中萜類和黃酮類次生代謝相關基因的表達(表4)，其中，萜類物質生物合成的限速酶牻牛兒基焦磷酸合酶(0009238)、甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰轉移酶(0057458)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(0025369)的表達都受到污水脅迫的顯著誘導。另外，黃酮類生物合成的幾個關鍵酶，如：黃酮醇合成酶(0001833)和查爾酮合成酶(0000917)的編碼基因表達水平也受到明顯的誘導。大量次生代謝相關基因的上調表達，暗示污水脅迫可能加速白骨壤內次生代謝產物的積累。

表4 次生代謝相關基因在污水脅迫下的表達變化

2.7 重金屬污水脅迫下的轉錄因子分析

一系列轉錄因子家族成員在植物環境脅迫響應中起到了重要的作用[21]。基于模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)轉錄因子數據庫，筆者對白骨壤轉錄組進行比對和注釋，一共鑒定到了分屬于56個常見家族的6 662個轉錄因子，轉錄因子家族及其包含的家族成員數據見表5。研究發現：bHLH、NAC、MYB_related、WRKY等家族在白骨壤中擁有大量的成員。此外，一批與激素相關的轉錄因子家族也得到了鑒定，如ARF、ERF、ARR-B等；一些與植物環境脅迫密切相關的轉錄因子家族也得到了不同程度的分析，如bZIP、GATA家族。鑒定轉錄因子家族，有利于形成一個完整的調控網絡，揭示白骨壤污水脅迫響應的分子機制。

表5 轉錄因子分析

2.8 差異表達基因qRT-PCR驗證

為了驗證測序數據的可靠性，筆者選擇顯著富集的GO分類條目“GO:0016491”、“GO:0005198”、“GO:0016866”和“GO:0003723”中的8個差異表達基因進行qRT-PCR分析，這8個基因分別是：0003922、0048831、0026527、0053069、0020253、0055711、0016422和0049777，它們都是白骨壤中參與基礎代謝的關鍵基因。實驗結果表明：這8個基因的qRT-PCR結果與數字基因表達譜中檢測到的表達趨勢有較高的一致性。

3 討論

重金屬污染是影響植物生長發育較為嚴重的逆境。植物在長期進化過程中，響應重金屬脅迫而形成了特定的生長習性和形態、生理特征。作為一種有代表性的紅樹植物，白骨壤對污染脅迫表現出極強的耐受性[9]，展開對白骨壤的轉錄組分析，有利于從基因層面揭示紅樹植物耐受污染脅迫的機制。在本研究中，污水脅迫處理下，白骨壤的差異表達基因大部分上調表達，說明白骨壤可能通過提高自身轉錄水平應對污染脅迫，并增強適應能力。GO顯著性分析發現，“代謝過程”共富集了1 792個上調表達基因，178個下調表達基因；KEGG代謝通路顯著性分析表明，“核糖體”、“氮素代謝”、“碳代謝”、“丙酮酸代謝”、“脂肪酸代謝”等途徑中富集了大量的差異表達基因(大部分為上調基因)，說明白骨壤可能通過上調表達與基本代謝相關的基因來加快有害物質的新陳代謝，從而增強自身對污染脅迫的耐受能力。

光合作用的強弱能反映植物體對外界環境變化的適應情況。微量的重金屬能刺激紅樹植物葉綠素的合成，使光合作用增強，以提供更多的能量促進植物體的生長[22]；然而，紅樹植物對污染脅迫也有一定的耐受范圍，當脅迫濃度超過其耐受的上限時，會抑制葉片的光合作用。用大于30 mg·kg-1的Cd處理桐花樹(Aegicerascorniculatum(Linn.) Blanco)發現，葉片細胞內膜結構被破壞，葉綠素含量降低[22]；另有報道，在高濃度Hg2+(50 mg·L-1)處理下，白骨壤幼苗葉片凈光合作用的速率降低[23]。此外，黃國勇等[24]報道，增加復合重金屬的脅迫濃度，秋茄(Kandeliacandel(L.) Druce)葉片葉綠素的合成量下降加劇。原因可能是重金屬離子與葉綠素合成酶的功能結構域結合，阻礙它們發揮作用。另外，重金屬離子也能加快葉綠素的分解速率。在本研究中，KEGG 代謝通路分析發現，“光合作用途徑”中富集了83個差異表達基因，說明在污染脅迫下白骨壤可能通過調節與光合作用相關基因的表達，以維持葉綠素的正常合成和葉綠體的結構完整性，從而使光合作用得以正常進行。

大量研究表明，激素作為植物體內一類重要的化學成分參與植物的抗逆反應[25]。在白骨壤的DEGs(差異表達基因)中，鑒定得到一批與激素相關的基因，它們的表達水平受到污水脅迫處理的調控。在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)和甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)中，鎘、銅或者汞脅迫顯著誘導了ERF家族基因的表達[26-27]。本研究中，一個乙烯響應轉錄因子ERF1(0013995)受到誘導，這與模式植物的表達情況一致。脫落酸是已知的逆境激素，張春榮等[27]發現，干旱脅迫顯著誘導ABA生物合成關鍵酶ZEP基因和信號轉導組分ABI5基因的表達。在本研究中，細胞分裂素相關基因玉米黃質環氧化酶ZEP(0021189)和脫落酸不敏感基因ABI5(0061511)都受到重金屬污水脅迫的顯著誘導。重金屬脅迫顯著促進了白骨壤乙烯、細胞分裂素的生物合成和信號轉導，這有可能進而促進根的發生和細胞增殖，從而提高脅迫下的植株適應能力。

環境脅迫往往會導致一些次生代謝產物的積累，研究白骨壤次生代謝相關基因的表達，有助于揭示次生代謝途徑參與白骨壤環境脅迫的分子機制[28]。在眾多的次生代謝成分中，黃酮類和萜類物質與環境脅迫的聯系最緊密。有報道稱，多種環境脅迫可以誘導黃酮類植物在植物體內的積累[29]。通過對差異表達基因的分析，筆者發現，與黃酮和萜類化合物次生代謝相關的關鍵基因的表達都受到污水脅迫處理的一致上調，其中，黃酮合成的2個上游酶編碼基因：黃酮醇合成酶(0001833)和查爾酮合成酶(0000917)都受到明顯的誘導。這進一步說明，積累的次生代謝產物有助于白骨壤污水脅迫耐受性的形成。

前期的研究表明，一系列轉錄因子參與了植物對環境脅迫的響應。作為植物中最大的家族之一， MYB類轉錄因子廣泛參與植物次生代謝調控、細胞形態發生、脅迫應答、分生組織形成及細胞周期控制等[30]。在白骨壤中，筆者一共鑒定得到219個MYB轉錄因子和431個MYB-related轉錄因子。NAC家族轉錄因子也被認為是一類重要的脅迫調控因子。OsMAC5和OsNAC6都是水稻(OryzasativaL.)響應生物及非生物脅迫的關鍵因子，它們與植物的脅迫耐受性密切相關[31-32]。在白骨壤中，可能的NAC轉錄因子一共有487個。以上結果為進一步分析轉錄因子家族在白骨壤污水脅迫中的響應機制奠定基礎。

4 結論

本實驗以重金屬處理下的白骨壤差異基因表達譜為基礎，得到了大量重金屬響應基因，并預測了這些基因可能的生物學功能。筆者分析表明，重金屬處理影響了白骨壤大量的新陳代謝、光合作用、小分子酸合成、激素合成與信號轉導及次生代謝產物合成相關基因的表達。白骨壤對重金屬脅迫響應機制具有極高的復雜性，深入研究一些關鍵基因將有助于全面了解其分子機制。

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(責任編輯：徐玉秀)

Digital Gene Expression Profiling Analysis ofAvicenniamarinaunder Heavy Metal Stress Treatment

YUANChang-chun1,MOJian-xin1,YUANGLiu-jiao1,YURu-feng1,LIUQian2,ZHONGJun-di1,LIUKai-dong1

(1.Life Science and Technology School, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong, China; 2.Guangzhou Gene Denovo Company, Guangzhou 510006, Guangdong, China)

[Objective]Transcriptome sequencing was perform to study the molecular mechanism in response to heavy metal stress inAvicenniamarina.[Method]Digital Gene Expression Profiling (DGE) technique was used to analyze the differences in gene expressions ofA.marinaunder artificial heavy metal stress.[Result]Compared to the controls, 10459 differentially expressed genes (DEGs) were detected, including 8685 up-regulated genes and 1774 down-regulated genes. MeV cluster analysis indicated that the expression level of most genes was largely induced in artificial heavy metal treatment sample than that in control sample. Gene Ontology analysis showed that most DEGs locate in “organelle envelope”, “plastid envelope” and “chloroplast part”, and were enriched in the biological process of “response to stimulus”, and “localization”, etc. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis revealed that these genes are distributed in 126 pathways involved in “ribosome”, “photosynthesis”, and various metabolism pathways, such as pyruvate and glyoxylate. Several terpenoid and flavonoid biosynthesis-related enzymes, such as geranylgeranyl pyrophosphate synthase (Unigene0009238) and flavonol synthase (Unigene0001833), were up-regulated by heavy metal stress, which might be the reason for the enhancement for the active ingredients accumulation inA.marina. Furthermore, heavy metal stress significantly induced the cytokinin dehydrogenase 7(CKX7) (Unigene0057124) and serine/threonine-protein kinase (BSK) (Unigene0043741). Besides, the transcription factor analysis demonstrated that bHLH, NAC, MYB-related and WRKY play vital roles in response to heavy metal stress．Furthermore, eight randomly selected genes were used to confirm the accuracy of DGE by qRT-PCR method.[Conclusion]Heavy metal stresses have effects on the expression of related genes involved in the metabolism, photosynthesis, small molecule acid synthesis, hormone synthesis and signal transduction, and secondary metabolites synthesis ofA.marina

Avicenniamarina; heavy metal stress; digital gene expression profiling (DGE); differentially expressed genes (DEGs); mechanism

2016-06-12 基金項目： 廣東省林業科技創新項目(2013KJCX011-03; 2015KJCX025)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510579277)；湛江市熱帶特色資源植物技術開發重點實驗室項目(2014A06008)；嶺南師范學院自然科學研究項目(LZL1507) 作者簡介： 袁長春，博士，教授. 主要研究方向：植物分子生物學. E-mail:yuanchangchun@163.com * 通訊作者：劉鍇棟，碩士，副研究員. 研究方向：植物分子生物學. E-mail: liukaidong2001@126.com

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.004

S718.46

A

1001-1498(2017)02-0206-08