制漿中段廢水處理優(yōu)勢(shì)菌的鑒定及其對(duì)COD去除效果的研究

黨亞攀 蘭善紅

(1.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510006；2. 東莞理工學(xué)院生態(tài)環(huán)境與建筑工程學(xué)院，廣東東莞，523808)

·廢水處理優(yōu)勢(shì)菌·

制漿中段廢水處理優(yōu)勢(shì)菌的鑒定及其對(duì)COD去除效果的研究

黨亞攀1蘭善紅2,*

(1.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510006；2. 東莞理工學(xué)院生態(tài)環(huán)境與建筑工程學(xué)院，廣東東莞，523808)

本實(shí)驗(yàn)從制漿中段廢水的活性污泥中分離純化得到1株優(yōu)勢(shì)菌，采用MIDI Sherlock?全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為缺陷短波單胞菌。研究pH值和溫度對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)和對(duì)制漿中段廢水的處理效果發(fā)現(xiàn)，該缺陷型短波單胞菌在pH值5、30℃時(shí)的生長(zhǎng)狀況最好，CODCr的去除率最高達(dá)38.5%，在pH值為6～8范圍內(nèi)對(duì)CODCr也有較好的去除效果，去除率可達(dá)30%以上。將該優(yōu)勢(shì)菌投加到好氧活性污泥系統(tǒng)中，制漿中段廢水的CODCr去除率可提高15%以上。

優(yōu)勢(shì)菌；制漿中段廢水；鑒定；生長(zhǎng)

制漿中段廢水中由于毒性物質(zhì)較多，降解優(yōu)勢(shì)菌在污泥中難富集，導(dǎo)致微生物對(duì)廢水的處理效果差。目前對(duì)生化處理廢水的強(qiáng)化技術(shù)在不斷地研究中，如在好氧活性污泥系統(tǒng)中添加增強(qiáng)微生物生長(zhǎng)代謝的物質(zhì)[1]，或直接在污泥系統(tǒng)中投加針對(duì)某類(lèi)污染物降解的優(yōu)勢(shì)菌[2]。

目前對(duì)優(yōu)勢(shì)菌增強(qiáng)廢水處理的研究已取得較好的成果。Sun等人[3]將所篩選出的優(yōu)勢(shì)菌應(yīng)用于上流式厭氧污泥床與序批式污泥反應(yīng)器相結(jié)合的系統(tǒng)中，使污水的COD、總氮、氨氮等的去除率均達(dá)到95%以上。Yang等人[4]從礦山排水中進(jìn)行菌種的分離鑒定，以豐富對(duì)微生物群落的認(rèn)識(shí)，同時(shí)分析其中的優(yōu)勢(shì)菌，考察優(yōu)勢(shì)菌能否在現(xiàn)有成效的基礎(chǔ)上提高礦廠(chǎng)廢水的處理效果。Li等人[5]以合成PTA(對(duì)苯二甲酸)廢水為對(duì)象，在不同溫度下微生物對(duì)該廢水的處理效果進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D-變形菌在所研究細(xì)菌群中，高溫時(shí)是厭氧處理的主力軍，其他溫度等條件下優(yōu)勢(shì)菌各不相同，優(yōu)勢(shì)菌的存在使特定污染物的去除量更高。孫友友等人[6]將所篩選出的多個(gè)純種菌株進(jìn)行混合，來(lái)組成復(fù)合菌群，發(fā)現(xiàn)由于優(yōu)勢(shì)菌的引入，尤其是它們?cè)诠餐饔脮r(shí)，可以使造紙廢水的處理效果有很大提高。同樣有研究證明，與普通活性污泥工藝相比較，好氧活性污泥通過(guò)經(jīng)篩選分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌強(qiáng)化后，對(duì)制漿中段廢水的處理效果明顯增強(qiáng)，廢水的色度以及CODCr都有明顯降低[7- 8]。

本課題組在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)馴化獲得一株能夠降解制漿中段廢水的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)代謝進(jìn)行研究，以期為制漿中段廢水的強(qiáng)化生化處理提供良好的優(yōu)勢(shì)菌種。

1 材料與方法

1.1 廢水來(lái)源及水質(zhì)

山東某造紙廠(chǎng)制漿中段廢水，采用硫酸鹽法制漿；廢水絮凝后CODCr濃度為600 mg/L左右，pH值為7.0左右。以絮凝后的制漿中段廢水作為實(shí)驗(yàn)廢水。

1.2 分析方法

采用精密型pH試紙對(duì)溶液pH值進(jìn)行測(cè)定；CODCr濃度采用便攜式水質(zhì)分析儀測(cè)定(DR2700，HACH，美國(guó))；采用MIDI Sherlock?全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離純化的純菌落進(jìn)行鑒定，該儀器由美國(guó)MIDI公司生產(chǎn)，配套設(shè)備為安捷倫氣相色譜GC6850，該系統(tǒng)的菌庫(kù)包括TSBA6、CLIN6、BHIBLA3、ACTIN1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)優(yōu)勢(shì)菌種的篩選及純化：將經(jīng)制漿中段廢水馴化后污泥上清液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基采用四區(qū)劃線(xiàn)法進(jìn)行菌種分離，在生化培養(yǎng)箱中于30℃培養(yǎng)24 h，選取其中的幾個(gè)不同的典型菌落進(jìn)一步在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，直至菌落為單一菌種繁殖而成為止。

(2)pH值對(duì)優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)：將滅菌的制漿中段廢水按m(COD)∶m(N)∶m(P)=100∶5∶1加入N、P營(yíng)養(yǎng)元素，分別加入5個(gè)已經(jīng)滅菌的錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中加200 mL廢水，用精密pH試紙分別調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9；挑取斜面培養(yǎng)基菌落2～3環(huán)，配制為50 mL的均勻菌液，每個(gè)錐形瓶中各自加入2 mL菌液，用滅菌棉花塞住錐形瓶，在30℃環(huán)境中震蕩，測(cè)定不同時(shí)間的OD600，得出優(yōu)勢(shì)菌在不同pH值下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

(3)pH值對(duì)優(yōu)勢(shì)菌處理制漿中段廢水的影響：將滅菌的制漿中段廢水(m(COD)∶m(N)∶m(P)=200∶5∶1)分別加入至5個(gè)錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶廢水加入量為200 mL，并加入0.01 g優(yōu)勢(shì)菌種(濕)，pH值分別調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9。在30℃下進(jìn)行曝氣，以24 h為一個(gè)周期，運(yùn)行10個(gè)周期后，監(jiān)測(cè)進(jìn)出水CODCr濃度，計(jì)算CODCr去除率。

(4)溫度對(duì)優(yōu)勢(shì)菌處理制漿中段廢水影響：pH值影響實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的合適pH值條件下，選取10℃(代表低溫)、30℃(代表中溫)和45℃(高溫微生物生長(zhǎng)的下限)3個(gè)溫度，實(shí)驗(yàn)方法同1.3(3)，計(jì)算不同溫度下的CODCr去除率。

2 結(jié)果及討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的篩選與鑒定

經(jīng)分離純化獲得一株優(yōu)勢(shì)菌，其菌落如圖1所示。該菌落為米白色，呈草帽狀，濕潤(rùn)透明，呈隆起狀態(tài)，邊緣粗糙且不整齊。

圖1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落

從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上挑取菌落，經(jīng)過(guò)涂片固定、初染、媒染、脫色及復(fù)染等染色程序，觀(guān)察其革蘭氏染色反應(yīng)，染色結(jié)果為菌體呈現(xiàn)紅色，判定為革蘭氏陰性菌。提取微生物脂肪酸，進(jìn)行鑒定[9]。鑒定結(jié)果如圖2和表1所示。

菌落中所提取的脂肪酸在系統(tǒng)的TSBA6中比對(duì)上3種菌，相似度最高的為Brevundimonas-diminuta，

圖2 脂肪酸匹配圖

菌庫(kù)(Library)相似指數(shù)(SimIndex)菌名(EntryName)TSBA66.200.683Brevundimonas-diminuta(Pseudomonasdiminuta)0.458Enterococcus-casseliflavus/gallinarum(Streptococcus)0.421Pediococcus-pentosaceus.(TSBA)

相似指數(shù)為0.683，大于0.5，鑒定結(jié)果可用。結(jié)合革蘭氏染色反應(yīng)，優(yōu)勢(shì)菌的鑒定結(jié)果為缺陷短波單胞菌。

根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[10]，缺陷短波單胞菌Brevundimonas-diminuta(Pseudomonasdiminuta)(BD)革蘭氏陰性菌，染色反應(yīng)為紅色，這與以上革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，細(xì)菌個(gè)體短小，從形狀來(lái)看屬于桿菌類(lèi)。從外觀(guān)來(lái)看，整個(gè)菌落像是一個(gè)草帽，但菌落的邊緣并不平整，菌落的中間會(huì)有一個(gè)向上凸起的弧度，菌落呈現(xiàn)出淡淡的灰白色。這與實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的菌落的觀(guān)察一致。這種細(xì)菌是一種較為嚴(yán)格的好氧菌，它在30℃時(shí)的生長(zhǎng)代謝速度最快，在37℃的環(huán)境中也能生長(zhǎng)，有些菌株甚至可以在41℃條件下生長(zhǎng)，但是在4℃時(shí)則不會(huì)生長(zhǎng)。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)及其對(duì)廢水處理的研究

2.2.1 pH值對(duì)缺陷短波單胞菌生長(zhǎng)的影響

除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物的生命活動(dòng)及生長(zhǎng)與pH值也存在著極大的關(guān)系，不同的微生物生長(zhǎng)所要求的pH值不同。30℃時(shí)缺陷短波單胞菌在不同pH值下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖3(a)所示。

圖3 不同pH值下缺陷短波單胞菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

通過(guò)圖3(a)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以看出，對(duì)于缺陷短波單胞菌來(lái)說(shuō)，30℃條件下，略微偏酸性的環(huán)境更加適合其生長(zhǎng)。在pH值5的條件下，缺陷短波單胞菌經(jīng)過(guò)大約7 h的停滯期，開(kāi)始大量生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在經(jīng)過(guò)26 h左右細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最大值，此后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的穩(wěn)定之后，細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始緩慢下降，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。pH值6時(shí)，停滯期相對(duì)較長(zhǎng)，大約在22 h左右才開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但之后生長(zhǎng)速度較為迅速，在30 h左右細(xì)菌總量已經(jīng)達(dá)到最大值，此后經(jīng)過(guò)一定的穩(wěn)定時(shí)間，細(xì)菌生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，菌體總量緩慢下降。在pH值7、pH值8環(huán)境中的停滯期時(shí)間大致相同，大約34 h左右，此后細(xì)菌的生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大約在54～55 h左右，細(xì)菌生長(zhǎng)總量達(dá)到最大值，此后菌體生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入停滯期，細(xì)菌總量緩慢下降。在pH值9的環(huán)境下，停滯期達(dá)到40 h左右，在第46 h時(shí)，缺陷短波單胞菌才開(kāi)始大量生長(zhǎng)，并在56 h左右菌體總量達(dá)到最大值，與pH值7、pH值8環(huán)境下達(dá)到最大值的時(shí)間大致相同，此后開(kāi)始進(jìn)入細(xì)菌總量緩慢下降的衰亡期。

因?yàn)樵摼趐H值5的條件下生長(zhǎng)狀況良好，于是猜測(cè)它在pH值小于5的條件下可能也有生長(zhǎng)，因此考察pH值小于5時(shí)的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖3(b)所示。

由圖3(b)缺陷短波單胞菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)看出，在pH值4的環(huán)境下，缺陷短波單胞菌在經(jīng)過(guò)大約58 h的停滯期后才開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，觀(guān)察生長(zhǎng)曲線(xiàn)也可以看出，pH值4條件下的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速度相對(duì)于pH值5、pH值6、pH值7、pH值8和pH值9條件下的對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速度更為緩慢，而且達(dá)到菌體最大量所需要的時(shí)間更久。pH值2和pH值3的環(huán)境中，在測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn)的80 h內(nèi)，細(xì)菌總量幾乎沒(méi)有變化，可以推斷缺陷短波單胞菌在pH值較低的條件下特別是pH值小于4時(shí)生長(zhǎng)極為緩慢，或者根本不會(huì)生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)束時(shí)測(cè)定每組pH值發(fā)現(xiàn)初始設(shè)定pH值為5、6、7、8、9的5個(gè)錐形瓶溶液的pH值都接近5，初始設(shè)定pH值為2、3、4的錐形瓶中溶液的pH值幾乎沒(méi)有變化，缺陷短波單胞菌可以在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程中產(chǎn)生一定量的酸性物質(zhì)，導(dǎo)致溶液酸化[9]，而初始pH值為7～9時(shí)經(jīng)歷較長(zhǎng)的延滯期后的生長(zhǎng)，有可能是pH值已經(jīng)降低。而對(duì)pH值的監(jiān)測(cè)，也證實(shí)了這一結(jié)果。因此缺陷短波單胞菌合適的生長(zhǎng)pH值為5左右。

2.2.2 pH值對(duì)缺陷短波單胞菌處理制漿中段廢水的影響

不同pH值條件下，缺陷短波單胞菌對(duì)制漿中段廢水CODCr的去除效果如圖4所示。

圖4 pH值對(duì)CODCr去除率的影響

通過(guò)圖4可以看出，缺陷短波單胞菌在30℃、pH值5～9對(duì)制漿中段廢水都有一定處理效果，CODCr去除率基本都在20%以上。在pH值5時(shí)的處理效果最好，CODCr去除率可達(dá)38.5%。pH值6～8時(shí)的CODCr去除效果相差不大，但是要略差于pH值5條件下的CODCr去除效果。這3個(gè)pH值條件下的最高CODCr去除率分別可以達(dá)到33.3%、31.8%、30.2%。pH值9條件下，CODCr去除率最低，為20.3%。由于缺陷短波單胞菌的產(chǎn)酸性，在pH值為6～9時(shí)，整個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)，廢水大分子有機(jī)物水解為有機(jī)酸，使系統(tǒng)中微環(huán)境pH值降低，這種行為不僅為自身生長(zhǎng)繁殖提供了有利條件，而且增強(qiáng)對(duì)制漿中段廢水CODCr的降解效果。

研究表明，缺陷短波單胞菌在pH值為5～8，對(duì)多環(huán)芳烴具有較好的降解效果[11]，這與制漿中段廢水中的木素類(lèi)有機(jī)物相似，該研究中適合處理廢水的pH值與本研究得到的結(jié)果相似。

綜上所述，缺陷短波單胞菌在較廣泛的初始pH值范圍內(nèi)對(duì)制漿中段廢水CODCr都有一定的去除效果，這種單一菌株在pH值5～8對(duì)制漿中段廢水均有較好的處理效果，在pH值9環(huán)境中也有一定處理效果。

2.2.3 溫度對(duì)缺陷短波單胞菌處理制漿中段廢水的影響

圖5 溫度對(duì)CODCr去除率的影響

在pH值為5時(shí)，溫度對(duì)缺陷短波單胞菌對(duì)制漿中段廢水CODCr的去除效果如圖5所示。

從圖5可以看出，缺陷短波單胞菌在30℃時(shí)對(duì)廢水的處理效果最好，CODCr去除率達(dá)37.1%，在10℃和45℃時(shí)，對(duì)CODCr也有一定去除，但去除率不太高，10℃為9.11%，45℃為19.9%，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)低或者過(guò)高影響了微生物體內(nèi)的酶的活性，導(dǎo)致相同時(shí)間去除的CODCr的量減少。因此，缺陷短波單胞菌的最適溫度應(yīng)在30℃左右，這與伯杰氏鑒定手冊(cè)中所述的缺陷短波單胞菌的生長(zhǎng)溫度一致。而在高溫時(shí)的降解效果明顯高于低溫，在伯杰氏鑒定手冊(cè)中描述缺陷短波單胞菌能在高達(dá)41℃條件下正常生長(zhǎng)代謝，而在45℃下盡管抑制微生物生長(zhǎng)代謝，但偏離41℃不太大，因此CODCr去除率也不太低。

2.3 缺陷短波單胞菌強(qiáng)化好氧活性污泥處理制漿中段廢水的研究

將缺陷短波單胞菌制成菌粉，加入經(jīng)制漿中段廢水馴化的好氧活性污泥系統(tǒng)中，加入量為0.1 g/L，考察優(yōu)勢(shì)菌對(duì)好氧活性污泥處理制漿中段廢水的強(qiáng)化作用，并以不加優(yōu)勢(shì)菌的好氧活性污泥系統(tǒng)作為對(duì)照，結(jié)果如圖6所示。

圖6 優(yōu)勢(shì)菌對(duì)好氧活性污泥處理制漿中段 廢水的強(qiáng)化效果

由圖6可以看出，缺陷短波單胞菌的加入可以提高好氧活性污泥降解制漿中段廢水的效果，CODCr去除率提高15%以上。在運(yùn)行的10個(gè)周期內(nèi)，作為對(duì)照的好氧活性污泥系統(tǒng)CODCr去除率波動(dòng)幅度較大，添加優(yōu)勢(shì)菌后，CODCr去除率在86.9%～89.2%之間，波動(dòng)幅度很小。表明缺陷短波單胞菌不僅可以強(qiáng)化好氧活性污泥處理制漿中段廢水，而且可以起到穩(wěn)定出水水質(zhì)的作用。

3 結(jié) 論

(1)從實(shí)驗(yàn)室經(jīng)制漿中段廢水的活性污泥中分離純化獲得1株優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)MIDI Sherlock?全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為缺陷短波單胞菌。

(2)缺陷短波單胞菌生長(zhǎng)的最適pH值為5，在該條件下，對(duì)制漿中段廢水的處理效果最好，CODCr的去除率最高可達(dá)38.5%。在溫度30℃時(shí)，該優(yōu)勢(shì)菌對(duì)制漿中段廢水處理效果最好，溫度偏高或偏低，處理效果下降，但高溫效果優(yōu)于低溫效果。

(3)缺陷短波單胞菌可強(qiáng)化好氧活性污泥處理制漿中段廢水的效果，且具有穩(wěn)定出水水質(zhì)的作用。

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(責(zé)任編輯：馬 忻)

Identification, Growth and COD Removal Efficiency of a Preponderant Bacterium for Degradation of Pulping Effluent

DANG Ya-pan1LAN Shan-hong2，*

(1.SchoolofEnvironmentandEnergy,TheKeyLabofPollutionControlandEcosystem,RestorationinIndustryClustersofMinistryofEducation,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,GuangdongProvince, 510006;2.SchoolofEnvironmentandCivilEngineering,DongguanUniversityofTechnology,Dongguan,GuangdongProvince, 523808)

(*E-mail: llsshhh@163.com)

In this paper, a purified strain was isolated from activated sludge of pulping effluent, which was identified asBrevundimonasdiminutaby MIDI Sherlock?automatic Microbial Identification System. Effect of pH and temperature on the growth curve of the preponderant bacterium the degradation efficiency of pulping effluent were studied. The experimental results showed that the removal efficiency of COD was the best when pH was 5 at the temperature of 30℃. COD removal efficiency reached 38.5%. The removal efficiency also reached a significant level when pH was 6～8, reached up to 30%. The treatment efficiency of pulping effluent by the aerobic activated sludge system increased by more than 10% in the presence ofBrevundimonasdiminuta.

preponderant bacteria; pulping effluent; identification; growth

黨亞攀先生，在讀碩士研究生；主要從事水處理技術(shù)研究工作。

2016- 12- 19(修改稿)

廣東省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(2015KTSCX140)；2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃省級(jí)項(xiàng)目(201611819053)。

X793

A

10.11980/j.issn.0254- 508X.2017.03.007

*通信作者：蘭善紅，教授；研究方向：水處理技術(shù)以及絮凝吸附材料合成等。