小葉蓮有效成分對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及線粒體膜電位的影響Δ

孔 越，王慶輝，尚明英#，肖軍軍，孟書聰，蔡少青（.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，北京 009；2.國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 0090；.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京009）

小葉蓮有效成分對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及線粒體膜電位的影響Δ

孔 越1，2＊，王慶輝1，尚明英1#，肖軍軍3，孟書聰3，蔡少青1（1.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，北京 100191；2.國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190；3.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京100191）

目的：探討小葉蓮提取物、有效成分及成分組合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法：采用酸性磷酸酶法測(cè)定小葉蓮4種提取物[乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）]、5種有效成分[鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-異戊烯基山柰酚（S4）、8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）]以及3種有效成分組合{組合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1]、組合2[S2-S4（1∶1），Z2]、組合3[S3-S4（1∶4），Z3]}對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述樣品對(duì)MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）細(xì)胞周期和細(xì)胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果：小葉蓮有效成分組合Z1對(duì)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞具有顯著抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（0.27±0.2）、（0.11±0.1）μg/mL；提取物Xc、Xp、Xe，有效成分S2、S4以及成分組合Z2、Z3對(duì)MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)抑制作用，IC50均小于15 μg/mL；各提取物和有效成分均可阻滯MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞周期于G2/M期；各有效成分組合均可阻滯MDA-MB-231、T47D細(xì)胞周期于G0/G1期，并能降低MDA-MB-231、T47D細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)論：小葉蓮有效成分及成分組合可通過影響細(xì)胞周期和線粒體膜電位，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

小葉蓮；有效成分；有效成分組合；人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞；人乳腺癌T47D細(xì)胞；細(xì)胞周期；線粒體膜電位

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小葉蓮乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物以及小葉蓮主要成分8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚和槲皮素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7裸鼠移植瘤具有明顯的抑瘤作用，對(duì)人乳腺癌T47D、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖有明顯抑制作用[2，8]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究采用人乳腺癌T47D、MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞株，對(duì)小葉蓮乙醇提取物及其不同極性萃取部分、從小葉蓮抗乳腺癌有效部位乙酸乙酯萃取物中分離得到的各種有效成分以及有效成分組合進(jìn)行體外乳腺癌細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，并初步探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期和細(xì)胞線粒體膜電位的影響，為進(jìn)一步明確小葉蓮抗乳腺癌的有效成分和作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

680型Microplate Reader酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；FACS Clibur型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用順鉑（無菌分裝粉針劑，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：1060171DB，規(guī)格：10 mg）；紫杉醇注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：10031812，規(guī)格：16.7 mL∶100 mg）；鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4′-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-異戊烯基山柰酚（S4）和8，2′-二異戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）為筆者從小葉蓮中分離得到，通過1H-NMR、13C-NMR譜等方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）-二級(jí)管陣列檢測(cè)（DAD）面積歸一化法測(cè)定各化合物純度均高于98%；小葉蓮有效成分組合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），m/m/m/m，Z1]、組合2[S2-S4（1∶1），m/m，Z2]、組合3[S3-S4（1∶4），m/m，Z3]；小葉蓮乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）按文獻(xiàn)[8]方法制備，單體化合物和有效成分組合以二甲基亞砜（DMSO）制備成濃度均為10μmol/mL的貯備液，即S1、S2、S3、S4的質(zhì)量濃度分別為4.14、3.98、3.84、3.54、4.52 mg/mL，Z1、Z2、Z3的質(zhì)量濃度分別為4.34、3.76、3.60 mg/mL；將小葉蓮提取物以DMSO制備成質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的貯備液；DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清（美國Gibco公司）；硝基苯磷酸鹽（美國Fluka公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，均由北京化工廠生產(chǎn)。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人乳腺癌T47D細(xì)胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部腫瘤生物中心杜曉娟副教授提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

當(dāng)?shù)刂饕N植荔枝、柑桔、木瓜、番石榴、火龍果等經(jīng)濟(jì)作物。近兩年，當(dāng)?shù)卮罅ν菩兴室惑w化種植，這是轉(zhuǎn)變農(nóng)業(yè)施肥方式的一項(xiàng)先進(jìn)農(nóng)作物科學(xué)施肥技術(shù)。目前當(dāng)?shù)刂魍扑室惑w化配套水溶肥、液體肥，很多農(nóng)民都參加了培訓(xùn)。從今年開始，農(nóng)藥價(jià)格較去年同期上漲3.6%，化肥價(jià)格同比上漲7%，經(jīng)銷商積極性雖然提高，但仍不囤貨。

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人乳腺癌T47D細(xì)胞株均用含10%新生小牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、95%濕度、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接近融合時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，同時(shí)接種細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 酸性磷酸酶法檢測(cè)細(xì)胞增殖及增殖抑制率

按照文獻(xiàn)[15]方法，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，按1.5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入1、5、25、50、100μg/mL質(zhì)量濃度的小葉蓮提取物或者濃度為1、5、10、50、100μmol/L的單體化合物和有效成分組合；陰性對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液；順鉑組（陽性對(duì)照）分別加入1、2、4、6、8、10μg/mL質(zhì)量濃度的順鉑溶液。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別于作用24、48、72 h后棄去培養(yǎng)基，各孔用磷酸鹽緩沖液（PBS）100μL洗2遍，棄PBS，加入10 mmol/L的硝基苯磷酸鹽溶液100μL（0.1 mol/L醋酸緩沖液制備，含0.1%Triton X-100），置于37℃孵育2 h后，每孔加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm波長處吸光度（A），重復(fù)試驗(yàn)3次。計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率[增殖抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/陰性對(duì)照組平均A值）×100%]。采用SPSS 21.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

小葉蓮提取物和單體化合物的實(shí)驗(yàn)組采用人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞，Xc和Xe加入的質(zhì)量濃度均為25μg/mL，S2、S3、S4加入的質(zhì)量濃度分別為3.98、3.84、17.7μg/mL；有效成分組合的實(shí)驗(yàn)組采用人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細(xì)胞，Z1、Z2、Z3加入的質(zhì)量濃度分別為0.217、0.94、51.8μg/mL；陰性對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液；紫杉醇組（陽性對(duì)照）加入紫杉醇2μg/mL。上述各組分別于作用24、48 h后，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，PBS洗滌，加入冰預(yù)冷的70%乙醇3 mL，4℃固定1 h，PBS洗滌2次，加入0.2 mg/mL RNA酶室溫保溫30min，加入終質(zhì)量濃度為20 mg/L的碘化丙啶，溫育30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響，不同分期細(xì)胞所占比例采用ModFit LT細(xì)胞周期分析軟件進(jìn)行分析。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位

人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細(xì)胞株在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。小葉蓮有效成分組合實(shí)驗(yàn)組Z1、Z2、Z3加入質(zhì)量濃度分別為0.217、0.94、1.8μg/mL，陰性對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液，紫杉醇組（陽性對(duì)照）加入紫杉醇2 μg/mL。作用24 h后，經(jīng)胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，冷PBS洗滌，500 μL PBS重懸細(xì)胞，再加入500 μL Rhodamine 123（10 mg/L）用以標(biāo)記活細(xì)胞，終濃度為0.14 μmol/L。37Ⅴ孵育30 min后，PBS洗滌細(xì)胞3次，PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm）。

3 結(jié)果

3.1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

3種小葉蓮提取物Xc、Xp、Xe均可較好地抑制MDAMB-231細(xì)胞的增殖，Xz作用不明顯；5種單體化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，以S3作用最強(qiáng)；在高濃度（100μmol/L）時(shí)2種異戊烯基黃酮類成分S4、S5表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其抑制率分別為94.8%、98.6%，其作用強(qiáng)于3種木脂素類成分S1、S2、S3（抑制率分別為50.0%、60.2%、69.9%）；3種有效成分組合中以Z1作用最強(qiáng)。

各樣品對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，4種不同極性小葉蓮提取物中以Xe的作用最強(qiáng)；5種單體化合物中以S2作用最強(qiáng)，S4、S5則在高濃度（100 μmol/L）下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性（抑制率分別為81.2%、92.1%）；3種有效成分組合中以Z1作用最強(qiáng)。IC50測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合對(duì)細(xì)胞周期的影響

3.2.1 小葉蓮提取物及有效成分對(duì)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞周期的影響 小葉蓮各提取物和單體化合物與MDA-MB-231細(xì)胞分別作用24 h后，與陰性對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，G2/M期細(xì)胞比例明顯升高；小葉蓮各提取物和單體化合物與MCF-7細(xì)胞分別作用24 h后，與陰性對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高、S期細(xì)胞比例明顯降低；紫杉醇組也表現(xiàn)出同樣的抑制作用，結(jié)果見表2。

3.2.2 小葉蓮有效成分組合對(duì)MDA-MB-231、T47D細(xì)胞周期的影響 小葉蓮有效成分組合與MDA-MB-231、T47D細(xì)胞分別作用24 h后，與陰性對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，G2/M期細(xì)胞比例明顯升高；紫杉醇組也表現(xiàn)出同樣的抑制作用，結(jié)果見表3。

表1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合作用48 h后對(duì)細(xì)胞的IC50測(cè)定結(jié)果（s，μg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，μg/ mL，n＝6）

表1 小葉蓮提取物、有效成分和成分組合作用48 h后對(duì)細(xì)胞的IC50測(cè)定結(jié)果（s，μg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，μg/ mL，n＝6）

注：“-”表示IC50＞100μg/mLNote：“-”means IC50＞100μg/mL

MDA-MB-231MCF-7 21.27±0.3 14.01±0.1 1.00±0.4 0.62±0.1 -2.68±0.2 2.10±0.3 0.28±0.1 10.20±0.5 11.50±0.4 0.27±0.2 2.72±0.3 1.27±0.2組別陰性對(duì)照組順鉑組Xc組Xp組Xe組Xz組S1組S2組S3組S4組S5組Z1組Z2組Z3組25.96±0.4 2.67±0.2 2.08±0.3 1.26±0.1 16.59±0.5 9.08±0.4 1.00±0.1 16.55±0.4 10.24±0.6 24.40±0.5 0.11±0.1 5.43±0.4 0.74±0.1

表2 小葉蓮提取物及有效成分作用24 h后對(duì)MDAMB-231、MCF-7細(xì)胞周期的影響（%%）Tab 2 Effects of Sinopodophylli Fructus extracts and active constituents on MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle after 24 h（%%）

表3 小葉蓮有效成分組合作用24 h后對(duì)MDA-MB-231、T47D細(xì)胞周期的影響（%%）Tab 3 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on MDA-MB-231 and T47D cell cycle after 24 h（%%）

3.3 小葉蓮有效成分組合對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

小葉蓮有效成分組合Z1、Z2、Z3作用MDA-MB-231、T47D細(xì)胞24 h后，弱熒光細(xì)胞（M1）與陰性對(duì)照組比較開始增多，常熒光細(xì)胞（M2）相應(yīng)地減少，提示MDAMB-231和T47D細(xì)胞在不同的小葉蓮有效成分組合作用下，線粒體跨膜電位受到影響而下降，使得進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光染料減少、M1百分比增高。

表4 小葉蓮有效成分組合對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231和T47D細(xì)胞線粒體膜電位的影響（%%）Tab 4 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231，T47D cell after 24 h（%%）

4 討論

本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上通過細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步證明了小葉蓮提取物乙酸乙酯部位為小葉蓮抑制乳腺癌的有效部位。從小葉蓮乙酸乙酯萃取物中分離得到的5種單體化合物，其中3種鬼臼毒素類木脂素S1、S2和S3對(duì)2種類型乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，S3對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，S2則對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)；異戊烯基黃酮類化合物S4和S5在高濃度（100μmol/L）下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231和MCF-7的增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。3種有效成分組合分別為根據(jù)各單體化合物在小葉蓮藥材中的含量比例配合而成，其中Z1為3種鬼臼毒素類木脂素和2種異戊烯基黃酮類成分按一定比例組合而成，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于各單體化合物。結(jié)果提示，小葉蓮中所含的木脂素類和異戊烯基黃酮類化合物可能通過不同的作用途徑發(fā)揮抗乳腺癌活性，各有效成分組合會(huì)產(chǎn)生疊加作用。

本研究用實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)3種乳腺癌細(xì)胞周期的影響不同（因不同實(shí)驗(yàn)階段實(shí)驗(yàn)室內(nèi)細(xì)胞生長等原因，小葉蓮提取物和單體化合物選擇MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株，化合物組合樣品選擇MDA-MB-231和T47D細(xì)胞株）。對(duì)于乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，Xc、Xe及S2、S3、S4及成分組合Z1、Z2、Z3均將細(xì)胞阻滯在G2/M期；對(duì)于乳腺癌細(xì)胞株T47D，各有效成分組合Z1、Z2、Z3均將細(xì)胞阻滯在G2/M期；而對(duì)于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，提取物及各單體化合物將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。小葉蓮提取物、有效成分及成分組合對(duì)不同的乳腺癌細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響不同，各有效成分組合均能降低MDA-MB-231細(xì)胞和T47D細(xì)胞線粒體膜電位，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Active Constituents ofSinopodophylli Fructuson Cell Proliferation，Cell Cycle and Mitochondrial Membrane Potential of Human Breast Cancer Cell

KONG Yue1，2，WANG Qinghui1，SHANG Mingying1，XIAO Junjun3，MENG Shucong3，CAI Shaoqing1（1.Dept.of Natural Medicines，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China；2.Patent Examination Cooperation Center of State Intellectual Property Office，Beijing 100190，China；3.Dept.of Cell Biology，School of Basic Medical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China）

OBJECTIVE：To explore the effects and mechanism of extracts，active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus on cell proliferation of human breast cancer.METHODS：Acid phosphatase method was conducted to determine the effects of 4 extracts[ethanol extract（Xc），petroleum ether extract from ethanol extract（Xp），ethyl acetate extract from ethanol extract（Xe），n-butanol extract from ethanol extract（Xz）]，5 active constituents[podophyllotoxin（S1），deoxypodophyllotoxin（S2），4-desmethyl deoxypodophyllotoxin（S3），8-isopentenyl kaempferol（S4），8，2′-diisoprenyl quercetin-3-methyl ether（S5）]and 3 active constituent combination[combination 1，S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1；combination 2，S2-S4（1∶1），Z2；combination 3，S3-S4（1∶4），Z3]on the MDA-MB-231，MCF-7 cell proliferation；flow cytometry was adopted to detect the effects of above-mentioned samples on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell cycle and mitochondrial membrane potential.RESULTS：The active constituent combination Z1showed significant inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7 cells，the half inhibitory concentrations（IC50）were（0.27±0.2），（0.11±0.1）μg/mL；extracts Xc，Xp，Xe，active constituents S2，S4and active constituent combination Z2，Z3showed relatively strong inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell proliferation（IC50＜15 μg/mL）. Both extracts and active constituents can block MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle in G2/M phase；all active constituents can block MDA-MB-231，T47D cell cycle in G0/G1phase，and can reduce MDA-MB-231，T47D cell mitochondrial membrane potential. CONCLUSIONS：The active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus can inhibit cell proliferation of breast cancer by affecting cell cycle and mitochondrial membrane potential.

Sinopodophylli Fructus；Active constituent；Active constituent combination；Human breast cancer MDAMB-231 cells；Human breast cancer MCF-7 cells；Human breast cancer T47D cells；Cell cycle；Mitochondrial membrane potential

R931.6

A

1001-0408（2017）10-1368-04

2016-05-14

2016-12-23）

（編輯：林 靜）

國家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（No.2013ZX09103002-006，2009ZX09308-004）；中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.2010JZ-W-01）

＊碩士。研究方向：中藥活性成分。電話：010-62413792。E-mail：kong.yue@foxmail.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：010-82802534。E-mail：myshang@bjmu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.19