CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)在病原微生物中的應(yīng)用

安鼎杰，康元環(huán)，陳 龍，張海月，張冬星，田佳鑫，賈俊鵬，孫武文，單曉楓，錢愛東

CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)在病原微生物中的應(yīng)用

安鼎杰，康元環(huán)，陳 龍，張海月，張冬星，田佳鑫，賈俊鵬，孫武文，單曉楓，錢愛東

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)廣泛存在于古細(xì)菌及細(xì)菌中是細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種獲得性免疫系統(tǒng)。近年來以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)，經(jīng)過人工改造形成的一種新型基因編輯技術(shù)—CRISPR/Cas9在基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用越發(fā)廣泛；該技術(shù)與前兩代編輯技術(shù)相比，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉、實(shí)用價(jià)值較高等優(yōu)點(diǎn)。自2012年在基因研究領(lǐng)域成功應(yīng)用后，已成為當(dāng)前關(guān)注度較高的基因編輯工具；該技術(shù)在多種真核生物的基因修飾中已得到成功應(yīng)用，但在病原微生物上卻報(bào)道較少。本文將從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其在病原微生物基因功能研究中的應(yīng)用等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述為其深入研究奠定基礎(chǔ)。

基因編輯；CRISPR/Cas9；病原生物；脫靶效應(yīng)

基因編輯技術(shù)是指對(duì)特定的DNA片段編輯，如：敲除、插入、干擾以及沉默等。最初的基因編輯技術(shù)是利用注射或電轉(zhuǎn)的方法將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，通過發(fā)生同源重組將導(dǎo)入的DNA片段插入到細(xì)胞基因組中[1]；但是較低的插入效率使得該項(xiàng)技術(shù)在應(yīng)用上受到了一定程度的限制。隨著鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)的出現(xiàn)，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因的精準(zhǔn)編輯而且在效率上有顯著的提高；然而這兩項(xiàng)技術(shù)從一開始出現(xiàn)就被少數(shù)幾家公司壟斷，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中這兩項(xiàng)技術(shù)存在的弊端也逐漸顯露，例如：系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)雜、準(zhǔn)備周期長(zhǎng)、成本較高、脫靶造成的基因突變不可控等；目前急需一種更為簡(jiǎn)單，高效且能滿足復(fù)雜實(shí)驗(yàn)要求的新方法。

CRISR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFN和TALEN技術(shù)之后出現(xiàn)的第3代基因編輯技術(shù)，該技術(shù)是古細(xì)菌和細(xì)菌中存在的II型CRISPR/Cas獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)人工改造而來[2]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由可以整合外源DNA片段的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和發(fā)揮剪切作用的Cas9核酸內(nèi)切酶構(gòu)成；在一段特殊的RNA序列引導(dǎo)下對(duì)目的片段進(jìn)行切割。由于該項(xiàng)技術(shù)較前兩代基因編輯技術(shù)相比具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作、特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成功在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚、食蟹猴、果蠅、以及擬南芥等動(dòng)植物上應(yīng)用，對(duì)其相應(yīng)基因進(jìn)行修飾加工，從而得到理想的相關(guān)生物學(xué)模型；這也意味著該技術(shù)在真核生物相關(guān)的研究領(lǐng)域內(nèi)發(fā)展日趨成熟；近年報(bào)道表明在原核生物基因功能研究方面也已經(jīng)開始使用該技術(shù)。本文將主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和在病原生物基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)展等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述為其深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的介紹

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)歷程 CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌長(zhǎng)期進(jìn)化過程中抵御噬菌體入侵和外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而形成的一種獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷程最早可追溯到1987年，日本科學(xué)家Y.Ishino[3]等在K12大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)CRISPR序列，但無法確定這段序列的功能，因此并未引起科研人員的足夠重視；1995年西班牙科學(xué)家在對(duì)地中海極嗜鹽菌(Haloferaxediaterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haleferaxvolcanii)研究中再次發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)[4]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)該序列研究程度的加深，2002年Jansed[5]等正式將發(fā)現(xiàn)的這種串聯(lián)重復(fù)序列命名為CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)序列，自此之后CRISPR系統(tǒng)逐漸進(jìn)入人們的視野，但對(duì)其具體功能仍尚不明確；直到2005年3個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)CRISPR序列中的間隔序列與入侵細(xì)菌的噬菌體和質(zhì)粒有較高的同源性，據(jù)此推測(cè)該序列可能參與到抵御噬菌體入侵和外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的過程中[6]。2012年該技術(shù)開始應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域的研究中[7]，并逐步在原核和真核生物基因編輯中獲得成功，特別是最近幾年，該技術(shù)發(fā)展更為迅猛并在動(dòng)物建模，新藥開發(fā)及疾病治療等不同領(lǐng)域中逐步得到應(yīng)用，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成及類型 根據(jù)已收錄的CRISPR序列信息，通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中均存在CRISPR系統(tǒng)，且至少存在一個(gè)CRISPR位點(diǎn)，但有些細(xì)菌則含有十幾個(gè)或上百個(gè)[8]； CRISPR位點(diǎn)通常位于細(xì)菌的染色體上，有些則存在于細(xì)菌胞內(nèi)的質(zhì)粒上。CRISPR序列的主體是由發(fā)揮不同作用的Cas蛋白基因序列，前導(dǎo)序列以及CRISPR基因座構(gòu)成。其中功能不同的Cas蛋白基因序列在適應(yīng)性免疫的不同階段轉(zhuǎn)錄、翻譯不同的蛋白執(zhí)行各自特有的功能；而位于CRISPR位點(diǎn)上游的前導(dǎo)序列末端存在啟動(dòng)子，可在適應(yīng)性免疫的第二階段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；CRISPR基因座由啟動(dòng)子區(qū)域、多段同向的重復(fù)序列和間隔序列構(gòu)成的R-S結(jié)構(gòu)組成；其中重復(fù)序列并非嚴(yán)格意義上的保守序列，甚至在同一個(gè)細(xì)菌內(nèi)不同的CRISPR基因座中也存在差異，但這段序列的5′端和3′端尤為保守，分別為GTTT/g和GAAAC。重復(fù)序列還包含回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄出來的RNA能形成穩(wěn)定且保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能在與Cas蛋白結(jié)合形成相關(guān)核糖蛋白復(fù)合物的過程中發(fā)揮作用[9-12]。間隔序列不僅在數(shù)量上存在較大的差異，而且由于每次入侵細(xì)菌的噬菌體和質(zhì)粒不同，被整合到R-S結(jié)構(gòu)中的序列信息也各不相同，因此不存在相同或較為相近的間隔序列。

最初的研究結(jié)果顯示只有附近存在Cas基因的CRISPR基因座才有活性，但后續(xù)的研究證明該觀點(diǎn)并不十分準(zhǔn)確，某些附近不存在Cas基因的CRISPR基因座也可被轉(zhuǎn)錄并與其他位點(diǎn)表達(dá)的Cas蛋白相互作用從而行使其自身功能[12-13]；由此可見Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)功能的執(zhí)行者，并在實(shí)現(xiàn)這一功能的過程中發(fā)揮著重要的作用。由于Cas蛋白多種多樣，目前對(duì)其分類尚不統(tǒng)一，但其中一種分類方法依照Cas基因序列的保守程度不同，將其分為核心Cas基因、亞特異型Cas基因及重復(fù)序列功能未知蛋白(Repeat associated nysterious proteins,RAMP)[14]；而Makarova[15]等參照保守性Cas蛋白間的進(jìn)化關(guān)系和Cas基因操縱子的組成方式等，將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為2個(gè)獨(dú)立的子系統(tǒng)，第1個(gè)系統(tǒng)由核心Cas1蛋白和Cas2蛋白將外源基因整合到CRISPR序列中；第2個(gè)子系統(tǒng)負(fù)責(zé)crRNA的加工、外源基因的識(shí)別及降解。根據(jù)這種分類法將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種不同類型的系統(tǒng)：Type I、Type II 和、Type III。

這3種類型的系統(tǒng)中存在一些共有蛋白基因，同時(shí)也含有各自特有的Cas蛋白基因，其功能的不同主要體現(xiàn)在對(duì)于crRNA的加工、外源基因的識(shí)別以及降解這一過程中。

I型CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中均有分布，是3類系統(tǒng)中亞型最多的系統(tǒng)，其編碼的Cas蛋白種類繁多，其中由多個(gè)Cas蛋白形成的CRISPR相關(guān)病毒防御復(fù)合物Cascade(CRISPR associated complex for antiviral defense)不僅參與crRNA的加工，而且還可與之形成能指導(dǎo)Cas3蛋白降解外源基因的核糖核蛋白復(fù)合體[16]。目前該系統(tǒng)在大腸桿菌(Escherichiacoli)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中研究較多[16-20]，其特有蛋白為Cas3蛋白。

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌內(nèi)，為三類系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，特有蛋白為Cas9蛋白，這種蛋白是一種大分子多功能蛋白，該蛋白不僅可降解外源基因序列，而且還參與了crRNA的成熟過程[21]。根據(jù)系統(tǒng)所含有的操縱子類型不同，將II型系統(tǒng)分為兩個(gè)亞型，一種是含有Csn2基因的TypeII-A亞型，另一種是含有Cas4基因的TypeII-B亞型。在Cas9蛋白降解外源基因序列過程中，不僅僅需要crRNA的參與，后續(xù)的研究表明除了crRNA之外，反式激活crRNA(transactivating crRNA,tracrRNA)及RNaseIII均參與了該過程協(xié)助Cas9蛋白降解外源基因[22]。

III型CRISPR/Cas系統(tǒng)大多存在于古細(xì)菌中，僅有少量的存在于細(xì)菌中。特有蛋白分別是Cas10和Cas6蛋白[23]，但功能尚不十分明確，推測(cè)這兩類蛋白均可能參與crRNA的加工，而Cas10蛋白可對(duì)靶序列進(jìn)行降解。除了特有蛋白不同之外，該系統(tǒng)與前兩類系統(tǒng)最大的區(qū)別在于對(duì)靶序列的識(shí)別機(jī)制，其通過crRNA5′末端與靶序列錯(cuò)配來區(qū)分外源基因[24]。目前該型系統(tǒng)存在兩個(gè)亞型：TypeIII-A和TypeIII-B型，二者干擾的靶標(biāo)并不相同，分別為mRNA和DNA。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制 在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中細(xì)菌為了抵御病毒入侵和外源性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，已進(jìn)化出多種防御機(jī)制，以CRISPR/Cas為核心的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)就是其中之一。其作用機(jī)制可分為三個(gè)階段：第一階段是新間區(qū)的獲取，第二階段是CRISPR基因座的表達(dá)，第三階段是對(duì)入侵核酸的干擾。圖1為：CRISPR/Cas系統(tǒng)抵御噬菌體入侵的機(jī)制示意圖，具體機(jī)制如下。

1.3.1 第一階段：新間區(qū)的獲取 當(dāng)外源性基因進(jìn)入帶有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌時(shí)，該系統(tǒng)首先對(duì)外源基因進(jìn)行掃描識(shí)別后，而后通過具有DNA內(nèi)切酶活性Cas1蛋白將外源基因切割成17～48 bp大小的目的片段，剪切后的片段被具有核糖核酸內(nèi)切酶活性Cas2蛋白識(shí)別并插入到CRISPR/Cas基因座中的前導(dǎo)序列與第一個(gè)重復(fù)序列之間，伴隨著新間隔序列插入的同時(shí)，重復(fù)序列也進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而形成了新的R-S結(jié)構(gòu)，將外源基因的序列信息存儲(chǔ)在CRISPR系統(tǒng)中，為適應(yīng)性免疫奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與這段間隔序列具有較高同源性的噬菌體或質(zhì)粒序列被稱為原間隔(protospacer)；而在原間隔5′或3′端有一段長(zhǎng)度大約為2～5 bp左右的保守序列叫做原間隔相關(guān)基序(Protospacer associated motif,PAM)[25]，該段序列在對(duì)外源基因序列剪切的過程中起到相應(yīng)靶點(diǎn)的作用，不同的菌屬間或同屬不同菌株間PAM序列也不近相同，正因?yàn)镻AM序列的存在，才避免了CRISPR系統(tǒng)對(duì)自身序列的切割，但只有I和II型系統(tǒng)通過PAM序列識(shí)別外源基因。

1.3.2 第二階段：CRISPR基因座表達(dá) 正常情況下CRISPR基因座表達(dá)水平很低，當(dāng)那些與間隔序列具有同源性的噬菌體或質(zhì)粒再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR基因座表達(dá)量迅速上調(diào)[15]，轉(zhuǎn)錄起始于前導(dǎo)序列末端的啟動(dòng)子，生成CRISPR前體RNA(CRISPR precursor RNA,pre-crRNA)，但是其還不具備與Cas蛋白結(jié)合的能力，隨后該RNA被進(jìn)一步加工成含有一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列的小段成熟crRNA，并與特異的Cas蛋白結(jié)合形成相關(guān)核糖核蛋白復(fù)合物，在干擾階段發(fā)揮作用。

1.3.3 第三階段：對(duì)入侵核酸的干擾 干擾是CRISPR/Cas系統(tǒng)抵御外源基因入侵中關(guān)鍵性的步驟，crRNA與外源DNA通過堿基配對(duì)結(jié)合后，核糖核蛋白復(fù)合物通過識(shí)別PAM序列來定位切割的目的片段，在核酸酶活性的作用下對(duì)外源基因進(jìn)行降解；早期的研究認(rèn)為crRNA與原間隔序列匹配程度決定了能否對(duì)外源基因成功進(jìn)行干擾，但后期的研究表明這僅僅是干擾過程中的先決條件[26-27]，PAM序列的存在才是能否成功實(shí)施干擾的關(guān)鍵，倘若不存在PAM序列或其發(fā)生突變，即使crRNA與原間隔序列完美匹配，CRISPR/Cas系統(tǒng)也不能夠進(jìn)行正常的切割活動(dòng)[21,28-29]。

圖1 CRISPR/Cas抵御噬菌體侵染的過程[30]Fig.1 Resistance to phage infection by CRISPR/Cas

2 CRISPR/Cas9在病原微生物中的應(yīng)用

目前CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚、食蟹猴、非洲爪蟾、果蠅、煙草、水稻及擬南芥等真核生物的基因編輯中，并取得一系列重要的科研成果且部分成功已被應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。近年來，該技術(shù)也逐步被用于對(duì)病原微生物的研究中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)病原微生物的基因進(jìn)行敲除，并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)推測(cè)基因功能，而且該系統(tǒng)特異性較高，在效率上已明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。除了在敲除方面的應(yīng)用外，該系統(tǒng)經(jīng)過改造還可以對(duì)基因進(jìn)行插入，沉默和定向調(diào)控，雖然目前該系統(tǒng)在病原微生物研究中的應(yīng)用相對(duì)較少，但也已取得了一定的研究成果。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在寄生蟲上的應(yīng)用 在對(duì)寄生蟲基因功能的研究中，明確相應(yīng)基因的具體功能至關(guān)重要，CRISPR/Cas9技術(shù)除了較高的編輯效率之外，可對(duì)所要研究的基因進(jìn)行精準(zhǔn)的敲除，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)具體功能的研究。Shen等[31]最先利用CRISPR/Cas9敲除了弓形蟲的rop18基因并獲得缺失型GT-1I型蟲株，結(jié)果表明與RHI型蟲株相比GT-1I型蟲株毒力有所降低，并且驗(yàn)證了該方法在敲除效率上明顯高于同源重組法。Zheng等[32]利用CRISPR/Cas9敲除亮氨酸基肽酶基因后的缺失型蟲株轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞，揭示了亮氨酸基肽酶在弓形蟲入侵和附著中的作用，并證明了亮氨酸基肽酶對(duì)蟲體生長(zhǎng)有一定影響。

袁晶[33]利用了CRISPR/Cas9對(duì)瘧原蟲Pyser1，Py03652和Pyhsp70基因分別進(jìn)行敲除，插入和等位基因的置換，其效率分別達(dá)到了100%、20%和45%。

Noelia Lander[34]利用該技術(shù)對(duì)克氏錐蟲蟲體表面糖蛋白GP72基因和鞭毛棒狀蛋白PFR1和PFR2基因進(jìn)行了研究，揭示了這3個(gè)基因在鞭毛吸附細(xì)胞和蟲體運(yùn)動(dòng)中所發(fā)揮的作用，并發(fā)現(xiàn)對(duì)克氏錐蟲內(nèi)源性基因進(jìn)行編輯不產(chǎn)生明顯毒性作用。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌上的應(yīng)用 由于細(xì)菌之間差異較大，相較于其他領(lǐng)域的研究，CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)菌上的應(yīng)用才剛剛起步，但已被應(yīng)用于對(duì)肺炎鏈球菌和大腸桿菌的基因編輯中，并取得了較高的編輯效率，同時(shí)其在食品生產(chǎn)中也展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。Jiang等[35]對(duì)肺炎鏈球菌和大腸桿菌中多個(gè)基因進(jìn)行了編輯，突變效率較高在肺炎鏈球菌中達(dá)到100%，在大腸桿菌中達(dá)到65%。Michall E.Pyne等[36]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)融合后對(duì)大腸桿菌中的單鏈寡聚核苷酸基因進(jìn)行重組，同時(shí)對(duì)染色體上多基因進(jìn)行置換。研究結(jié)果再次驗(yàn)證了CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯上的高效性，同時(shí)為其功能的拓展提供了新的方向。此外，在食品發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，該技術(shù)可被用來提高發(fā)酵菌株抵抗噬菌體侵染的能力[37]。鑒于該技術(shù)所具有的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)室擬采用CRIPR/Cas9技術(shù)對(duì)維氏氣單胞菌(Averomonasveronii)相關(guān)基因進(jìn)行研究。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在病毒上的應(yīng)用 在艾滋病的治療過程中除了抑制病毒基因組的表達(dá)外，怎樣能夠讓免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)的整合病毒基因組成為治療的難點(diǎn)所在，CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)為艾滋病的治療帶來一絲曙光。長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Long terminal repeats,LTR)參與HIV病毒RNA的復(fù)制和翻譯，Hirotaka Ebina等[38]針對(duì)該序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgRNA，與hCas9共轉(zhuǎn)染整合有HIV-1的Jurkat細(xì)胞，經(jīng)過3輪轉(zhuǎn)染，流式分析GFP陽性細(xì)胞比例由 97.8%下降到35.5%，成功限制了原病毒的激活和表達(dá)。Hu等[39]構(gòu)建了靶向HIV-1 LTR U3 啟動(dòng)子的gRNA-Cas9 質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染整合有單輪次感染的HIV基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和T4細(xì)胞，也可阻斷病毒基因組的復(fù)制和表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cas9/gRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生細(xì)胞毒性也不造成脫靶效應(yīng)。Zhu等[40]設(shè)計(jì)10個(gè)針對(duì)HIV-1病毒的基因的CRISPR/Cas9靶點(diǎn)，并對(duì)已感染病毒的Jarkat細(xì)胞進(jìn)行基因插入，其中第2個(gè)外顯子位點(diǎn)的突變可使HIV-1的基因表達(dá)量和病毒產(chǎn)物較插入前減小20倍。 Prajit Limsirichai[41]利用基于乙酰轉(zhuǎn)移酶的CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)HIV-1的整合基因表達(dá)上調(diào)，結(jié)果顯示該系統(tǒng)可高效誘導(dǎo)病毒表達(dá)，與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法結(jié)合可以抑制HIV-1感染。

在乙肝治療方面僅僅抑制病毒復(fù)制和表達(dá)是不夠的，在抑制其復(fù)制和表達(dá)的同時(shí)運(yùn)用相應(yīng)的技術(shù)清除侵入的病毒基因組才是有望治愈乙肝的有效途徑。Lin等[42]將HBV體外表達(dá)質(zhì)粒和靶向 HBV 基因組的 gRNA-Cas9 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 Huh-7 細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn) HBV 核心蛋白和表面蛋白的表達(dá)量明顯降低，明顯抑制了病毒基因的表達(dá)；將 HBV表達(dá)質(zhì)粒和靶向 HBV 基因組的 gRNA-Cas9 質(zhì)粒共注射到 HBV 肝炎耐受小鼠的尾靜脈，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠血清表面抗原水平較對(duì)照組明顯降低，進(jìn)一步說明CRISPR/Cas9技術(shù)具有應(yīng)用于臨床治療的潛質(zhì)。Christoph Seegar等[43]轉(zhuǎn)染含有NTPC受體的Hep G2 細(xì)胞，測(cè)試了不同的gRNA，證明了Cas9蛋白可對(duì)cDNA造成突變或敲除相應(yīng)片段，同時(shí)干擾素不會(huì)對(duì)CRISPR/Cas9的抗病毒活性產(chǎn)生明顯影響。Wang等[44]針對(duì)HBV A-D的4個(gè)基因型設(shè)計(jì)了15種gRNA分別靶向HBV中不同的調(diào)控區(qū)域，其中11套系統(tǒng)為雙股RNA。結(jié)果顯示所用gRNAs均可在相應(yīng)的調(diào)控區(qū)內(nèi)抑制病毒基因組的表達(dá)，雙股RNA系統(tǒng)通過剪切2個(gè)RNAs之間的片段來破壞病毒的表達(dá)模板，在效率上明顯優(yōu)于單股RNA；而gRNA-5和gRNA-12組合使用不僅高效抑制了HBsAg和HBeAg的表達(dá)，同時(shí)也能夠清除HepAD38細(xì)胞中的cccDNA存儲(chǔ)庫；此項(xiàng)研究為乙肝的治療方面提供了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

此外，CRISPR/Cas9技術(shù)還被用于構(gòu)建相關(guān)病毒的弱毒株，Tiffant A.Russell[45]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)單純皰疹毒株的UL26和UL27基因之間進(jìn)行基因插入，結(jié)果顯示插入相應(yīng)的目的片段可有效減弱病毒的毒力，構(gòu)建的弱毒株可作為工程毒株用于后續(xù)研究。Xu等[46]基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立了一種高效構(gòu)建基因缺失偽狂犬病毒株的方法，并對(duì)偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)EP0、UL50基因進(jìn)行單缺失的同時(shí)又對(duì)EP0/US3基因進(jìn)行雙缺失，從而揭示急性早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(Promyelocytic leukemia,PML)抵抗PRV的作用機(jī)制，構(gòu)建的基因缺失型PRV為后期的疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3 CRISPR/Cas9的優(yōu)缺點(diǎn)

與前兩代技術(shù)相比CRISPR/Cas9打靶位點(diǎn)分布廣泛，不僅可對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行修飾，而且通過設(shè)計(jì)不同引物還可一次性對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行修飾，進(jìn)而減少了后期篩選的工作量，在提升效率的同時(shí)又縮短了實(shí)驗(yàn)周期；該技術(shù)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于構(gòu)建；經(jīng)合理的人工改造后，添加相應(yīng)的功能組件可對(duì)特定的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[47-48]。而與其他技術(shù)融合使用還可執(zhí)行不同的功能，極大地拓展了該技術(shù)的使用范圍，為其他領(lǐng)域的研究提供一條全新的途徑。

當(dāng)然，CRISPR/Cas9技術(shù)也存在一定的不足：在基因編輯過程中造成的脫靶效應(yīng)會(huì)擾亂基因組中其他基因的穩(wěn)定性，其次由脫靶效應(yīng)引起的非正常突變不可控，會(huì)帶來意想不到的結(jié)果。除脫靶效應(yīng)外，Cas9蛋白作為一種菌體蛋白，應(yīng)用于真核生物基因編輯中是否會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性或者帶有一定的免疫原性還尚無定論，有待進(jìn)一步的研究取證。

4 展 望

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于基因的了解程度逐漸加深，但受到科學(xué)技術(shù)的制約，對(duì)大部分基因的功能還沒有做到真正意義上的了解；CRISPR/Cas9技術(shù)因其具有的獨(dú)特魅力，自出現(xiàn)開始便在基因編輯領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注，該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于對(duì)基因功能的研究中并取得了豐碩的科研成果。伴隨著該系統(tǒng)使用范圍的拓展，其在遺傳育種，藥物開發(fā)，臨床醫(yī)療上的潛力被逐步發(fā)掘；雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)還存在一些不足之處，相信通過不斷的改進(jìn)和完善，該系統(tǒng)能在不同層次的研究上得到更廣闊的發(fā)展和應(yīng)用。

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Advance and application of CRISPR/ Cas9 mediated genome editing technique on pathogenic microorganism

AN Ding-jie, KANG Yuan-huan, CHEN Long, ZHANG Hai-yue, ZHANG Dong-xing, TIAN Jia-xin, JIA Jun-peng, SUN Wu-wen, SHAN Xiao-feng, QIAN Ai-dong

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an acquired immune system existing in archaea and bacteria with the long-term process of evolutionary. CRISPR/Cas9 gene editing system is a new type of gene editing technology developed based on the system. CRISPR/Cas9 is a more efficient method for gene targeting than the previous methods. It has been successfully applied for gene-modified of eukaryotes since 2012, but the reports about pathogenic microorgaisms are rarely. Here, the research progress in the structure, mechanism of CRISPR/Cas9 system and its applications on pathogenic microorgaisms is reviewed.

geneome editing; CRISPR/Cas9; pathogenic microorgaisms; off-target effect Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.31201927) and the Key Scientific and Technological Project of Jilin Provincial Science & Technology Department (No. 20150204065NY).

s: Shan Xiao-feng, Email: sxf1997@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.017

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31201927)和吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.20150204065NY)聯(lián)合資助

單曉楓，Email: sxf1997@163.com

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118

R372

A

1002-2694(2017)03-0280-07

2016-09-26 編輯：梁小潔