福建省1例不明原因肺炎病例中甲型H1N1流感病毒的全基因組特征分析

張炎華，翁育偉,2，張建明，修文瓊，陳宏彬，趙 琳，何文祥，朱 穎，謝劍鋒,2，鄭奎城,2

福建省1例不明原因肺炎病例中甲型H1N1流感病毒的全基因組特征分析

張炎華1，翁育偉1,2，張建明2,3，修文瓊1，陳宏彬1，趙 琳1，何文祥1，朱 穎1，謝劍鋒1,2，鄭奎城1,2

目的 了解1例不明原因肺炎病例中甲型H1N1流感病毒的生物學特性和變異情況，為臨床治療與疫情防控提供依據。方法 利用MDCK細胞分離不明原因肺炎病例中的甲型H1N1流感病毒，分離的毒株經全基因組測序后分析其抗原性、致病性和耐藥性等特征。結果 從該病例的咽拭子標本中分離得到1株甲型H1N1流感病毒并命名為A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)，其8個節段的核苷酸和氨基酸序列與A/California/07/2009(H1N1)疫苗株的相似性分別為96.9%～98.9%和96.7%～99.5%。氨基酸序列分析顯示HA蛋白共有18個位點發生突變，其中K163Q、S185T、S203T和D222N變異涉及到3個不同的抗原位點，提示病毒發生抗原漂移；與受體結合位點相關的D222N突變還提示病毒感染下呼吸道的能力增強。耐藥性分析顯示該病毒對金剛烷胺耐藥，對達菲仍然敏感。結論 本次研究的甲型H1N1流感病毒具有抗原漂移現象，且具備引發重癥肺炎的分子特征，應進一步加強監測，為疫情防控奠定基礎。

不明原因肺炎；甲型H1N1流感；全基因組特征

Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province, China (No. 2015J01152), the Medical Innovation Subject of Fujian Province (No.2014-CX-9) and the Training Project of Young and Middle-aged Talents in Health System of Fujian Province (No. 2015-ZQN-ZD-10) Corresponding author: Xie Jian-feng, Email: xjf417@163.com

2009年3月，甲型H1N1流感病毒(Pandemic H1N1)在墨西哥首次被發現，隨后迅速在全球蔓延開來，成為新的流行亞型之一[1]。甲型H1N1流感病毒經呼吸道傳播，其基因組為分節段的單負鏈RNA，因其基因容易在人類、禽類、畜類等不同宿主中發生突變和重組而經常暴發流行于人群之中。甲型H1N1流感病毒可導致發熱、咽痛、流涕、鼻塞、咳嗽、頭痛、乏力、全身酸痛等流感樣癥狀，在健康年輕患者中多呈良性經過，較少出現肺炎等并發癥。若患者年齡較大或伴有一些基礎性疾病，或者病毒發生變異引起致病力的改變，則患者可能出現肺炎等嚴重的臨床癥狀[2]。不明原因肺炎是由原衛生部于2004年7月下發的《全國不明原因肺炎病例監測實施方案》中提出來的概念，而不明原因肺炎監測是一種篩查SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome， 嚴重急性呼吸道綜合征)病例、人禽流感病例及其它傳染性呼吸道疾病的重要措施。本文通過分析1例不明原因肺炎病例中甲型H1N1病毒的全基因組特征，了解流感重癥病例中甲型H1N1流感病毒的生物學特性和變異情況，為甲型H1N1流感的監測、防控和臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2016年2月23日福建省福州市某肺科醫院按照不明原因肺炎監測方案向福州市疾病預防控制中心報告1例不明原因肺炎病例。患者為61歲的男性，患病前體健，發病前一周無外出旅行史，家中亦無外人入住，期間未接觸過雞、鴨、鴿子、豬等禽類和畜類，住所周圍未發現禽類或畜類異常死亡現象。肺部CT顯示該患者肺部感染，呈現肺炎癥狀。該病例于某部隊醫院住院治療4天后未見明顯好轉，遂轉診至該肺科醫院，該院門診以“不明原因肺炎”收住入院并采集病例咽拭子標本送至福州市疾病預防控制中心檢測，標本檢測結果為甲型H1N1流感核酸陽性。福州市疾病預防控制中心隨后將標本送至福建省疾病預防控制中心流感參比實驗室進行進一步研究。

1.1.2 試劑儀器 狗腎傳代細胞(MDCK細胞)由中國國家流感中心提供、本實驗室保存。病毒RNA提取采用QIAGEN公司的QIAamp○RViral RNA Mini Kit(Cat No:52906)，擴增體系采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Cat No:RR057A)，全基因組PCR擴增引物參照世界衛生組織(WHO)網站[3]提供的序列由TaKaRa公司合成。主要儀器為ABI公司的VeritiTMDx 96 Well Thermal Cycler 基因擴增儀。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 患者的咽拭子標本加入青霉素和鏈霉素后接種至MDCK細胞進行病毒分離，具體方法見參考文獻[4]。

1.2.2 核酸提取 按照試劑盒QIAamp○RViral RNA Mini Kit(Cat No:52906)的操作說明進行病毒RNA提取，RNA提取完成后保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.3 全基因組RT-PCR擴增與測序 按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒配制的50 μL反應體系如下：2× one step buffer(Dye plus) 25 μL，PrimeScript one step Enzyme Mix 2 μL，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，病毒RNA 5 μL，RNase Free dH2O 14 μL。反應條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min/kb，循環30次；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測鑒定后送鉑尚生物技術(上海)有限公司進行雙向測序。

1.2.4 全基因組序列拼接與分析 利用DNA Star 7.1.0和MEGA 6.1軟件對序列進行拼接、比對、同源性分析以及進化樹的構建。采用Neighbor-Joining(NJ)法構建進化樹，并用Bootstrap法(replication=1 000)進行檢驗。以疫苗株A/California/07/2009(H1N1)為參照對病毒全基因組核苷酸序列和氨基酸序列進行抗原性、致病性和耐藥性等特征進行分析。通過NetNGlyc 1.0 server 在線分析軟件對HA蛋白進行糖基化位點分析。本文所用核苷酸序列來源于GenBank和GISAID網站。

2 結 果

2.1 病毒分離結果 咽拭子標本在MDCK細胞中傳代3次后，獲得一份血凝試驗陽性的培養物，其血凝滴度(1%火雞血紅細胞)為16，經血凝抑制試驗鑒定為甲型H1N1流感病毒，并命名為A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)。

2.2 基因擴增與測序結果 經22對引物擴增，成功獲得A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)的全基因組片段。各片段經雙向測序和拼接后，獲得病毒基因組8個節段的完整編碼序列(PB2：2 280 bp；PB1：2 274 bp；PA：2 151 bp；HA：1 701 bp；NP：1 497 bp；NA：1 410 bp；M：982 bp；NS：863 bp)，序列在NCBI網站基因數據庫BLAST比對結果均顯示為甲型H1N1流感病毒基因。

2.3 全基因組相似性分析結果 以疫苗株A/California/07/2009(H1N1)為參照標準，對A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)核苷酸和氨基酸序列進行相似性分析。結果發現，A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)不同基因節段的核苷酸和氨基酸序列與疫苗株的相似性分別為96.9%～98.9%和96.7%～99.5%。其中，HA節段的核苷酸和氨基酸的相似性最小，分別只有96.9%和96.7%，表明HA的變異程度最大。詳見表1。

表1 A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)流感毒株與疫苗株的基因相似性比較

Tab.1 Comparison of genetic similarity between the A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1) and the vaccine strain

ViralstrainA/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)SegmentAminoacidlengthSimilarityofnucleotide(%)Similarityofaminoacid(%)A/California/07/PB275998.298.92009(H1N1)PB175798.299.5PA71698.599.2HA56696.996.7NP49898.299.0NA46997.996.8M252(M1)98.998.897(M2)98.699.0NS219(NS1)97.697.7121(NS2)98.498.4

2.4 全基因組系統進化分析結果 從GenBank和GISAID上下載甲型H1N1流感疫苗株A/California/07/2009(H1N1)、福建省首例甲型H1N1流感毒株A/Fujian/01/2009/(H1N1)、福建省達菲耐藥株A/Fuzhou/SWL11609/2013(H1N1)以及國內外部分地區不同年份的甲型H1N1流感全基因組序列(詳見表2)，對本次研究的病毒進行全基因組系統進化分析。系統進化分析顯示，A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)病毒株的8個節段基因都分別與疫苗株分布在不同的大分支上，其主要與2013年以后的毒株形成大的分支，而疫苗株A/California/07/2009(H1N1)則主要與2013年以前的毒株形成分支。值得注意的是，A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)病毒株的8個節段基因核苷酸均與2015年上海的A/Shanghai-Putuo/1860/2015(H1N1)親緣關系最近。全基因組進化分析情況詳見圖1。

2.5 氨基酸位點分析

2.5.1 血凝素蛋白(HA)氨基酸位點分析結果 相對于疫苗株A/California/07/2009/(H1N1)而言，本次研究的甲型H1N1流感病毒HA蛋白發生了較大的變異，突變率達到了3.28%。HA蛋白(不含信號肽)共發生了18處突變，分別是D14A、P83S、D97N、V152T、K163Q、 V173I、S185T、S203T、D222N、A256T、A261S、K283E、I321V、E374K、S451N、E491G、E499K、D501E。其中，K163Q變異位于Sa抗原決定簇，S185T 變異位于Sb抗原決定簇，S203T和 D222N變異位于Ca抗原決定簇，共有4個氨基酸位點變異涉及到3個抗原位點。D222N變異不僅位于抗原決定簇，而且還與受體結合位點(Receptor binding site，RBS)有關，可能導致肺炎等嚴重的臨床癥狀。與致病性相關的HA蛋白裂解位點氨基酸序列為V338PSIQSR↓GLFGAI，裂解位點只有一個堿性氨基酸，仍保持低致病性特征。經NetNGlyc 1.0 server軟件在線分析發現，與病毒抗原性、致病性和穩定性相關的HA蛋白糖基化位點未發生明顯變化(表3)。此外，HA蛋白信號肽發生了A13T突變，由丙氨酸(A)變異為疏水性較弱的蘇氨酸(T)，可能使信號肽的疏水性減弱進而影響HA蛋白運輸和定位。

表2 系統進化分析中的毒株名稱及來源

Tab.2 Strains and origination in phylogenetic analysis

StrainsDatabaseAccessionNO./IsolateIDPB2PB1PAHANPNAMNSA/California/07/2009(H1N1)GenBankKU93348KU93348KU93348KU93348KU93348KU93348KU93348KU93348A/Egypt/42/2014(H1N1)GenBankKP70217KP70217KP70218KP70218KP70218KP70218KP70218KP70218A/ferret/Taiwan/E01/2013(H1N1)GenBankKJ70201KJ70201KJ70201KJ70201KJ70201KJ70201KJ70201KJ70201A/Finland/76/2014(H1N1)GenBankKM4378KM4378KM4378KM4378KM4378KM4378KM4378KM4378A/FuZhou/SWL11609/2013(H1N1)GenBankKT18031KT18031KT18031KP01991KT18031KP01980KT18031KT18031A/Hawaii/22/2016(H1N1)GenBankKX40947KX40947KX40947KX40947KX40947KX40947KX40947KX40947A/HongKong/H090-779-V10/2009(H1N1)GenBankCY12043CY12043CY12043CY12043CY12043CY12043CY12043CY12043A/Indiana/33/2016(H1N1)GenBankKX40992KX40992KX40993KX40993KX40993KX40993KX40993KX40993A/Kyoto/13K017/2014(H1N1)GenBankLC03285LC03285LC03285LC03285LC03285LC03285LC03286LC03286A/NorthCarolina/38/2016(H1N1)GenBankKX41124KX41124KX41124KX41124KX41124KX41124KX41124KX41124A/Qingdao/FF86/2009(H1N1)GenBankKF41114KF41132KF41129KF41118KF41123KF41118KF41120KF41126A/Shanghai/Mix1/2014(H1N1)GenBankKP05849KP05849KP05849KJ94641KP05849KJ94641KP05849KP05849A/Singapore/DMS1213/2011(H1N1)GenBankKT18061KT18039KT18082KT18103KT18125KT18146KT18168KT18189A/Thailand/CU-H2548/2010(H1N1)GenBankCY08944CY08944CY08944CY08944CY08944CY08944CY08945CY08945A/Tianjinnankai/SWL413/2010(H1N1)GenBankJQ71414JQ71415JQ71416JQ71416JQ71418JQ71419JQ71419JQ71420A/turkey/Ontario/FAV-005-2/2016(H1N1)GenBankKX23247KX23247KX23247KX23247KX23247KX23247KX23248KX23248A/Fujian/1/2009(H1N1)GenBankGQ22536GQ22536GQ22536GQ22536GQ22536GQ22536GQ22536GQ22536A/Ulaanbaatar/2973/2015(H1N1)GISAIDEPI_ISL_223300(completegenome)A/Yokohama/50/2015(H1N1)GISAIDEPI_ISL_223345(completegenome)A/Vietnam/GS150925/2015(H1N1)GISAIDEPI_ISL_223347(completegenome)A/India/4051/2015(H1N1)GISAIDEPI_ISL_224289(completegenome)A/Shanghai-Putuo/1860/2015(H1N1)GISAIDEPI_ISL_211949(completegenome)

●A/California/07/2009(H1N1), ▲A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)圖1 A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)的遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the A/FujianGulou/SWL64/2016 (H1N1)

表3 A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)與疫苗株的HA蛋白糖基化位點預測比較

Tab.3 Prediction of N-glycosylation sites in the hemagglutinin (HA) proteins of A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1) and vaccine strain

SequencePositionPotentialJuryagreementN-Glycresult(Threshold=0.5)A/California/07/2009(H1N1)27NNST0.3900(8/9)-28NSTD0.7996(9/9)+++40NVTV0.7476(9/9)++104NGTC0.6786(8/9)+293NTTC0.4821(5/9)-304NTSL0.6616(9/9)++498NGTY0.5209(4/9)+557NGSL0.6833(9/9)++A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)27NNST0.3636(9/9)--28NSTA0.7791(9/9)+++40NVTV0.7512(9/9)+++104NGTC0.6428(8/9)+293NTTC0.4867(5/9)-304NTSL0.6709(9/9)++498NGTY0.5233(4/9)+557NGSL0.6833(9/9)++

2.5.2 神經氨酸酶蛋白(NA)和膜蛋白(M)氨基酸位點分析結果 與流感病毒耐藥相關的蛋白主要是離子通道蛋白(M2)和神經氨酸酶蛋白(NA)。M2蛋白僅發生了D21G突變，突變率為1.03%，與耐藥相關的第26、27、30、31和34位氨基酸[5]均未發生突變，其中跨膜區的第31位氨基酸仍為天冬酰胺(N)，提示其對金剛烷胺類藥物依然耐藥[6]。而NA蛋白的突變率較高，達3.20%。NA蛋白共發生了15處變異，分別是L40I、N44S、V67I、S82F、N200S、V241I、N248D、V264I、N270K、I321V、Y351F、N369K、T381I、N386K、K432E。與神經氨酸酶抑制劑作用位點相關的第275位氨基酸仍為組氨酸(H)，提示該流感病毒對達菲仍然敏感。此外作為未來抗病毒藥物研究方向的NP蛋白，其中的一些重要氨基酸位點，如148Y、355R、361R等[7]也未發生變化。

2.5.3 其他蛋白氨基酸位點分析結果 甲型流感病毒的其他蛋白包括PB2、PB1、PA、NP和NS蛋白。聚合酶PB2、PB1和PA共同構成RNA聚合酶復合體，而RNA聚合酶復合體與NP蛋白共同工程病毒核糖核蛋白體復合物(viral ribonucleoprotein complexes，vRNP)，參與流感病毒基因組的復制和轉錄[8]。本次研究的流感病毒PB2、PB1、PA和NP蛋白中影響病毒致病性的幾個關鍵位點均未發生改變，如PB2蛋白中仍為457L[9]、627E[10]、701D[8]和714S[11-12]；PB1蛋白中的622S、709V以及PB1-F蛋白的66N也未發生突變[13]；PA蛋白中仍表現為154E[14]、157T[15]、638R[16]。非結構蛋白NS1中與病毒復制能力相關的69L、77L[17]和與病毒毒力有關的103F、106M[18]也未發生變化。各蛋白的氨基酸位點變異情況詳見表4。

表4 A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)病毒株全基因組氨基酸位點變異情況

Tab.4 Mutations sites of amino acid on the complete genome of A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)

SegmentMutationssitesofaminoacidNo.ofmutationMutationrate(%)PB2R54KM66ID195NR293KV344MI354LS453PV731I81.05PB1G154DI397MI435TD618E40.53PAV100TP224SN321KI330VK361RR362K60.84HAD14AP83SD97NV152TK163QV173IS185TS203TD222NA256TA261SK283EI321VE374KS451NE491GE499KD501E183.28NPA22TV100IM105TL122QS498N51.00NAL40IN44SV67IS82FN200SV241IN248DV264II321V153.20N270KI321VY351FN369KT381IN386KK432EM1V80IM192VK230R31.19M2D21G11.03NS1E55KL90II123VK131EN205S52.28NS2N29ST48A21.65

3 討 論

流感病毒的抗原性、致病性和耐藥性等生物學特性對流感疫情的防控和臨床治療具有重要參考意義。分節段的單股負鏈RNA基因結構是流感病毒容易發生突變和(或)重組的分子基礎。而發生突變和(或)重組的病毒由于人群缺乏特異性免疫力而有可能在人群中暴發和流行。本文報告了1例在不明原因肺炎監測中發現的重癥流感病例，并對該病例中的甲型H1N1流感病毒進行生物學特性的研究，及時發現病毒的變異情況，對流感的防控和治療具有一定的意義。

一般認為，HA蛋白內部有4個抗原決定簇，分別是Sa(141～142、170～174、176～181)、Sb(201～212)、Ca1(183～187、220～222、252～254)和Ca2(154～159、238～239)以及Cb(87～92)[19](該參考文獻中的HA氨基酸序列包含信號肽的17個氨基酸，而本文中的序列未將信號肽計入)。若HA1區蛋白上發生4個以上氨基酸替換，且替換涉及到2個及以上抗原決定簇位點，就可以認為出現了具有流行病學意義的抗原變異株[20]。本次研究中，病毒HA蛋白的K163Q變異位于Sa抗原決定簇，S185T 變異位于Sb抗原決定簇，S203T和 D222N變異位于Ca抗原決定簇，共有4個氨基酸位點變異涉及到3個抗原位點，出現了抗原漂移現象。而HA基因的相似性只有疫苗株的96.9%，為8個基因節段之最低，HA蛋白的突變率更是達到了3.28%，這也表明該病毒的抗原性發生了一定程度的變異。

除了抗原性的變化，該病毒還可能發生了致病能力的改變。甲型H1N1流感病毒的致病力與多種因素有關，如HA裂解位點、受體結合位點、PB2蛋白的E627K和D701N突變、PA-X的長短、PB1-F2、NS1蛋白等。本次研究中PB2蛋白第627和701位氨基酸未發生突變， PA-X的長短、PB1-F2和NS1蛋白也未發現具致病力相關的突變。該病毒HA裂解位點為V338PSIQSR↓G，裂解位點仍然只有單個堿性氨基酸(R)，盡管第338位的氨基酸與疫苗株的I338PSIQSR↓G不同，但其致病性并不受影響，仍然表現為低致病性[21]。有研究顯示[22]，人類的上呼吸道主要表達α-2,6-半乳糖唾液酸(SA-α-2，6-Gal)受體，下呼吸道主要表達α-2,3-半乳糖唾液酸(SA-α-2，3-Gal)受體。人流感能特異性地結合SA-α-2，6-Gal受體，一般引起上呼吸道癥狀，癥狀較輕；而禽流感能特異性地結合SA-α-2，3-Gal受體，引起下呼吸道癥狀，體溫多在39 ℃以上，常可進展為肺炎表現，重者可發展為呼吸窘迫綜合征(ARDS)。有研究發現，位于受體結合位點的D222N突變能明顯提高病毒與SA-α-2，3-Gal受體結合的能力[23]，使流感病毒感染下呼吸道的可能性增加，進而可能加重患者的臨床癥狀[24]。本例不明原因肺炎患者為一位61歲的男性，發病時體溫最高達39.5度，伴胸悶、咳嗽、咳痰，無咯血，肺部CT顯示肺部感染、肺炎，具有明顯的下呼吸道感染特征。該患者體內分離出的病毒存在HA基因的D222N突變，這或許是患者出現肺炎癥狀的重要原因之一。

在病毒耐藥性方面，M2蛋白位于跨膜區的第31位氨基酸(N)也提示其對金剛烷胺類藥物產生耐藥，但與神經氨酸酶抑制劑作用位點相關的第275位氨基酸仍為組氨酸(H)，提示該病毒對達菲仍然敏感。這對于臨床治療具有重要的指導意義。

此外，系統進化樹分析發現A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)病毒株的8個節段基因均與2015年上海的A/ShanghaiPutuo/1860/2015(H1N1)親緣關系最近，而且該病毒出現在A/ShanghaiPutuo/1860/2015(H1N1)之后，提示該病毒可能由上海普陀的這株病毒進化而來。進一步對A/ShanghaiPutuo/1860/2015(H1N1)病毒株的HA和NA基因進行分析發現，A/ShanghaiPutuo/1860/2015(H1N1)與A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1)的變異情況非常相似，不同之處是后者的HA基因在前者的基礎上多了D14A和D222N變異，而NA基因則多了S82F變異，這也提示后者可能由前者進化而來。

在今后的流感防控工作中，我們要警惕這種抗原性和致病性都發生變化的流感病毒，加強重癥呼吸道疾病和不明原因肺炎的病例搜索，密切監測流感病毒的病原學和流行病學特征變化，及時為疫情防控和臨床治療提供科學依據。

[1] WHO. Seasonal influenza reviews[EB/OL]. (2015-06-05)[2016-08-01]. http://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/GIP_surveillance_summary_reviews_archives/en/.

[2] Yang SJ, Ren H. Lemology[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008: 62-65. (in Chinese)

楊紹基,任紅.傳染病學[M].北京:人民衛生出版社, 2008: 62-65.

[3] WHO. Sequencing primers and protocol[EB/OL]. (2009-05-12)[2016-08-01]. http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/GenomePrimers_20090512.pdf.

[4] Guo YJ, Cheng XW. Influenza virus and laboratory technique[M]. Beijing: China Three Gorges Publishing House, 1997: 187-188. (in Chinese)

郭元吉, 程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術[M].北京: 中國三峽出版社, 1997: 187-188.

[5] Bright RA, Shay DK, Shu B, et al. Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the United States[J]. Jama, 2006, 295(8): 891-894. DOI: 10.1001/jama.295.8.joc60020

[6] Suzuki H, Saito R, Masuda H, et al. Emergence of amantadine-resistant influenza A viruses: epidemiological study[J]. J Infect Chemother, 2003, 9(9): 195-200. DOI: 10.1007/s10156-003-0262-6

[7] Lejal N, Tarus B, Bouguyon E, et al. Structure-based discovery of the novel antiviral properties of naproxen against the nucleoprotein of influenza A virus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(5): 2231-2242. DOI: 10.1128/AAC.02335-12

[8] Hutchinson EC, Fodor E. Transport of the influenza virus genome from nucleus to nucleus[J]. Viruses, 2013, 5(10): 2424-2446. DOI: 10.3390/v5102424

[9] Resa-Infante P, Jorba N, Zamarreo N, et al. The host-dependent interaction of alpha-importins with influenza PB2 polymerase subunit is required for virus RNA replication.[J]. PLoS One, 2008, 3(12): 1632-1636. DOI: 10.1371/journal.pone.0003904

[10] Resa-Infante P, Gabriel G. The nuclear import machinery is a determinant of influenza virus host adaptation[J]. Bioessays, 2013, 35(1): 23-27. DOI: 10.1002/bies.201200138

[11] Gabriel G, Dauber B, Wolff T, et al. The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(51): 18590-18595. DOI: 10.1073/pnas.0507415102

[12] Gabriel G, Abram M, Keiner B, et al. Differential polymerase activity in avian and mammalian cells determines host range of influenza virus[J]. J Virol, 2007, 81(17): 9601-9604. DOI: 10.1128/JVI.00666-07

[13] Conenello GM, Tisoncik JR, Rosenzweig E, et al. A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza A virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo[J]. J Virol, 2011, 85(2): 652, 662. DOI: 10.1128/JVI.01987-10

[14] Nieto A, Del LS, Bárcena J, et al. Complex structure of the nuclear translocation signal of influenza virus polymerase PA subunit[J]. J General Virol, 1994, 75(Pt 1)(1): 29-36. DOI: 10.1099/0022-1317-75-1-29

[15] Perales B, Sanz-Ezquerro JJ, Gastaminza P, et al. The replication activity of influenza virus polymerase is linked to the capacity of the PA subunit to induce proteolysis[J]. J Virol, 2000, 74(3): 1307-1312. DOI: 10.1128/jvi.74.3.1307-1312.2000

[16] Fodor E, Mingay LJ, Crow M, et al. A single amino acid mutation in the PA subunit of the influenza virus RNA polymerase promotes the generation of defective interfering RNAs[J]. J Virol, 2003, 77(8): 5017-5020. DOI: 10.1128/JVI.77.8.5017-5020.2003

[17] Li W, Noah JW, Noah DL. Alanine substitutions within a linker region of the influenza A virus non-structural protein 1 alter its subcellular localization and attenuate virus replication[J]. J General Virol, 2011, 92(Pt 8): 1832-1842. DOI: 10.1099/vir.0.031336-0

[18] Dankar SK, Miranda E, Forbes NE, et al. Influenza A/Hong Kong/156/1997(H5N1) virus NS1 gene mutations F103L and M106I both increase IFN antagonism, virulence and cytoplasmic localization but differ in binding to RIG-I and CPSF30[J]. Virol J, 2013, 10(12): 2001-2001. DOI: 10.1186/1743-422X-10-243

[19] Manabu I, Kimihito I, Reiko Y, et al. Predicting the antigenic structure of the pandemic (H1N1) 2009 influenza virus hemagglutinin[J]. PLoS One, 2010, 5(1): e8553. DOI: 10.1371/journal.pone.0008553

[20] Wiley DC, Wilson IA. Structural identification of the antibody binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation[J]. Nature, 1981, 289: 373-378. DOI:10.1038/289373a0

[21] Yan LP, Zhou YJ, Li GX, et al. Molecular and genetic characteristics of hemagglutinin and neuraminidase genes of China 2009 pandemic swine-origin influenza A(H1N1) virus[J]. Chin J Anim Infect Dis, 2010, 18(4): 13-19. DOI: 10.3969/j.issn.1674-6422.2010.04.003 (in Chinese)

閆麗萍, 周艷君, 李國新, 等.中國流行的2009年甲型H1N1豬源流感病毒HA和 NA基因的分子和遺傳特征[J]. 中國動物傳染病學報, 2010, 18(4): 13-19.

[22] Gambaryan AS, Tuzikov AB, Piskarev VE, et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6′-sialyl (N-acetyllactosamine)[J]. Virology, 1997, 232(2): 345-350. DOI: 10.1006/viro.1997.8572

[23] Kong W, Liu L, Wang Y, et al. Hemagglutinin mutation D222N of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus alters receptor specificity without affecting virulence in mice[J]. Virus Res, 2014, 189: 79-86. DOI: 10.1016/j.virusres.2014.05.001

[24] Houng HSH, Garner J, Zhou Y, et al. Emergent 2009 influenza A(H1N1) viruses containing HA D222N mutation associated with severe clinical outcomes in the Americas[J]. J Clin Virol, 2012, 53(1): 12-15. DOI: 10.1016/j.jcv.2011.09.004

Complete genome analysis of influenza A(H1N1) pdm09 virus isolated from one case of pneumonia of unknown etiology (PUE) in Fujian Province, China

ZHANG Yan-hua1, WENG Yu-wei1,2, ZHANG Jian-ming2,3,XIU Wen-qiong1, CHEN Hong-bin1, ZHAO Lin1, HE Wen-xiang1, ZHU Ying1, XIE Jian-feng1,2, ZHENG Kui-cheng1,2

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,PriorityLaboratoryforZoonosesResearchofFujian,Fuzhou350001,China;2.SchoolofPublicHealth,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China;3.FujianInternationalTravelHealthCareCenter,Fuzhou350001,China)

To study the biological characteristics and mutations of influenza A(H1N1)pdm09 virus isolated from one case of pneumonia of unknown etiology (PUE), which would provide references for clinical treatment and disease control, the throat swab specimen from the PUE case was isolated in the Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells, and then the antigenicity, pathogenicity and drug resistance of influenza A (H1N1) pdm09 virus were analyzed after sequencing. As a result, one influenza virus strain was isolated from the specimen and named as A/FujianGulou/SWL64/2016(H1N1). The similarities of nucleotide sequences and amino acids sequences compared with the vaccine strain A/California/07/2009(H1N1) were 96.9%-98.9% and 96.7%-99.5%, respectively. Eighteen amino acids had mutated in the HA and 4 mutations, K163Q, S185T, S203T and D222N, were involved in 3 different epitopes, which indicated that the antigenic drift had occurred in the influenza virus. The D222N mutation associated with receptor binding site made the virus infect lower respiratory tract more easily. The virus was still amantadine-resistance and oseltamivir-sensitive.In conclusion, the influenza A (H1N1) pdm09 virus in this study have occurred antigenic drift and has the molecular characterization of causing severe pneumonia, so further surveillance should be performed to prevent and control the influenza epidemic.

pneumonia of unknown etiology (PUE); influenza A(H1N1)pdm09 virus; characteristics of complete genome

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.007

謝劍鋒，Email: xjf417@163.com

1.福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病研究重點實驗室，福州 350001； 2.福建醫科大學公共衛生學院，福州 350108 3.福建省國際旅行衛生保健中心，福州 350001

R373.1

A

1002-2694(2017)03-0228-08

2016-08-08 編輯：張智芳 林 丹

福建省自然科學基金(No. 2015J01152)；福建省醫學創新課題(No. 2014-CX-9)資助；福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目(No. 2015-ZQN-ZD-10)