2014年長沙市禽類場所環境H9N2亞型禽流感病毒分子流行特征分析

張如勝，姚 棟，葉 文，陳靜芳，黃 政，劉曉蕾，陳田木，歐新華，孫邊成

2014年長沙市禽類場所環境H9N2亞型禽流感病毒分子流行特征分析

張如勝，姚 棟，葉 文，陳靜芳，黃 政，劉曉蕾，陳田木，歐新華，孫邊成

目的 了解2014年長沙市禽類場所環境中H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)血凝素(Hemagglutinin, HA)、神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)和非結構蛋白(ron-structural, NS)基因的分子進化特征，為人感染H9N2亞型AIV防控提供實驗室科學證據支持。方法 對2014年長沙市禽類場所中采集的501份環境標本(禽類飲水263份，污水221份，其他標本17份)利用real-time PCR方法進行A型、H5、H7和H9亞型流感病毒核酸檢測，然后對單獨H9陽性標本利用HA和NA基因通用引物進行RT-PCR擴增和核苷酸測序，病毒HA、NA及NS基因測序結果在線BLAST分析，利用Bioedit和Mega5軟件進行氨基酸比對和進化樹構建。結果 從501份環境標本中檢出A型AIV核酸陽性標本350份，H9亞型核酸陽性標本191份，占總標本數量的38.12%，H5亞型核酸陽性標本177份(35.33%)，H7亞型核酸陽性11份(2.20%)，H5和H9亞型混合核酸陽性標本68份(13.57%)。部分單獨H9亞型核酸陽性標本經RT-PCR和核苷酸測序鑒定出陽性H9N2亞型病毒核酸標本23份，分子進化分析表明2014年長沙市禽類場所環境中的絕大部分H9N2亞型AIV HA、NA、NS基因來源于A/Chicken/Shanghai/F/98 (F98)類似株病毒，屬于新的S基因型，HA蛋白受體結合位點(Receptor binding site，RBS)第235位(對應H3流感第226位)氨基酸為Leu(L)，表現為特異性結合人流感病毒受體特征，病毒HA、NA及NS蛋白關鍵分子位點表現為低致病性的分子特征。結論 2014年長沙市禽類場所環境中H9亞型AIV核酸陽性率最高，H9N2亞型AIV的HA、NA和NS基因表現為低致病性的分子特征，但具有容易感染人類的特征，需要進一步加強監測。

禽類場所；環境；禽流感病毒；H9N2亞型；基因；進化分析

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正粘病毒科A型流感病毒屬。根據流感病毒表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分為18個HA亞型(H1-H18)和11個NA亞型(N1-N11)[1-2]。AIV除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動物。近年來，部分AIV亞型突破種間屏障，造成人類感染，如H5N1、H5N2、H6N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9、H10N8和H5N6亞型AIV[3-13]。截至2017年2月22日，全球共報告22例人感染H9N2亞型AIV病例[14]，其中21例發生在中國大陸和香港地區(廣東12例，香港5例，湖南2例，安徽2例)，1例發生在孟加拉國，病例年齡7月-86歲不等，13例為女性，9例為男性，以兒童為主，其中5歲以下兒童占68.1%(15例)，病例臨床表現以呼吸道癥狀為主，大多表現為輕癥，無死亡病例；流行病學調查顯示病例大多有禽類接觸史。研究[12,15]表明中國大陸首次報道的人感染新型重配H7N9和H10N8亞型AIV病毒，其內部基因均來自于H9N2亞型AIV。

AIV的致病性與病毒的基因特征相關。AIV基因組由8個基因節段(PB2: RNA polymerase basic subunit 2；PB1: RNA polymerase basic subunit 1；PA: RNA polymerase acidic subunit；HA: haemagglutinin；NP: nucleoprotein；NA: neuraminidase；M: matrix gene；NS: non-structural gene)組成，其中節段4編碼的HA蛋白，具有抗原性，除了能對A型流感病毒HA亞型進行區分外，還在感染宿主和增加致病力方面起重要作用，其HA1和HA2連接肽處編碼堿性氨基酸的多少與病毒的致病性相關[16]，且HA蛋白編碼氨基酸第226-228位點(H3亞型流感病毒氨基酸位點)為特異性受體結合區域，如為Gln-Ser-Gly(QSG)則表現為特異性結合AIV受體-唾液酸A-2,3半乳糖(SA-2,3-Gal)，Leu-Ser-Ser(LSS)則表現為對人流感病毒受體-唾液酸A-2,6半乳糖(SA-2,6-Gal)親和[17-18]。節段6編碼的NA蛋白氨基酸[19]出現69-73位點缺失則表明該病毒在小鼠體內的毒力明顯增加。節段8編碼NS1和NS2蛋白，其中NS1蛋白編碼氨基酸的第42位出現P42S突變及其末端結構編碼氨基酸的第218-230位出現缺失，分別與病毒在小鼠體內的毒力增強和減輕相關[20-21]。

黃一偉等[22]報道了1例H9N2亞型AIV輕癥病例，該病例AIV病毒分離株基因特征為禽源，與禽類市場環境中分離到的H9N2亞型AIV病毒高度相似(98.5～99.8%)，其感染來源為與病例有流行病學關聯的活禽市場。近年來研究[23-25]也表明活禽市場為人感染H5N1、H7N9和H10N8亞型AIV的重要感染來源，研究[26]顯示長沙市禽類場所環境中H5N1亞型禽流感病毒核酸陽性率較高，存在傳播AIV的風險。為此，本研究對2014年長沙市禽類場所環境中監測到的H9N2亞型AIV HA、NA及NS基因進行測序和基因特性分析，對陽性基因中與致病性相關的氨基酸變異和分子遺傳(Phylogenetic)等分子特征進行探討，為人感染H9N2亞型AIV疫情防控提供科學數據支持。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 7300 Real-time RT-PCR System購于美國AB Applied Biosystems公司，MycyclerTMthermal cycler購于美國BIO-RAD公司，Centrifuge 5430R購于德國eppendorf公司，PowerpacTM Universal購于美國BIO-RAD公司，SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq購于美國Life Technologies公司，SuperScript○RIII Platinum○ROne-Step Quantitative RT-PCR System購于美國Life Technologies公司，Rneasy○RMini Kit購于德國QIAGEN公司。

1.2 禽類場所環境標本H9亞型AIV核酸檢測 按照中國疾病預防控制中心下發的《職業暴露人群血清學和環境高致病性禽流感監測方案》(2011年版)要求，采集2014年長沙市轄區禽類場所環境標本501份(禽類飲水263份、禽類污水221份、其他標本17份)，利用real-time RT-PCR方法進行A型及H5、H7、H9亞型流感病毒核酸檢測，核酸提取、檢測步驟及結果判斷按照《全國流感監測方案(2010年版)》進行[27-28]，檢測用real-time RT-PCR引物和探針序列來源于中國國家流感中心(Chinese National Influenza Center，CNIC)[29-30]，引物及探針由上海Invitrogen公司合成。

1.3 H9N2亞型AIV HA、NA及NS基因擴增及核苷酸序列測定 將在2014年長沙市禽類場所環境中監測到的H9亞型AIV陽性標本(禽類污水、禽類飲水共23份，排除H5和H7亞型AIV核酸陽性)利用Rneasy○RMini Kit (德國QIAGEN 公司)進行RNA核酸提取(提取步驟參照試劑盒說明書進行)，提取的RNA利用SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq RT-PCR(Life Technologies 公司)對HA和NA基因片段分別進行RT-PCR核酸擴增，反應體積(25 μL)：RNase Free Water 6.0 μL；2×PCR反應緩沖液12.5 μL；Platinum@Taq酶混合液1．0 μL；20 μmol/L引物(Bm-HA-1、Bm-NS-890R; Ba-NA-1、Ba-NA-1413R，引物序列來源于文獻[31]，見表1)各0.25 μL；RNA模板5.0 μL。HA和NA基因預期擴增片段長度分別為1 778 bp和1 413 bp，其中HA基因擴增能同時擴增出NS片段，預期片段長度為890 bp。擴增反應條件：60 ℃ 60 min；94 ℃ 2 min；再按94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 7 min 循環40 次，68 ℃ 7 min。分別取擴增后的HA和NA基因片段RT-PCR產物10 μL，在瓊脂糖凝膠中90 v 40 min電泳后成像，觀察有無預期目的片段。如有預期目的片段，將PCR產物TA克隆后進行核苷酸序列測定，TA克隆測序由上海Life Technologies 公司利用ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer測序儀和BigDye○RTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit測序試劑完成核苷酸序列測定，正、反兩方向測序，測通。

1.4 環境中H9N2亞型AIV HA、NA及NS基因進化分析 長沙市禽類場所環境中H9N2亞型AIV病毒HA、NA及NS基因測序結果利用BioEdit軟件拼接后提交至美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，利用在線基本局部相似性搜索工具(Basic local alignment search tool, BLAST)進行同源性分析(http：//BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)。從NCBI 流感病毒資源庫(Influenza Virus Resource，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi)下載長沙市禽類場所環境中H9N2亞型AIV、國內H9N2亞型AIV及G1(A/Quail/Hong Kong/G1/97)、Y280(A/duck/Hong Kong/Y280/97)、Y439(A/duck/Hong Kong/Y439/1997)、F98(A/Chicken/Shanghai/F/98)和BJ/1/94(A/Chicken/Beijing/1/94)等譜系代表株HA、NA及NS基因片段核苷酸序列，利用MEGA 5軟件的Neighbor-joining方法和Tamura-Nei 模式構建進化樹。

表1 H9N2亞型禽流感病毒測序引物序列

Tab.1 Sequences of sequencing primers for H9N2 virus

PrimerSeguence(5'→3')Bm-HA-1TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAG-CAGGGGBm-NS-890RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAA-CAAGGGTGTTTTBa-NA-1TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAG-CAGGAGTBa-NA-1413RATATGGTCTCGTATTAGTAGAAA-CAAGGAGTTTTTT

1.5 環境中H9N2亞型AIV HA、NA及NS基因關鍵位點分析 選擇并從NCBI流感病毒資源庫中下載人感染H9N2亞型病毒湖南株A/Lengshuitan/11197/2013 (LST/11197)、H9N2亞型AIV各譜系代表株(G1、Y280、Y439、F98、BJ/1/94)和H5N1亞型AIV A/duck/Guangxi/xa/2001(GX/xa)HA、NA及NS基因片段編碼氨基酸序列，利用BioEdit軟件將上述AIV和本研究中的環境H9N2亞型AIV進行多重比對、分析各基因關鍵位點分子特征。

2 結 果

2.1 禽類場所環境標本各基因相關檢測結果 對2014年長沙市禽類場所環境中采集到的501份禽類飲水(263份)、污水(221份)和其他(17份)標本進行AIV病毒核酸檢測，共檢出A型病毒核酸陽性標本350份，其中主要A型病毒核酸亞型為H9和H5， H9亞型核酸陽性標本191份，占總標本的38.12%， H5亞型核酸陽性標本177份(35.33%)，H7亞型核酸陽性11份(2.20%)，H5和H9亞型混合核酸陽性標本68份(13.57%)；263份禽類飲水標本中H9和H5亞型核酸檢出率分別為50.19%和32.70%，221份污水標本中H9和H5亞型核酸檢出率分別為25.34%和39.37%，具體結果見表2。

表2 長沙市禽類場所環境標本AIV real-time RT-PCR檢測結果分析

Tab.2 Prevalence of AIV in specimens collected from poultry markets in Changsha City, Hunan Province, China, determined by real-time RT-PCR

No.ofpositivesamplesanddetectionrate(%)fortypeandsubtypesSampleNo.ofsamplesAH9H5H7H5,H9H5,H7H7,H9H5,H7,H9Othersubtypesdrinkingwater263216(82.13%)132(50.19%)86(32.70%)8(3.04%)33(12.55%)5(1.90%)2(0.76%)1(0.38%)8(3.04%)sewage221126(57.01%)56(25.34%)87(39.37%)3(1.36%)34(15.38%)1(0.45%)1(0.45%)0(0%)20(9.05%)others178(47.06%)3(17.65%)4(23.53%)0(0%)1(5.88%)0(0%)0(0%)0(0%)0(0%)Total501350(69.86%)191(38.12%)177(35.33%)11(2.20%)68(13.57%)6(1.20%)3(0.60%)1(0.20%)28(5.59%)

2.2 H9N2亞型AIV核苷酸序列測定結果 從H9亞型核酸陽性標本中篩選出23份(H5、H7亞型AIV核酸均為陰性)，通過HA和NA基因通用引物(其中HA基因擴增引物能夠同時擴增出NS基因片段)RT-PCR擴增和TA克隆核苷酸序列測定，成功獲得58條基因序列。其中HA和NA基因序列分別為23條，NS序列為12條，各基因序列已上傳至NCBI，GenBank登錄號為：KX247857-KX247914。其中H9N2亞型AIV HA基因核苷酸序列全長1 683 bp，NA基因核苷酸序列全長1 401 bp，NS基因核苷酸序列全長883 bp。在線BLAST相似性比對分析表明：23條HA基因序列分別與來源于湖南、河南、江西、江蘇、北京和青島等省市環境及雞H9N2、H9亞型AIV分離株HA基因高度相似(≥98.63%)；22條H9N2亞型AIV NA基因序列分別與來源于湖南、江蘇、江西、北京、東莞和深圳等省市環境及雞H9N2亞型AIV分離株NA基因高度相似(≥98.07%), 1條H9N2亞型AIV(A/environment/Changsha/369/2014(H9N2))NA基因序列與來源于蒙古麻鴨H11N2亞型AIV分離株(A/ruddy shelduck/Mongolia/590C2/2009(H11N2))NA基因高度相似(97.94%)；7條NS基因序列分別與武漢和溫州等地雞源H9N2亞型AIV分離株NS基因高度相似(≥98.98%)，5條NS基因序列分別與安徽、無錫、溫州等省市人、雞和鴨H7N9亞型AIV分離株NS基因高度相似(≥99.09%)；HA和NA基因BLAST結果表明上述23份環境標本中存在的病毒為H9N2亞型AIV，具體病毒名稱及其BLAST比對結果見表3。

2.3 H9N2亞型AIV進化樹構建 H9N2 亞型AIV在世界范圍內廣泛分布，在遺傳進化上可以分為北美和歐亞譜系兩大分支，其中歐亞系又進一步衍生出以Y280、G1、Y439、F98以及BJ/1/94等為代表的病毒系進化分支[32-33]。HA基因進化樹構建出Y280、G1和Y439三個譜系進化分支，其中本研究中的23株H9N2亞型AIV、國內H9N2亞型AIV HA基因聚集在一個亞分支內，Y280、F98和CK/BJ/1譜系代表株HA基因聚集在另一個亞分支內，兩個亞分支共同構成Y280譜系進化分支[22]，本研究中的23株H9N2病毒與Y280譜系代表株進化距離近；NA進化樹顯示本研究中的23株環境H9N2亞型AIV有22株病毒聚集在一個單獨進化分支內，與Y280、F98譜系代表株及H9N2亞型人源湖南株LST/11197進化距離近，而本研究中的另外1株病毒CS/369位于Y439譜系；NS基因進化樹顯示，本研究中的12株H9N2亞型AIV NS基因全部聚集在F98譜系，但分別形成3個亞分支，見圖1。

表3 長沙市禽類場所環境23株H9N2亞型病毒BLAST相似性分析

Tab.3 Comparisons of twenty-three H9N2 viruses from Changsha City with isolates in GenBank of highest nucleotide identity (%) (The date of this BLAST search was Feb 27, 2016)

VirusHANucleotideidentityofH9N2virus(%)NANucleotideidentityofH9N2virus(%)NSNucleotideidentityofH9N2virus(%)CS/92A/chicken/Beijing/0331/2013(99.17%)A/chicken/Jiangsu/JS86/2013(99.13%)A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(98.98%)CS/94A/chicken/Jiangxi/29075/2013(99.58%)A/chicken/Jiangxi/29075/2013(99.71%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.66%)CS/219A/environment/Hunan/27420/2014(99.94%)A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.93%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.09%)CS/250A/environment/Hunan/28028/2014(99.23%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.79%)A/Anhui/DEWH72-09/2013b(99.55%)CS/279A/environment/Hunan/28034/2014(99.58%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.64%)A/duck/Wuxi/0405006/2013b(99.09%)CS/334A/environment/Hunan/27420/2014(98.87%)A/chicken/Jiangsu/YZLH3/2013(99.07%)NosequenceCS/341A/chicken/Beijing/1115/2013(99.23%)A/chicken/Jiangxi/20482/2013(99.14%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.66%)CS/347A/environment/Hunan/28034/2014(99.47%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.71%)NosequenceCS/360A/environment/Hunan/27420/2014(99.52%)A/chicken/Beijing/0512/2013(99.00%)NosequenceCS/366A/environment/Hunan/27420/2014(99.47%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.57%)NosequenceCS/368A/environment/Hunan/27420/2014(99.58%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.50%)NosequenceCS/369A/environment/Hunan/27420/2014(99.47%)A/ruddyshelduck/Mongolia/590C2/2009a(97.94%)NosequenceCS/372A/chicken/Qingdao/013/2014(98.63%)A/chicken/Jiangxi/20478/2013(99.29%)NosequenceCS/400A/chicken/Henan/SH01/2015(99.52%)A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.64%)NosequenceCS/408A/environment/Hunan/27420/2014(99.23%)(A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.50%)NosequenceCS/418A/environment/Hunan/27420/2014(99.70%)(A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.07%)A/chicken/Wenzhou/RAQL18/2015b(99.09%)CS/450A/chicken/Jiangsu/J3156/2014(99.05%)A/chicken/Jiangxi/20482/2013(99.21%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.21%)CS/451A/environment/Hunan/27420/2014(99.41%)A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.36%)NosequenceCS/462A/chicken/Henan/SH01/2015(99.34%)A/chicken/Dongguan/1674/2014(99.57%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.21%)CS/478A/chicken/Henan/SH01/2015(99.28%)A/chicken/Jiangxi/29117/2013(98.93%)A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015(99.21%)CS/481A/environment/Hunan/27420/2014(99.41%)A/environment/Hunan/28034/2014(99.29%)NosequenceCS/484A/chicken/Jiangsu/J3294/2014(99.35%)A/chicken/Shenzhen/1949/2013(98.07%)A/duck/Wuxi/0405006/2013b(99.21%)CS/490A/environment/Hunan/27420/2014(99.17%)A/chicken/Jiangxi/29117/2013(98.86%)(A/duck/Wuxi/0405006/2013b(99.32%)

Note: CS/92: A/environment/Changsha/92/2014; CS/94: A/environment/Changsha/94/2014; CS/219: A/environment/Changsha/219/2014; CS/250: A/environment/Changsha/250/2014; CS/279: A/environment/Changsha/279/2014; CS/334: A/environment/Changsha/334/2014; CS/341: A/environment/Changsha/341/2014; CS/347: A/environment/Changsha/347/2014; CS/360: A/environment/Changsha/360/2014; CS/366: A/environment/Changsha/366/2014; CS/368: A/environment/Changsha/368/2014; CS/369: A/environment/Changsha/369/2014; CS/372: A/environment/Changsha/372/2014; CS/400: A/environment/Changsha/400/2014; CS/408: A/environment/Changsha/408/2014; CS/418: A/environment/Changsha/418/2014; CS/450: A/environment/Changsha/450/2014; CS/451: A/environment/Changsha/451/2014; CS/462: A/environment/Changsha/462/2014; CS/478: A/environment/Changsha/478/2014; CS/481: A/environment/Changsha/481/2014; CS/484: A/environment/Changsha/484/2014; CS/490: A/environment/Changsha/490/2014; a: H11N2; b: H7N9.

The sequence of the H9N2 virus in our study is marked by ▲, and the sequences of representative H9N2. Viruses of G1, Y280, Y439, BJ/1/94 and F98 lineages from GenBank are marked by ●.

>圖1 2014年長沙市禽類場所環境H9N2亞型AIV HA(a)、NA(b)及NS(c)基因進化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis of the HA (a), NA(b) and NS(c) genes of the influenza H9N2 viruses isolated from poultry markets in Changsha, China in 2014

2.3.1 H9N2亞型AIV HA、NA及NS基因關鍵位點分析 本研究中的23株H9N2亞型AIV HA基因HA1和HA2 蛋白連接肽(335-341 位點)出現2個堿性氨基酸(SRSSRGL，其中R為堿性氨基酸)，與其他H9N2亞型AIV譜系代表株HA基因致病特征相似，對禽表現為低致病性特征，與H5N1亞型高致病性AIV具有多個堿性氨基酸的高致病性分子特征不同[16]，見表4。

本研究中的23株H9N2亞型AIV HA 蛋白第235～237位(對應H3型流感病毒編碼氨基酸第226-228位)氨基酸為LMG，表明其受體為人源流感病毒特異性受體[17]，與人源H9N2亞型AIV湖南株LST/11197及其他不同譜系H9N2亞型AIV代表株HA基因特征相似，具有容易感染人的受體特征，見表4。

本研究中的1株H9N2亞型AIV CS/369 NA基因編碼氨基酸第63～64位點為NR氨基酸，與G1、Y439和BJ/1/94譜系代表株病毒NA基因特征相似，但本研究中的另外22株H9N2亞型AIV NA基因編碼氨基酸第63-64位點出現缺失，與Y280和F98譜系代表株病毒相似，見表4。

本研究中的12株H9N2亞型AIV與其他不同譜系代表株NS1蛋白全長編碼217個氨基酸，相比H5N1亞型AIV GX/xa，表4中的H9N2亞型AIV第80-84位氨基酸(TIASV)均未發生缺失現象，但本研究中的12株H9N2亞型AIV及1株人源H9N2亞型AIV湖南株LST/11197缺失第218-230位氨基酸，導致了病毒致死性相關PL基序(ESEV/EPEV)的缺失，見表4。本研究中的12株H9N2亞型AIV NS1編碼蛋白第92位氨基酸均為D，未出現D92E突變，不同于G1譜系代表株NS1蛋白出現D92E氨基酸突變，見表4。

表4 長沙市H9N2亞型AIV與參考株病毒HA、NA及NS1蛋白關鍵位點特征分析

Tab.4 Analysis of the important amino acids of the HA, NA and NS1 proteins of H9N2 AIV strain from Changsha City with reference strains

VirusHANANS1Cleavagesite335-341Receptorbindingsite235-23763-64Totalofno.ofaaDeletionofaa80-8492CS/92SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/94SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/219SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/250SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/279SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/334SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/341SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/347SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/360SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/366SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/368SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/369SRSSRGLLMGNRNosequenceNosequenceNosequenceCS/372SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/400SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/408SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/418SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/450SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/451SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/462SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/478SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/481SRSSRGLLMGDeletionNosequenceNosequenceNosequenceCS/484SRSSRGLLMGDeletion217NODCS/490SRSSRGLLMGDeletion217NODLST/11197SRSSRGLLMGDeletion217NODG1ARSSRGLLQGNR218NOEY280ARSSRGLLQGDeletion218NODY439AASNRGLQQGNR218NODF98ARSSRGLQQGDeletion217NODBJ/1/94ARSSRGLQQGNR217NODGX/xaRERRRKRGLQSGIR225YESD

Note: Substitutions of particular concern are shown in bold.

3 討 論

H9N2亞型AIV在中國及東亞地區雞群中廣泛流行，其中Y280譜系病毒在中國中南部流行最為廣泛[34-35]，H9N2病毒同時也是活禽市場中最常見的AIV，研究[22]顯示與人感染H9N2亞型AIV病例有流行病學關聯的湖南省永州市活禽市場中H9亞型AIV核酸陽性率最高(18%)，其他研究[36]顯示廣西地區活禽市場低致病性AIV具有相似的陽性率10.8%(336/3 121)。同時人感染H7N9、H10N8、H5N6、H9N2等[22-25]亞型AIV疫情流行病學調查已證實禽類場所，特別是活禽市場已經成為人感染AIV的重要來源，CNIC每年都在開展禽類場所AIV日常監測工作，監測禽類場所環境中的不同亞型AIV污染情況，本研究結果顯示2014年長沙市禽類場所環境中H9亞型AIV核酸陽性率最高(38.12%)，高于H5亞型AIV核酸陽性率(35.33%)，并且高于其他研究報道[23,37]，原因可能與標本種類有關，本研究中的標本種類主要為禽類飲水和污水,這兩類標本分別用于禽類的飲用水和禽類宰殺后的清洗用水，聚集了禽類口腔和內臟器官的AIV，造成了AIV核酸檢出率的升高。

研究對2007-2013年中國東部地區分離的H9N2病毒基因進化分析顯示出現六個不同的基因型，其中的一個新基因型(S)，以F98譜系代表株病毒為骨架，通過與G1譜系代表株病毒的PB2和M基因重配而成[37]。HA及NA進化樹分析顯示本研究中的H9N2亞型AIV與國內2013年以后分離的部分H9N2亞型AIV HA、NA基因聚集在一個單獨的亞分支內，但與Y280及F98譜系代表株同屬于一個大的進化分支；由于本研究中的H9N2病毒CS/369與H11N2亞型AIV分離株(A/ruddy shelduck/Mongolia/590C2/2009)NA基因核苷酸序列高度相似(97.94%)，導致CS/369病毒與Y439譜系代表株進化距離近，屬于Y439譜系；NS基因進化樹顯示本研究中的12株H9N2亞型AIV病毒NS基因全部聚集在F98譜系，但分別形成3個亞分支，與本研究中的NS基因分別來源于H9N2和H7N9亞型AIV相關。進化表明長沙市禽類場所環境中的絕大部分H9N2亞型AIV HA、NA、NS基因來源于F98 類似株病毒，屬于新的S基因型，并且隨著時間的推移，已經開始進化形成新的分支，需要引起關注。另外HA及NA基因進化分析還顯示本研究中的環境H9N2亞型AIV與人源H9N2亞型AIV湖南株LST/11197位于同一分支，且進化距離近，進一步證實了活禽市場是人感染H9N2亞型AIV的重要來源[22]。

流感病毒在感染宿主細胞時，HA蛋白需要蛋白酶將其裂解為HA1和HA2，然后才能吸附到宿主細胞膜上。H7N9、H10N8和H9N2等低致病性AIV在HA1和HA2連接肽區域只有一個堿性氨基酸，只能被局限在有R蛋白酶表達的粘膜表面和組織中進行復制，感染后癥狀較輕。而H5N1，H5N6等高致病性AIV在HA1和HA2連接肽區域有4個以上堿性氨基酸，故能被廣泛分布在全身各組織和器官的蛋白酶所識別并裂解，造成全身感染，故流感病毒HA蛋白的HA1和HA2連接肽位點堿性氨基酸數目的多少與病毒的致病性密切相關。本研究中的2014年長沙市禽類場所環境中H9N2亞型AIV HA基因HA1和HA2蛋白連接肽位點出現2個堿性氨基酸，與其他H9N2亞型AIV譜系代表株HA基因致病特征相似，對禽表現為低致病性基因特征[16]。流感病毒HA蛋白還起識別宿主細胞受體的作用，其第226～228位氨基酸為QSG，表明其對AIV受體-SA-2,3-Gal親和，如為LSS序列，則對人流感病毒受體-SA-2,6-Gal親和[38]。研究報道近年來國內流行的H9N2病毒HA蛋白RBS區域幾乎均突變為L226，并且多數具有與SA-2,6-Gal結合的能力[39]，有研究還證實含L226的H9N2亞型AIV能夠在人的氣管上皮細胞中進行有效的復制[40]。本研究中的H9N2亞型AIV HA基因RBS區域為L226，表現為人源流感病毒受體，具有與SA-2,6-Gal結合的能力，容易造成人類感染。目前報道的22例人感染H9N2亞型AIV病例絕大多數表現為輕癥，表明更多的H9N2亞型AIV輕癥和無癥狀攜帶者尚未被發現，這種溫和的感染使得H9N2亞型AIV能夠進一步在人體內適應并有可能與其他人流感病毒發生基因重組而具備造成流感流行的潛力。

本研究中的絕大部分H9N2亞型AIV NA基因蛋白第63-64位氨基酸出現缺失，僅1株H9N2亞型AIV CS/369第63-64位氨基酸未發生缺失，表現為NR，證實了H9N2亞型AIV NA基因來源的多樣性。研究表明H9N2亞型AIV NS1蛋白編碼氨基酸發生D92E突變，具有提高H9N2亞型AIV感染人類的能力，本研究中的12株H9N2病毒的NS1蛋白未發生D92E突變，且缺失了與病毒致死性相關的PL基序(ESEV/EPEV), 該缺失可以減輕病毒對小鼠的致病能力[21]，與本地區環境中的其他H9N2亞型AIV NS1蛋白編碼氨基酸相似，具有低致病性流感病毒的分子特征[41]。然而，研究顯示不同譜系的H9亞型病毒的內部基因在哺乳動物和人體細胞模型中都具備復制能力[42]，表明H9N2亞型AIV的內部基因仍然有潛力為產生新的流行株病毒提供部分甚至整套內部基因，譬如新型H7N9和H5N1亞型病毒。

目前，國內不斷新增人感染H9N2亞型AIV病例報告，且禽類市場活禽銷售模式未改變、禽類場所環境中H9N2亞型AIV污染狀況未進一步減輕的情況下，需要密切監測禽類場所環境中H9N2亞型AIV病毒進化狀況，及時評估、預警H9N2亞型AIV感染人類的潛在風險。

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Molecular epidemiological characteristics of avian influenza A(H9N2) viruses from environment in poultry markets in Changsha, China, 2014

ZHANG Ru-sheng, YAO Dong, YE Wen, CHEN Jing-fang, HUANG Zheng, LIU Xiao-lei, CHEN Tian-mu, OU Xin-hua, SUN Bian-cheng

(ChangshaCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410004,China)

We analyzed the evolutional and molecular characteristics of Hemagglutinin(HA), Neuraminidase(NA) and non-structural(NS) genes of avian influenza A(H9n2) viruses from environment in poultry markets in Changsha, China, 2014, providing laboratory data for prevention and control of human infection with avian influenza A(H9N2) virus. Five hundred and one specimens (263 poultry drinking water specimens, 226 poultry sewage specimens and 17 others specimens) were collected from environment in poultry markets in Changsha, 2014, and real-time RT-PCR was used for influenza A typing and subtyping (H5, H7 and H9) detection. HA and NA universal primer sets for conventional RT-PCR and sequencing were used for the positivity of single H9. The sequence homology of HA, NA and NS genes of the viruses were analyzed with the online Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). The ClustalW multiple alignments of amino acids and the phylogenetic trees for HA, NA and NS genes were constructed using the BioEdit and MEGA 5 software, respectively. Results showed that among 501 environmental samples, 350 samples were positive for influenza A virus, 191 (38.12%) for H9 subtype, 177 (35.33%) for H5 subtype, 11 (2.20%) for H7 subtype and 68 (13.57%) for H5 and H9 subtypes co-detection. Twenty-three H9N2 subtype AIV were confirmed by conventional RT-PCR and sequencing from the samples of the positivity of single H9. Phylogenetic analysis revealed that most of HA, NA and NS genes of the H9N2 subtype AIV isolated in Changsha City had gene constellations of genotype S,and these virues might have acquired their HA, NA and NS from A/Chicken/Shanghai/F/1998-like (H9N2). L235 (correspond to H3 numbering 226) of the HA protein of the receptor binding site (RBS) were found in these H9N2 viruses, and the characteristics was shown to be associated with increased affinity of HA to the glycan-receptors of human influenza virus, and the low pathogenicity molecular characteristics of HA, NA and NS genes were showed in these viruses. The positive rate of nucleic acid of the H9 subtype of avian influenza virus from environment was the highest in poultry markets in Changsha, 2014, and molecular characteristics of the HA, NA and NS of these H9N2 subtype AIV showed low pathogenicity, but that may facilitate human infection. So, the prevalence and genetic evolution of this virus should be closely monitored.

poultry markets; environment; avian influenza virus; H9N2 subtype; gene; phylogenetic analysis Supported by the Hunan Provincial Health Medicine Research Project (No. B2015-153) Corresponding author: Sun Bian-cheng, Email: sunbiancheng2013@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.005

孫邊成，Email: sunbiancheng2013@163.com

長沙市疾病預防控制中心，長沙 410004

R373.1+3

A

1002-2694(2017)03-0212-10

2017-02-09 編輯：林丹

湖南省衛生計生委2015年度科研計劃項目(No.B2015-153)