高效液相色譜法測定辣椒中的辣椒堿類成分

袁麗麗，王海翔，洪桑桑，王歲樓

（中國藥科大學，江蘇南京 211198）

高效液相色譜法測定辣椒中的辣椒堿類成分

袁麗麗，王海翔，洪桑桑，*王歲樓

（中國藥科大學，江蘇南京 211198）

建立了高效液相色譜法同時測定辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的方法。采用Ultimate AQ-C18型色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相為水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長280 nm。辣椒堿和二氫辣椒堿在0.001~0.150 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好（R2=0.999 9）；加樣回收率均值分別為99.35%和98.26%，RSD分別為0.82%和0.73%（n=9）；穩定性試驗RSD為0.27%；中間精密度RSD低于3.79%（n=18）。該法準確度高、重現性好，能快速測定辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量。

高效液相色譜法；辣椒堿；二氫辣椒堿；辣椒

辣椒，又名番椒、辣子等，是一種藥食同源的茄科植物。除了作為蔬菜和調味品外，其果實和根莖可入藥，具有溫中散熱、健胃消食之功效[1]。辣椒中含有脂肪、維生素、蛋白質、生物堿等多種成分[2]，VC含量居蔬菜之首，具有較高的營養價值。辣椒堿類化合物是辣椒果實中產生辛辣味道的主要成分，是一類同源的香草酰胺類生物堿，主要有辣椒堿（CA）、二氫辣椒堿（DC）、降二氫辣椒堿（NDC）、高辣椒堿（HC）和高二氫辣椒堿（HDC）等。其中，辣椒堿占46%~77%，二氫辣椒堿占21%~ 40%，二者占90%以上[3]，是辣椒品質的重要指標。辣椒堿亦是辣椒中主要活性成分，因具有鎮痛、抗腫瘤、保護心血管、減肥等藥理作用[4-7]，使其在醫藥領域的應用得到廣泛關注。美國醫學會將其作為臨床上治療皰疹后神經痛、糖尿病性神經痛的首選藥物。除此之外，辣椒堿還可用來制作生化農藥、軍事上的催淚彈等，具有廣泛用途。

試驗采用超聲輔助提取法對辣椒粉樣品進行處理，以辣椒堿和二氫辣椒堿為對照品，建立了高效液相色譜法同時檢測兩者的含量，并進行了方法學驗證。結果表明，該法專屬性強、準確度高、精密度良好，能很好地檢測辣椒粉中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、可變波長紫外檢測器和Chromeleon 7工作站），美國Dionex公司產品；DV215CD型電子天平，美國OHAUS公司產品。

1.2 試劑

辣椒堿對照品（批號10L046，含量94.1%）、二氫辣椒堿對照品（批號X1800010，含量98.98%），上海安譜實驗科技股份有限公司產品；辣椒粉，興化市盛華食品有限公司產品；甲醇（色譜純），上海星可高純化學試劑有限公司產品；純凈水，杭州娃哈哈集團產品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18型色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相：水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測波長280 nm。

2.2 溶液配制

（1）對照品溶液。精密稱取辣椒堿和二氫辣椒堿對照品約10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻，作為對照品母液；精密量取對照品母液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，搖勻，制成每1 mL約含0.1 mg CA和DC的對照品溶液。

（2）樣品溶液。稱取辣椒粉約2.0 g，置于250 mL燒杯中，加入甲醇30 mL，于室溫下超聲提取2次，每次20 min；合并提取液，濃縮至干，用90%甲醇水溶解定容至10.0 mL；精密量取該溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀釋定容，作為樣品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

精密量取空白溶劑、對照品溶液、樣品溶液各20 μL，按照2.1項中色譜條件進行測定，記錄色譜圖。空白溶劑和樣品溶液中的雜質對CA峰和DC峰無干擾。

空白溶劑（a）、對照品溶液（b） 和樣品溶液（c）色譜見圖1。

2.3.2 線性關系考察

取CA和DC對照品約10 mg，精密稱量，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品母液；精密量取該溶液10，50，100，300，600，900，1 200，1 500 μL，分別置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀釋定容，制成系列質量濃度的標準溶液。精密吸取上述標準溶液各20 μL，按照2.1項中色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為YCA=198.76X-0.063 1（R2= 0.999 9），YDC=204.22X-0.099 5（R2=0.999 9），結果表明，CA和DC在0.001~0.150 mg/mL范圍內峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

圖1 空白溶劑（a）、對照品溶液（b）和樣品溶液（c）色譜

2.3.3 定量限和檢測限

取2.3.2項下的對照品母液適量，用90%甲醇水逐步稀釋成不同質量濃度的標準溶液，按照2.1項中色譜條件進行測定。得該方法的最低檢測限質量濃度為0.5 μg/mL，最低檢測限0.01 μg（S/NCA=5.1，S/NDC=3.8）；最低定量限質量濃度為1 μg/mL，最低定量限0.02 μg（S/NCA=12.4，S/NDC=9.7）。

2.3.4 穩定性試驗

取CA和DC對照品適量，精密稱量，用90%甲醇水制成質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h后進樣，按照2.1項中色譜條件進行測定。結果表明，對照品溶液在24 h內穩定，CA和DC的色譜峰面積無明顯變化，RSD值分別為0.25%和0.27%。

2.3.5 精密度試驗

取對照品溶液，連續進樣6次，按照2.1項中色譜條件進行測定。結果顯示，CA色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值分別為0.12%和0.28%；DC色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值分別為0.16%和0.46%，精密度良好。

2.3.6 重復性試驗

取辣椒粉6份，按照2.2項中的方法配制樣品溶液，按照2.1項中色譜條件進行測定。以外標法計算CA和DC的含量，結果得CA和DC的含量均值分別為0.305 mg/g和0.228 mg/g，RSD值分別為0.42%和1.75%，表明此法重復性良好。

2.3.7 中間精密度試驗

取辣椒粉，按照2.2項中的方法配制樣品溶液，由不同工作人員在不同時間使用不同儀器對樣品溶液進行測定，以外標法計算CA和DC的含量，結果得CA和DC的含量均值分別為0.296 mg/g和0.222 mg/g，RSD值分別為3.24%和3.79%（n=18），表明此法具有良好的中間精密度。

2.3.8 加樣回收率試驗

取辣椒粉9份，分別加入不同體積的對照品母液（相當于對照品溶液濃度的80%，100%和120%），按照2.2項中的方法配制樣品溶液，按照 2.1項中色譜條件進行測定，計算CA和DC的含量并計算回收率。

加樣回收率試驗結果（n=9）見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=9）

由表1可知，表明該法的回收率良好。

2.3.9 耐用性試驗

取對照品溶液和樣品溶液，分別考察柱溫、流速、有機相比例對測定結果的影響。

耐用性試驗結果見表2。

表2 耐用性試驗結果

由表2可知，上述色譜條件的微小變化對測定結果影響較小。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取CA和DC對照品，制成一定質量分數的甲醇溶液進行紫外光譜掃描，結果顯示在波長227 nm和280 nm處有吸收峰，考慮到280 nm處波長較長，不易受其他物質的干擾，因此選擇280 nm為檢測波長。

CA（a）和DC（b）紫外掃描光譜見圖2。

圖2 CA（a）和DC（b）紫外掃描光譜

3.2 流動相的選擇

辣椒堿類物質極性很弱，在C18柱上保留很強，試驗選擇水和甲醇為流動相體系，隨著甲醇比例的增大，主峰保留時間縮短。由于CA色譜峰前、DC色譜峰后各有一雜質峰，當甲醇比例低于60%時，分離度無法滿足要求。而且從樣品溶液色譜圖1（c）中可以看出，提取液中的雜質較多，主要集中在15 min之前出峰，因而使主峰保留時間在20 min之后。試驗也參考美國藥典中辣椒堿原料藥的檢測方法，在流動相中加入0.1%的磷酸，發現色譜峰形并沒有得到明顯改善。因此，最終確定流動相為水-甲醇（40∶60，V/V）。根據文獻[8]推測，對照品溶液色譜圖1（b）中的雜質峰1可能是降二氫辣椒堿（NDC），雜質峰2可能是高辣椒堿（HC），這有待于進一步確證。

3.3 溶劑的選擇

試驗考察了不同比例的甲醇水溶液作溶劑時，主峰的峰形變化。

不同溶劑下CA和DC色譜峰的拖尾因子見表3。

表3 不同溶劑下CA和DC色譜峰的拖尾因子

由表3可知，當甲醇比例為90%時，兩主峰的峰形最好。除此之外，還考察了辣椒粉甲醇提取物在不同溶劑中的穩定性，結果發現當溶劑中甲醇比例低于90%時，放置一段時間后，溶液底部會有顏色較深的油狀物沉淀。因此，選擇90%甲醇水為溶劑。

4 結論

辣椒堿類成分是一系列同源的香草酰胺類生物堿，是辣椒中辛辣成分的主要來源，其中辣椒堿和二氫辣椒堿約占90%以上，是辣椒品質和生理活性的代表性物質。研究建立了高效液相色譜法同時測定辣椒粉中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的方法。該法的樣品提取工藝簡單，避免了繁瑣過程和劇烈條件導致的辣椒堿成分的損失及破壞；且在樣品色譜圖中主峰位置沒有雜質干擾，專屬性強；方法精密度良好、準確度高，具有較強的抗干擾能力，為辣椒的品質評價和生理活性檢測提供了手段。

[1]王國強.全國中草藥匯編 [M].北京：人民衛生出版社出版，2014：668-669.

[2]中國科學院中國植物志編委會.中國植物志 [M].北京：科學出版社出版，1978：61-63.

[3]Govindarajan V S.Capsicum production，technology，chemistry，and quality-Part II.Processed products，standards，world production and trade[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1986，23（3）：207-288.

[4]郭軍華，黃烽，吳東海，等.辣椒堿治療關節痛的Ⅱ期臨床研究 [J].中國新藥雜志，2002，11（12）：949-951.

[5]Peppin J F，Majors K，Webster L R，et al.Tolerability of NGX-4010，a capsaicin 8%patch for peripheral neuropathic pain[J].Journal of Pain Research，2011（4）：385-392.

[6]Haanpaa M，Treede R D.Capsaicin for neuropathic pain：linking traditional medicine and molecular biology[J]. European Neurology，2012，68（5）：264-275.

[7]Zhang R，Humphreys I，Sahu R P，et al.In vitro and in vivo induction of apoptosis by capsaicin in pancreatic cancer cells is mediated through ROS generation and mitochondrial death pathway[J].Apoptosis，2008，13（12）：1 465-1 478.

[8]韓玉珠，石磊嶺，金莎，等.反相高效液相色譜法測定辣椒中4種辣椒堿類成分的含量 [J].食品科學，2012，33（16）：257-260.

Determination of Capsaicinoids in Chili Peppers by HPLC

YUAN Lili，WANG Haixiang，HONG Sangsang，*WANG Suilou
（China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211198，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC） method is established to simultaneously determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili peppers.The HPLC method are performed on a Ultimate AQ-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm） using a mobile phase of methyl alcohol and water（40∶60，V/V） at a flow rate of 1.0 mL/min.The colum temperature is matained at 30℃and the detection wavelength is set at 280 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of capsaicin and dihydrocapsaicin in the range of 0.001~0.150 mg/mL（R2=0.999 9）is observed.The average recovery rates is 99.35%and 98.26%of capsaicin and dihydrocapsaicin respectively with an RSD of 0.82%and 0.73%（n=9）.The stability RSD is 0.27%.The intermediate precision RSD is lower than 3.79%（n=18）.This method can be used to determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili pepper rapidly with high accuracy and good repeatability.

HPLC；capsaicin；dihydrocapsaicin；chili peppers

TS255.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.040

1671-9646（2017）02b-0045-03

2017-01-04

中央高校基本科研業務費（3010010152）。

袁麗麗（1991— ），女，在讀碩士，研究方向為食品與藥品質量。

*通訊作者：王歲樓（1961— ），男，博士，教授，博士生導師，研究方向為食品與藥品質量。