八角蓮愈傷組織中開(kāi)環(huán)異落葉松脂素脫氫酶基因克隆、表達(dá)及功能鑒定

沈云+陳日道+解可波+鄒建華+戴均貴

[摘要] 開(kāi)環(huán)異落葉松脂素脫氫酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）是鬼臼毒素（podophyllotoxin）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。該研究通過(guò)基于SDH基因保守性序列的同源PCR方法，結(jié)合快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）技術(shù)從八角蓮Dysosma versipellis愈傷組織中克隆得到2個(gè)SDH候選基因SO282和SO1223，并實(shí)現(xiàn)了以上基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。體外酶活性分析表明重組SO282具有SDH活性，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 八角蓮；開(kāi)環(huán)異落葉松脂素脫氫酶；鬼臼毒素；生物合成

[Abstract] Secoisolariciresinol dehydrogenase （SDH） is a key enzyme involved in the biosynthetic pathway of podophyllotoxin.In this study，two SDH candidate genes，SO282 and SO1223，were cloned from callus of Dysosma versipellis by homology-based PCR and rapid amplification of cDNA end （RACE）.The SDH candidate genes were expressed in Escherichia coli and the subsequent enzyme assay in vitro showed that recombinant SO282 had the SDH activity. These results pave the way to the follow-up investigation of the biosynthetic of podophyllotoxin.

[Key words] Dysosma versipellis；podophyllotoxin；SDH；biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162414

八角蓮Dysosma versipellis是小檗科八角蓮屬多年生草本植物，其以根莖入藥，主要用于治療毒蛇咬傷、跌打腫痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、淋巴結(jié)炎、乳腺癌、食道癌等疾病[1-2]。研究表明，八角蓮根莖中主要含有鬼臼毒素（podophyllotoxin）、去氧鬼臼毒素（deoxypodophllotoxin）、山柰酚（kaempferol）以及槲皮素（quercetin）等多種有效成分[3]，其中鬼臼毒素對(duì)于腫瘤以及細(xì)胞癌變具有顯著的抑制作用[4]。然而，由于野生八角蓮生長(zhǎng)緩慢，分布區(qū)域局限且繁殖力低，加之過(guò)度采挖，八角蓮野生資源已不能滿(mǎn)足醫(yī)藥市場(chǎng)的需求[5-6]。另外，鬼臼毒素化學(xué)合成路線長(zhǎng)、效率低，難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。因此，解析鬼臼毒素的生物合成途徑，有利于實(shí)現(xiàn)八角蓮優(yōu)質(zhì)種源的篩選、株系的改良、栽培和培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及體內(nèi)生物合成體系的調(diào)控，從而快速大量得到所需目的產(chǎn)物，更為重要的是獲得的生物合成相關(guān)基因可在微生物中重新構(gòu)建其生物合成途徑，綠色、可持續(xù)、高效率生產(chǎn)鬼臼毒素，解決其藥源不足的問(wèn)題。

開(kāi)環(huán)異落葉松脂素脫氫酶是鬼臼毒素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶（圖1），負(fù)責(zé)將開(kāi)環(huán)異落葉松脂素（secoisolariciresinol）進(jìn)行氧化脫氫生成重要中間體馬臺(tái)樹(shù)脂醇（matairesinol）。研究表明，在桃兒七Sinopodophyllum hexandrum、美國(guó)金鐘連翹Forsythia intermedia以及盾葉鬼臼Podophyllum peltatum中，均克隆得到開(kāi)環(huán)異落葉松脂素脫氫酶（secoisolariciresinol dehydrogenase，SDH）相關(guān)基因[7-8]，而對(duì)于八角蓮中SDH基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的在于克隆、表達(dá)并功能鑒定八角蓮SDH基因，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 S1000 Thermal Cycer PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）；NanoDrop2000C微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；DYCP-31DN電泳槽（北京六一儀器廠）；Biospectrum AV凝膠成像系統(tǒng)（UVP，美國(guó)）；Sigma 3K-15高速離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器廠）；培英HYG-A恒溫?fù)u床（太倉(cāng)儀器廠，中國(guó)）；Cyberscan 510型pH計(jì)（Eutech Instrument，新加坡）；Tauto純水儀（同田科技有限公司，中國(guó)）；ZX-TJS無(wú)菌操作臺(tái)（上海整新電子設(shè)備，中國(guó)）；BSA124S分析天平（Sartorius，德國(guó)）；Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent Technologies，美國(guó)）；Shiseido capcellpak C₁₈ MGIII色譜柱（Shiseido，日本）。

RNA提取采用E.Z.N.A. Plant RNA Kit（Omega Bio-Tek，美國(guó)）；RACE反應(yīng)采用Smarter RACE cDNA amplification Kit（Clontech，美國(guó)）；基因克隆采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶（TOYOBO，日本）、pEASY Blunt Simple克隆載體（TransGen，中國(guó)）和Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（TransGen，中國(guó)）；基因外源表達(dá)采用pET28a（+）表達(dá)載體（Novagen，德國(guó)）和Transsetta Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（TransGen，中國(guó)）。

1.2 樣品 野生八角蓮植株采自廣西壯族自治區(qū)龍州縣，由廣西藥用植物園袁經(jīng)權(quán)副研究員鑒定為小檗科八角蓮屬植物八角蓮D. versipellis，標(biāo)本存放于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所標(biāo)本室（ID-26856）。八角蓮培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)自野生八角蓮的葉片，培養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)采用附加α-萘乙酸（α-NAA，0.5 mg·L^-1）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，1.0 mg·L^-1）、蔗糖（30 g·L^-1）和瓊脂（7 g·L^-1）的MS固體培養(yǎng)基，滅菌前調(diào)pH為5.8。繼代培養(yǎng)采用附加α-NAA（0.2 mg·L^-1）、6-BA（6-芐基嘌呤，0.2 mg·L^-1）、2，4-D（0.5 mg·L^-1）、蔗糖（30 g·L^-1）和瓊脂（7 g·L^-1）的6，7-V固體培養(yǎng)基，于黑暗（25±2） ℃靜止培養(yǎng)[9]。

2 方法與結(jié)果

2.1 SDH候選基因的克隆及生物信息學(xué)分析 取鮮重0.5 g的八角蓮愈傷組織，按照E.Z.N.A. Plant RNA Kit實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行總RNA制備，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。采用Smarter RACE cDNA amplification Kit將八角蓮愈傷組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到3′-ready cDNA以及5′-ready cDNA模板。

根據(jù)GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中報(bào)道的植物SDH的保守性核苷酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物SDH-F（GCGGCCGCTYCAYTGYGATGTSAC）和SDH-R（CCRCTCACATACTTGGAMTC），分別以3′-ready cDNA和5′-ready cDNA為模板進(jìn)行SDH基因3′-端和5′-端序列的擴(kuò)增。3′-端序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，2 min；98 ℃，10 s，55 ℃，30 s，68 ℃，60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；68 ℃，7 min。5′-端序列擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，2 min；98 ℃，10 s，58 ℃，30 s，68 ℃，60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；68 ℃，7 min。切膠回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pEASY Blunt simple vector連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，結(jié)合藍(lán)白斑和菌落PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并測(cè)序。采用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)拼接，得到2個(gè)完整的cDNA，分別命名為SO1223，SO282，其開(kāi)放閱讀框（open reading frame）長(zhǎng)度分別為831，822 bp，經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast分析，另外選擇與SO282，SO1223同源性較高的來(lái)源于5種高等植物的7個(gè)SDH基因一起使用MEGA5.0軟件通過(guò)Neighbor-joining法構(gòu)建以上基因所編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)，候選基因SO1223和SO282所編碼蛋白與鬼臼屬植物盾葉鬼臼、六角蓮以及藏八角蓮中的SDH基因所編碼蛋白具有較高的同源性，其中SO282所編碼蛋白與這些植物SDH親緣關(guān)系最近。

采用primer premier軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增候選基因SO1223和SO282的完整開(kāi)放閱讀框，并在兩端引入Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)，所用引物對(duì)分別為：SO1223-F/R（ggaattccatATGGGGAGCACTTCAC/cccaagctTCAGGACTCAGGATACT）和SO 282-F/R（ggaattccatATGGAAACCTCTTGTAC/cccaagc tTCAAGCTAATCCATGT）。

膠回收PCR產(chǎn)物后將帶有酶切位點(diǎn)的目的DNA與pEASY Blunt載體連接轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切。利用T4連接酶將酶切所得DNA片段與pET28a（+）載體連接構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2.2 SDH候選基因的外源表達(dá) 提取構(gòu)建成功的SO1223以及SO282基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Transetta DE3表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。將重組菌于含有卡那霉素（50 mg·L^-1）和氯霉素（34 mg·L^-1）的LB培養(yǎng)基中搖瓶旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)，分別使用終濃度為0.25，0.5，1.0 mmol·L^-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16 h，并設(shè)置一組空白對(duì)照，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的摸索。通過(guò)SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況。根據(jù)電泳結(jié)果可知，克隆所得SDH候選基因?qū)崿F(xiàn)了可溶性表達(dá)，并且當(dāng)使用0.5 mmol·L^-1的IPTG誘導(dǎo)時(shí)重組SDH可溶蛋白的表達(dá)量最大。因此最終采用0.5 mmol·L^-1的IPTG進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，提取粗酶并進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖3）。

2.3 SDH候選基因的功能鑒定 對(duì)含有SO282，SO1223基因表達(dá)質(zhì)粒以及含有pET28a（+）空載體質(zhì)粒的重組菌分別培養(yǎng)50 mL并采用終濃度為0.5 mmol·L^-1的IPTG誘導(dǎo)16 h，離心收集菌體，加入裂解緩沖液（50 mmol·L^-1Tris-HCl，含有20%的甘油和10 mmol·L^-1 2-巰基乙醇，pH 8.0）超聲破碎細(xì)胞，12 000×g離心30 min，獲得上清粗酶液用于SDH酶活性分析。100 μL酶反應(yīng)體系含89 μL粗酶液，1 μL的secoisolariciresinol（母液濃度50 mmol·L^-1）和10 μL的NAD⁺（母液濃度10 mmol·L^-1）。將配制好的反應(yīng)體系于30 ℃水浴中反應(yīng)2 h后，加入2倍體積甲醇終止反應(yīng)。將反應(yīng)液15 000×g離心30 min，取上清采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。分析條件為Shiseido capcellpak C₁₈ MG Ⅲ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～10 min，30%～58%B；10～25 min，58%～65%B；25～25.5 min，65%～100%B；25.5～30.5 min，100%B），流速1 mL·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，柱溫30 ℃（圖4）。

經(jīng)HPLC-MS對(duì)比分析酶反應(yīng)產(chǎn)物及馬臺(tái)樹(shù)脂醇標(biāo)準(zhǔn)品可知，重組SO282酶具有催化開(kāi)環(huán)異落葉松脂素氧化脫氫的活性，而基因SO1223的表達(dá)產(chǎn)物未顯示有SDH催化活性。

3 結(jié)論及討論

在鬼臼毒素的生物合成途徑中，馬臺(tái)樹(shù)脂醇是包括鬼臼毒素及其衍生物在內(nèi)的一系列8-8′木脂素類(lèi)化合物的重要前體化合物[11]。SDH是鬼臼毒素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它能夠特異性的催化反式構(gòu)型的開(kāi)環(huán)異落葉松脂素氧化脫氫生成相同構(gòu)型的馬臺(tái)樹(shù)脂醇，從而進(jìn)行下一步的生物合成[8，11-13]。本研究從八角蓮愈傷組織中成功獲取2個(gè)候選基因SO1223，SO282，體外功能鑒定結(jié)果表明基因SO282所編碼的蛋白具有SDH催化活性，為后續(xù)研究八角蓮中鬼臼毒素的生物合成奠定了基礎(chǔ)。目前，對(duì)于鬼臼毒素的生物合成途徑的研究還處于起步階段，其后續(xù)的催化過(guò)程仍未完全明確，還需進(jìn)行進(jìn)一步的探索研究，這對(duì)于解決鬼臼毒素及其活性衍生物自然資源不足的問(wèn)題具有重要意義。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]