分光光度法標定酵母超濾液濃度及其在腦膜炎球菌培養基優化過程中的應用

畢研偉，肖紅劍，丁晨，閆玲梅，寸韡

1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南 昆明 650118

分光光度法標定酵母超濾液濃度及其在腦膜炎球菌培養基優化過程中的應用

畢研偉1,2，肖紅劍1,2，丁晨1,2，閆玲梅1,2，寸韡1,2

1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南 昆明 650118

目的：建立檢測酵母超濾液濃度的方法，并探索適合A、C群腦膜炎球菌生長的無動物源性培養基中酵母超濾液的濃度。方法：通過全波長掃描及不同波長吸光度值的比較確定檢測酵母提取物濃度的最佳波長；用3000 Da超濾膜超濾酵母提取物溶液，制備酵母超濾液并檢測其性質；觀察腦膜炎球菌在含不同批次酵母超濾液的半綜合培養基中的生長情況，驗證不同批次標化的酵母超濾液的穩定性；配制含不同濃度酵母超濾液的半綜合液體培養基，觀察A、C群腦膜炎球菌的生長情況。結果：通過全波長掃描及不同波長吸光度值的比較，確定了檢測酵母提取物濃度的最佳波長為405 nm；采用3000 Da超濾膜超濾后的酵母超濾液不與CTAB產生沉淀，通過檢測其D405nm值，可以確定酵母超濾液的濃度；從生長情況考慮，A、C群腦膜炎球菌半綜合培養基中最優酵母超濾液濃度分別為4、2 mg/L。結論：建立了制備酵母超濾液及分光光度法標定酵母超濾液濃度的方法，確定了培養A、C群腦膜炎球菌半綜合培養基中最優酵母超濾液濃度。

酵母提取物；分光光度法；酵母超濾液；腦膜炎球菌

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎球菌（Neisseria meningitides）引起的急性呼吸道傳染病[1]。隨著腦膜炎球菌多糖疫苗及多糖結合疫苗的廣泛使用，流腦的發病率大為降低[2]。作為疫苗生產的腦膜炎球菌，對培養條件要求較高。目前國內流腦疫苗的生產過程中，菌種在培養過程中常使用含羊血培養基復蘇菌種，發酵過程中采用含酸水解酪蛋白的液體培養基來提高多糖產量，這些均是動物源性材料。動物源性材料不但成分復雜不利于產品批次之間的質量穩定，而且一些新型的和未知的人畜共患病也可能因為漏檢，成為潛在的疫苗污染物，因此避免使用動物源性材料進行疫苗生產是提高疫苗安全性的一個重要環節。在前期的研究中，我們采用無動物原性材料的培養基生產流腦疫苗，培養基的主要成分包括無機鹽、氨基酸、葡萄糖和酵母提取物。在研究中發現酵母提取物為腦膜炎球菌的生長提供了豐富的氮源和營養因子，是腦膜炎球菌生長的限制因子。酵母提取物是將酵母通過質壁分離后，利用自身水解酶系完全自溶，再去除細胞壁和不溶性分子后的產品，其中含有多肽、氨基酸、核苷酸、B族維生素、微量元素及未完全分解的大分子蛋白、纖維葡聚糖和核酸等[3]。

目前，腦膜炎球菌多糖疫苗生產過程中大多采用Gotschlich法[4]來沉淀莢膜多糖，即使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）沉淀發酵液上清獲得高分子量腦膜炎球菌莢膜多糖。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀大分子蛋白、核酸與酸性多聚糖的特性。WHO規程及現行《中華人民共和國藥典》第三部[5]中均規定生產培養基中不能含有與CTAB產生沉淀的物質。實驗中發現酵母提取物溶液中的大分子葡聚糖會與CTAB產生沉淀。因此，生產中既要去除能與CTAB產生沉淀的大分子，又要最大限度地保留酵母提取物的小分子營養物質。在本研究中，我們采用超濾法去除能與CTAB產生沉淀的大分子物質，同時保留了能維持腦膜炎球菌生長的營養因子。超濾必然會造成酵母提取物的濃度發生改變，而且每次超濾液回收率受多種因素的干擾，這極大地影響到下游發酵過程的批間穩定性。為了保證酵母超濾液濃度的穩定，也可以重新去除溶劑，再次稱量干粉質量，但工藝繁瑣。本研究中，我們采用全波長掃描法對酵母超濾液吸收波長進行初步研究，并對幾個波長進行濃度驗證，在固定波長下檢測酵母超濾液濃度，保證了培養基中酵母超濾液濃度的含量均一，從而控制了疫苗生產的穩定性。

由于不同群腦膜炎球菌的性質不同，如何根據每個菌群的特點優化培養基，提高菌體和多糖發酵產率，對腦膜炎疫苗的生產非常重要[6]。酵母超濾液含有多肽、氨基酸、核苷酸、B族維生素、微量元素等豐富的營養物質，可為A、C群腦膜炎球菌的生長提供豐富的氮源和營養因子。我們根據A、C群腦膜炎球菌多糖疫苗的特性，檢測了不同酵母超濾液濃度對A、C群腦膜炎球菌生長情況及產糖量的影響，進一步確定了A、C群腦膜炎球菌半綜合培養基中最佳酵母提取物的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

A、C群腦膜炎球菌由中國食品藥品檢定研究院提供，其中A群腦膜炎球菌保藏編號為29201，C群腦膜炎球菌保藏編號為29205；CTAB購自Sigma公司；酵母提取物購自BD公司；全波長紫外分光光度計為Perkin Elmer Uv/Vis spec?trometer lambda 35；3000 Da超濾膜購自Millipore公司；超濾儀為PALL Filtron。

1.2 配制半綜合液體培養基的試劑與CTAB反應

向配制半綜合液體培養基的無機鹽溶液、氨基酸溶液、酵母提取物溶液中分別加入1%CTAB至終濃度為0.01%，觀察是否有沉淀產生。

1.3 酵母提取物全波長掃描

配制濃度為0.1 g/L的酵母提取物溶液，用1 cm的石英比色杯，以雙蒸水為對照，用紫外分光光度計進行全波長掃描，掃描波長為200～800 nm，掃描速度為240 nm/min，步長為1 nm，觀察酵母提取物溶液的吸收峰。

1.4 不同波長不同濃度的酵母提取物吸收值測定

根據全波長掃描圖譜，選擇4個不同波長對不同酵母提取物的濃度進行檢測：將酵母提取物配制成不同的濃度，在不同波長下檢測各濃度的吸收值。以酵母提取物溶液的系列濃度（C）對吸光度（A）做直線回歸，并繪制標準曲線。

1.5 酵母超濾液的制備及其性質檢測

將酵母提取物配制成200 g/L，用3000 Da超濾膜超濾后，用分光光度計檢測D405nm值，確定酵母超濾液的濃度。向酵母超濾液中加入CTAB至濃度為1%，觀察產生沉淀的情況；用超濾后的酵母超濾液和未超濾的酵母提取物配制半綜合液體培養基，接種A、C群腦膜炎球菌，觀察超濾后酵母超濾液對A、C群腦膜炎球菌生長的影響。

1.6 A、C群腦膜炎球菌培養

將A、C群腦膜炎球菌接種于含不同濃度酵母超濾液的半綜合培養基中，至初始D600nm值為0.06，37℃、160 r/min培養9 h，每小時取樣測D600nm值，觀察A、C群腦膜炎球菌的生長。

1.7 酵母超濾液穩定性驗證

取3批按前述方法制備的酵母超濾液，按1.6的方法培養A、C群腦膜炎球菌，觀察A、C群腦膜炎球菌的生長。

2 結果

2.1 不同試劑與CTAB的反應

向配制半綜合液體培養基的無機鹽溶液、氨基酸溶液、酵母提取物溶液中分別加入1%CTAB至終濃度為0.01%后，觀察發現只有酵母提取物溶液會與CTAB產生沉淀。由于腦膜炎球菌多糖疫苗生產過程中使用CTAB沉淀細菌莢膜多糖，因此，需要對酵母提取物溶液進行優化去除能產生沉淀的物質。

2.2 酵母提取物全波長掃描確定最佳吸收峰波長

通過對酵母提取物溶液進行全波長掃描，發現波長小于500 nm時有明顯的吸收峰，波長大于500 nm時吸收值顯著降低（圖1）。

2.3 通過不同波長不同濃度的酵母提取物吸收值的比較確定最佳檢測波長

由于酵母提取物是混合物，在一定的波長范圍內均有明顯的吸收峰。為了能有效均一地確定酵母超濾液的濃度，選擇4個不同的波長，即405、450、490、520 nm，將酵母提取物配制成濃度為2.5、5.0、10、20、40、80、160 mg/mL的溶液，檢測不同濃度的吸收值是否呈線性。結果表明，在所選的4個波長處各濃度均呈很好的線性關系，但是由于波長越大其斜率越小，不同濃度的吸收值差別越小，即檢測靈敏度越低。因此，本研究選用的檢測波長為405 nm（圖2）。

2.4 用3000 Da超濾膜超濾酵母提取物并確定其濃度

圖1 酵母提取物溶液全波長掃描圖譜

圖2 不同濃度酵母提取物溶液在不同波長處的吸光度

用3000 Da超濾膜超濾后，向回流液中加入CTAB溶液至終濃度為1%，不會產生沉淀。用此超濾液配制半綜合培養基，培養A、C群腦膜炎球菌，同樣適合腦膜炎球菌的生長。表明用此方法獲得的超濾液保留了腦膜炎球菌的生長所需要的營養成分，而且已去除了能與CTAB反應的大分子物質。

2.5 A、C群腦膜炎球菌生長的最佳酵母超濾液濃度確定

配制含不同濃度酵母超濾液（培養A群腦膜炎球菌的半綜合培養基中酵母超濾液的濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6 g/L，培養C群腦膜炎球菌的半綜合培養基中酵母超濾液的濃度分別為1、2、3、4、5、6 g/L），培養結果表明（圖3），當酵母超濾液濃度為1.2 g/L時，A群腦膜炎球菌在第6 h到達平臺期，且D600nm值最低，隨著酵母超濾液濃度的不斷增加，A群腦膜炎球菌生長速率和達到平臺期的菌量也會增加，但酵母超濾液濃度從3.6到6 g/L培養9 h，達到平臺期時D600nm值差別不明顯，因此，從節約生產成本和生長情況兩方面考慮，A群腦膜炎球菌培養時培養基中酵母超濾液的最佳濃度為4 g/L。對C群腦膜炎球菌而言，酵母超濾液濃度從2到6 g/L培養9 h，達到平臺期時D600nm值差別不明顯，因此，C群腦膜炎球菌培養時培養基中酵母超濾液的最佳濃度為2 g/L。

2.6 酵母超濾液穩定性驗證

取3批酵母超濾液（批號為201501、201502、201503），在405 nm處測定其濃度，配制成濃度分別為4和2 g/L的半綜合培養基，培養A、C群腦膜炎球菌。結果（圖4）顯示，A、C群腦膜炎球菌在3批酵母超濾液配制的半綜合培養基中的生長情況相同，達到平臺期的時間及D600nm值基本一致。因此，用分光光度法標定酵母超濾液濃度的方法穩定性良好，從而保證了腦膜炎球菌疫苗各批次之間的穩定性。

圖3 A、C群腦膜炎球菌在含不同酵母超濾液的半綜合培養基中的生長

圖4 A、C群腦膜炎球菌在含不同批次酵母超濾液培養基中的生長

3 討論

近年來，社會公眾對疫苗質量安全的關注度逐年提高，加速新方法的研發，確保疫苗更加安全已成為疫苗產業的發展趨勢。在腦膜炎球菌多糖疫苗生產過程中，我們采用無動物源性的半綜合培養基擴增培養腦膜炎球菌。在此培養基中酵母提取物是惟一成分尚未完全明確的營養物質，是腦膜炎球菌生長的限制因子，但酵母提取物中的葡聚糖會與CTAB反應產生沉淀，不能直接應用到生產中。雖然已有市售的超濾型酵母提取物，但價格昂貴，且不同廠家采用不同分子量的超濾膜制備超濾液，限制了其在工業生產中的應用。許多研究者采用超濾、柱層析及乙醇沉淀等方法對酵母提取物的不同組分進行分析，發現酵母提取物中的活性成分主要是相對分子質量小于1000的小分子物質[7-8]。本著既能去除與CTAB反應的大分子物質，又能最大限度地保留酵母提取物中的活性成分的原則，本研究中我們采用3000 Da的超濾膜對酵母提取物溶液進行超濾，超濾后的酵母超濾濃縮液同樣適合腦膜炎球菌的生長，同時還有效去除了能與CTAB產生沉淀的大分子物質，滿足了腦膜炎球菌多糖疫苗的生產需求。

目前，酵母提取物作為一種非動物源性的營養物質被廣泛用于細菌、真菌、哺乳動物和昆蟲細胞的培養過程中[9-10]，但酵母提取物中的具體成分并未完全明晰。我們在研究中還發現每批酵母提取物之間成分差異較大，直接影響了腦膜炎球菌的產糖量。因此，建立一種簡單快速的檢測酵母超濾液中生物活性分子濃度的方法至關重要。本研究采用了分光光度法檢測酵母超濾液的濃度。全波長掃描圖譜顯示，酵母提取物在波長小于500 nm時有很強的吸收峰，由于波長越短雜質對吸收峰的干擾越大，為了減少干擾，我們選擇可見光區4個波長對酵母提取物溶液濃度進行檢測，隨著波長的增加，相同樣品的吸收值卻不斷減小，為了增加檢測的靈敏度，選擇在405 nm處檢測酵母超濾液的濃度，并對每批酵母超濾液濃度進行標化。培養基的均一性對腦膜炎球菌的生長及產糖量非常重要，直接影響腦膜炎球菌疫苗的生產質量及各批次之間的穩定性。為了驗證分光光度法標化的酵母超濾液的穩定性及方法的可靠性，我們采用3批標化的酵母超濾液培養腦膜炎球菌，結果生長情況相同，這表明用分光光度法標定酵母超濾液濃度的方法穩定性良好。

由于不同群的腦膜炎球菌的性質不同，如何優化培養基，提高菌體和多糖發酵產率，對腦膜炎疫苗的生產非常重要。通過對不同酵母超濾液濃度的研究，從A、C群腦膜炎球菌生長情況來分析，確定了培養A、C群腦膜炎球菌的酵母超濾液的最佳濃度。對不同型別腦膜炎球菌無動物源性培養基的建立，將為現有疫苗質量的提高奠定一定的基礎。

[1]Weichselbaum A.Ueber die aetiologie der akuten men?ingitis cerebro-spinal[J].Fortschr Med,1887,(5):573-583.

[2]時宇,王建華.腦膜炎球菌疫苗研究現狀和展望[J].現代中西醫結合雜志,2009,18(16):1958-1961.

[3]Zhang J Y,Reddy J,Buckland B,et al.Toward con?sistent and productive complex media for industrial fer?mentations:Studies on yeast extract for a recombinant yeast fermentation process[J].Biotechnol Bioeng,2003, 82(6):640-652.

[4]Gotschlich E C,Liu T Y,Artenstein M S.Human im?munity to the meningococcus.3.Preparation and im?munochemical properties of the group A,group B, and group C meningococcal polysaccharides[J].J Exp Med,1969,129(6):1349-1365.

[5]中國藥典委員會.《中華人民共和國藥典》第三部[S]. 2015.

[6]趙鎧,章以浩,李和民.醫學生物制品學[M].2版.北京:人民衛生出版社,2007:511-534.

[7]Mendon?a R Z,Oliveira E C,Pereira C A,et al.Ef?fect of bioactive peptides isolated from yeastolate,lact?albumin and NZCase in the insect cell growth[J].Bio?process Biosyst Eng,2007,30:157-164.

[8]Shen C F,Kiyota T,Jardin B,et al.Characterization of yeastolate fractions that promote insect cell growth and recombinant protein production[J].Cytotechnology, 2007,54:25-34.

[9]Sung Y H,Lim S W,Chung J Y,et al.Yeast hydro?lysate as a low-cost additive to serum-free medium for the production of human thrombopoietin in suspen?sion cultures of Chinese hamster ovary cells[J].Appl Microbiol Biot,2004,63:527-536.

[10]Kim D Y,Lee J C,Chang H N,et al.Development of serum-free media for a recombinant CHO cell line producing recombinant antibody[J].Enzyme Microb Tech,2006,39:426-433.

Optimization of Fermentation Medium for Neisseria menin?gitidis with Quantified Ultrafiltered Yeast Extract Solution by Spectrophotometry

BI Yan-Wei1,2,XIAO Hong-Jian1,2,DING Chen1,2,YAN Ling-Mei1,2,CUN Wei1,2*
1.Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Kunming 650118;2.Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development of Severe Infectious Disease,Kunming 650118;China

Objective:To develop a method for determination of ultrafiltered yeast extract（UYE）content,and find the UYE in animal-free medium suitable for group A and group C Neisseria meningitidis.Methods:The opti?mum absorbance wavelength of yeast extract solution was determined by comparing different wavelength absorbance values out of full wavelength scanning.Yeast extracts（YE）were fractionated by ultrafiltration（UF）with 3000 Da molecular weight cutoff membranes to prepare UYE,and then the properties of UYE were tested,the stability of different batches of UYE was validated by observing the growth of N.meningitidis in the semi-synthetic mediumcontaining different batches of UYE.The growth of A group and C group N.meningitidis was observed in the pre?pared semi-synthetic liquid medium containing different concentrations of UYE.Results:The optimum detection wavelength for YE concentration was 405 nm.There was no precipitant when CTAB was added into the UYE. The UYE could be determined at 405 nm.The best concentration of UYE was 4 g/L for group A N.meningitidis, and 2 g/L for group C N.meningitidis.Conclusion:We have developed the UYE preparation and UYE quantifica?tion spectrophotometry method,and also determined the best concentration of UYE in the semi-synthetic medium for group A and group C N.meningitidis.

yeast extract;spectrophotometric method;ultrafiltered yeast extract;Neisseria meningitidis

Q502

A

1009-0002（2017）02-0118-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.010

2016-10-31

北京協和醫學院“協和青年基金”（3332015148）

畢研偉（1980-），女，助理研究員

寸韡，（E-mail）Cunwei@foxmail.com

*Corresponding anthor,E-mail:Cunwei@foxmail.com