敲低CXCR4表達抑制胃癌細胞HGC27的增殖

呂曉業，王健，李昕宇，蒲文淵，黃芳，王芃，周建光，李山虎，衛勃

1.解放軍總醫院 普外科，北京 100853；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京100850；3.湖北醫藥學院 生物醫學工程學院，湖北 十堰 442000；4.海南大學 農學院動物科學系，海南 海口 570228

敲低CXCR4表達抑制胃癌細胞HGC27的增殖

呂曉業1，王健2，李昕宇3，蒲文淵4，黃芳2，王芃2，周建光2，李山虎2，衛勃1

1.解放軍總醫院 普外科，北京 100853；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京100850；3.湖北醫藥學院 生物醫學工程學院，湖北 十堰 442000；4.海南大學 農學院動物科學系，海南 海口 570228

目的：初步探索CXCR4與胃癌細胞HGC27增殖的關系。方法：構建攜帶CXCR4短發夾RNA（shRNA）的慢病毒載體質粒，并轉染至293T細胞中，48 h后收集上清感染HGC27細胞，用Western印跡鑒定其干擾CXCR4蛋白表達的效果，采用CCK8實驗檢測敲低CXCR4表達對HGC27細胞增殖的影響。結果：雙酶切鑒定和基因測序表明敲低CXCR4慢病毒載體質粒構建成功；慢病毒感染后有效抑制HGC27細胞中CXCR4蛋白水平，敲低CXCR4表達對HGC27細胞增殖有顯著的抑制作用。結論：CXCR4參與了胃癌細胞HGC27的增殖，提示CXCR4有望成為一個新的胃癌治療靶點。

CXCR4；基質細胞衍生因子1；胃癌；HGC27細胞

胃癌是常見的腫瘤之一，其導致的死亡率在各類腫瘤中高居第三位[1-2]。我國因受飲食結構、環境污染、醫療條件等諸多因素的影響，胃癌的發生率與病死率均高居前列[3]。因此，了解與胃癌發生發展相關的分子調控機制，對于進行早期預測與干預、制定治療方案，以及改善患者的預后均十分有利。近年來，炎性趨化因子及其受體與胃癌相關性的研究逐漸成為熱點[4]。基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）屬于趨化因子CXC亞家族，最早被Nagasawa等[5]發現，其受體CXCR4（由352個氨基酸殘基構成）是一種7次跨膜的視紫紅質樣的G蛋白偶聯受體，其N端與SDF-1結合后可啟動下游信號通路，進而參與細胞增殖、遷移、凋亡等多項功能的調控[6-7]。研究發現，SDF-1/CXCR4軸和胃癌的發生發展過程具有一定的關聯性，而我們的工作證明了在胃癌細胞HGC27中敲低CXCR4蛋白的表達對細胞增殖有顯著的抑制作用，因而有望成為一個新的胃癌治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、HGC27細胞為本實驗室保存［在37℃、5%CO2孵箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（50 U/mL氨芐西林、100 U/mL鏈霉素）的DMEM培養基培養］；DMEM培養基、胰酶購自Gibco公司；T4DNA連接酶，限制性內切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ和BamHⅠ購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、PCR回收試劑盒及膠回收試劑盒購自康寧生命科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；γ-tubulin抗體購自Santa Cruz公司；CXCR4抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG購自中杉金橋公司；轉染試劑PEI為本實驗室保存；Cell Counting Kit 8（CCK8）試劑盒購自東仁化學科技有限公司。

1.2 干擾CXCR4表達的慢病毒載體構建與鑒定

根據CXCR4的基因序列，設計干擾CXCR4表達的短發夾RNA（shRNA）引物shCXCR4-F（5'-CCGGGCTGCCTTACTACATTGGGATCTGCAGATCC CAATGTAGTAAGGCAGCTTTTTG-3'）和shCXCR4-R（5'-AATTCAAAAAAAGCTGCCTTACTACATTGG GATCTGCAGATCCCAATGTAGTAAGGCGGCAGC-3'），并將2條單鏈退火；載體pLKO.1經AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切（37℃，2 h）后切膠回收，再將退火后帶有粘性末端的CXCR4雙鏈shRNA序列連入pLKO.1載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態后培養擴增，挑取單克隆，用含氨芐西林的LB培養液振蕩培養后提取質粒，并經PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆測序。

1.3 慢病毒包裝

轉染前24 h將293T細胞接種至10 cm細胞培養皿中，接種量控制在60%～70%，轉染前2 h更換新鮮的DMEM培養液。按照轉染試劑說明書，將慢病毒包裝質粒psPAX2、包膜質粒pMD2.G和敲除質粒pLKO.1-CXCR4按3∶1∶2的比例、將轉染試劑PEI和DMEM按1 μg∶1 μL的比例稀釋，各靜置5 min后混合，再次靜置30 min后滴入293T細胞，用同樣的方法轉染對照質粒，12 h后更換新鮮的DMEM培養液，48 h后收取病毒上清并過濾，將分裝后的病毒液放置-80℃保存。

1.4 病毒感染HGC27細胞

感染前24 h將HGC27細胞接種到10 cm細胞培養皿中，接種量控制在60%～70%，感染時將5 mL病毒上清、5 mL培養液和10 μL 10 ng/mL的聚凝胺（polybrene）混勻后滴入HGC27細胞，12 h后更換新鮮的DMEM培養液，48 h用嘌呤霉素篩選。

1.5 Western印跡檢測

收集蛋白樣品，加入5×SDS緩存液，煮沸10 min后行SDS-PAGE，再濕轉至醋酸纖維膜上，用5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，4℃孵育稀釋的一抗搖床過夜；用TBST洗膜液洗膜3次，每次7 min；室溫下孵育稀釋的二抗6 h，之后用TBST洗膜3次，每次7 min；滴加發光液后在暗室中顯影、定影。

1.6 CCK8細胞增殖實驗

將CXCR4敲低的HGC27細胞和對照細胞分別接種至96孔板中，接種密度為2000/孔，重復3次，在不同時間點加入CCK8試劑，37℃靜置2 h后用酶標儀檢測樣品的D450nm值，并繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 敲低CXCR4基因慢病毒的構建、鑒定

我們在設計CXCR4引物序列時引入一個PstⅠ酶切位點，而載體pLKO.1上沒有該酶切位點。質粒經PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后，如果能獲得長度約為6.3 kb和700 bp的2條帶，則表明干擾CXCR4的基因序列已插入載體pLKO.1。選酶切鑒定為陽性的克隆提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳（圖1）和DNA測序結果（未示）表明CXCR4 shR?NA慢病毒載體構建成功。

2.2 Western印跡檢測慢病毒感染后HGC27細胞中CXCR4蛋白水平

用敲低 CXCR4表達的慢病毒顆粒感染HGC27細胞后，經嘌呤霉素篩選得到穩定感染的細胞系。經Western印跡檢測發現CXCR4蛋白表達水平被顯著抑制，說明CXCR4 shRNA慢病毒載體有效干擾了HGC27細胞中CXCR4蛋白的表達（圖2）。

2.3 生長曲線檢測抑制CXCR4表達對HGC27細胞增殖的影響

為了研究CXCR4對HGC27細胞增殖的影響，用CCK8試劑盒檢測敲低CXCR4表達后的HGC27細胞生長，結果見圖3，敲低CXCR4表達的HGC27細胞生長速度明顯慢于對照組，表明CXCR4在HGC27腫瘤細胞增殖過程中發揮重要作用。

圖1 表達載體的PstⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定

圖2 Western印跡檢測慢病毒感染后

圖3 敲低CXCR4表達抑制HGC27細胞增殖

3 討論

胃癌是最常見的腫瘤之一，其導致的死亡率居各類腫瘤的第三位。炎性趨化因子是一類具有70～80個氨基酸殘基的小分子蛋白，參與免疫應答、細胞凋亡及血管發生等生物學行為[8-9]。CXCR4廣泛表達于人體多種組織與細胞中，自2001年Muller[10]首次報道CXCR4在乳腺癌中高表達以來，不斷有學者報道其在多種腫瘤中呈過表達趨勢，與腫瘤細胞的生物學行為高度相關[7]。SDF-1/CXCR4軸在人體中發揮多種重要的生物學功效，近年來很多學者對SDF-1/CXCR4軸在胃癌發病機制中的作用進行深入研究，以期為從SDF-1/CXCR4軸尋找可行的靶點治療提供理論依據。研究發現，SDF-1/CXCR4軸可調控多條信號通路，誘導細胞發生增殖、凋亡異常，并且導致腫瘤血管發生，進一步促進腫瘤生長[11-12]。在胃癌侵襲與轉移過程中，SDF-1/CXCR4軸主要通過誘導金屬基質蛋白酶和VEGF-C上調，促進腫瘤細胞遷移與擴散[13]。同時，SDF-1/CXCR4軸通過激活PI3K-AKT信號通路，增強腫瘤細胞的抗凋亡作用，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[14]。我們通過構建慢病毒質粒并感染HGC27細胞，之后進行Western印跡檢測目的蛋白的表達及細胞生長試驗，發現在HGC27細胞中敲低CXCR4的表達能夠明顯抑制細胞增殖。未來對于SDF-1/CX?CR4軸在胃癌中的作用機制，我們需要進行更加系統、整體的研究，從而為SDF-1/CXCR4軸作為胃癌治療新靶點的可行性提供理論依據。

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CXCR4 Knockdown Inhibits Proliferation of Gastric Can?cer HGC27 Cells

LYU Xiao-Ye1,WANG Jian2,LI Xin-Yu3,PU Wen-Yuan4,HUANG Fang2, WANG Peng2,ZHOU Jian-Guang2,LI Shan-Hu2*,WEI Bo1*
1.General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3. School of Biomedical Engineering,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000;4.College of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228;China

Objective:To investigate the relationship between CXCR4 and tumor cell proliferation in gastric car?cinoma cells HGC27.Methods:After exogenous fragment was inserted into the pLKO.1 vector,the plasmid carry?ing CXCR4 shRNA was transfected into 293T cells.The supernatant containing lentiviral particles was used to in?fect HGC27 cells.Expression of CXCR4 was examined by Western blotting.The proliferation of tumor cells was examined by CCK8.Results:Double enzyme digestion and gene sequencing verified the correct constructed plas?mid.The lentiviral plasmid can inhibit the CXCR4 protein level of HGC27 cells.In addition,knockdown expres?sion of CXCR4 had the effects of inhibiting cell proliferation in HGC27 cells.Conclusion:The cell proliferation is repressed after CXCR4 was inhibited in HGC27 cells,which suggests that CXCR4 may be a potential therapeu?tic target in gastric cancer.

CXCR4;stromal cell-derived factor 1;gastric cancer;HGC27 cells

Q25;Q78

A

1009-0002（2017）02-0114-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.009

2017-01-12

國家自然科學基金（81372140，81372770，81470138）

呂曉業（1987-），男，碩士研究生；王健（1971-），男，博士；兩者為共同第一作者

衛勃，（E-mail）weibo@vip.163.com；李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com

Co-corresponding authors,WEI Bo,E-mail:weibo@vip.163.com;LI Shan-Hu,E-mail:lishanhu6@163.com