人Six1基因促進肺腺癌細胞A549的增殖

陳思禹，李玲，晉帥，洪甜，黃俊，尤文葉，韓笑，崔越，葉棋濃，王鈺琦

1.解放軍總醫院，北京 100853；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.軍事醫學科學院 附屬醫院，北京 100071；4.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000；5.首都師范大學，北京 100048

人Six1基因促進肺腺癌細胞A549的增殖

陳思禹1，李玲2，晉帥1，洪甜2，黃俊3，尤文葉1，韓笑4，崔越5，葉棋濃2，王鈺琦1

1.解放軍總醫院，北京 100853；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.軍事醫學科學院 附屬醫院，北京 100071；4.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000；5.首都師范大學，北京 100048

目的：構建帶有Flag標簽的Six1基因的慢病毒表達載體，并對表達產物Flag-Six1的生物學功能進行初步鑒定。方法：以實驗室構建的真核表達載體myc-Six1為模板，根據實驗需求合成引物，經PCR擴增，酶切后插入pCDHFlag載體，Western印跡檢測其在人293T細胞中的表達；經Western印跡鑒定無誤后，與3個包裝質粒共轉染293T細胞，包裝成慢病毒后感染人肺癌細胞A549，經嘌呤霉素篩選2周，收集部分細胞，用Western印跡驗證蛋白水平的表達，并通過細胞生長實驗檢測Six1對A549細胞生長的影響；提取RNA，通過qRT-PCR檢測細胞中血管內皮細胞生長因子C（VEGF-C）在mRNA水平的變化。結果：構建的慢病毒表達載體pCDH-Flag-Six1能夠在293T細胞中正確表達；包裝成慢病毒，感染肺癌細胞A549后可正常表達；生長曲線表明Flag-Six1可促進人肺癌細胞A549的繁殖；qRTPCR結果表明Six1可升高肺癌細胞A549的VEGF-C轉錄水平。結論：構建了帶pCDH-Flag標簽的人Six1基因慢病毒表達載體，Flag-Six1能夠在肺癌細胞系A549中表達，并能促進細胞增殖，這為進一步研究Six1的生物學功能奠定了重要基礎。

人Six1基因；慢病毒表達載體；生物學功能

Six1（sineoculis homeobox homolog 1）是一種轉錄調控因子，在多種腫瘤中發揮著重要作用[1-4]。Six1是由一個高度保守的同源異型結構域（homeodomain，HD，61個氨基酸殘基）和Six結構域（Six domain，SD，110～115個氨基酸殘基）組成的復合結構，其編碼基因位于人染色體14q23上。該結構與DNA結合的特異性決定了其靶基因的特異性，為腦、耳、眼、肌肉和腎等多種器官發育所必需[5-7]。當Six1調控異常時，不但使胚胎發育和組織器官出現異常形態結構、胚胎死亡，而且在腫瘤發生和轉移中發揮關鍵作用[8]。研究表明，Six1可以通過升高血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）的水平來促進腫瘤淋巴管的形成及淋巴轉移[9]。目前，對Six1的研究越來越多，尤其是在肺癌中，Six1的表達促進了癌周及癌內的淋巴管形成、淋巴入侵以及肺癌細胞的遠端轉移[10]。我們擬構建Six1基因的慢病毒表達載體，并驗證其升高VEGF-C水平的功能，為進一步探討Six1與肺癌的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pCDH-Flag載體為本室保存，經NotⅠ/BamHⅠ雙酶切得到所需載體；人胚腎293T細胞、人肺癌A549細胞均為本室保存；限制性內切酶、PCR試劑、DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR所用引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；轉染試劑VigoFect購自威格拉斯生物技術有限公司；細胞培養基DMEM購自上海玉博生物科技有限公司（Gibco）；胎牛血清購自浙江天航生物科技有限公司；質粒提取、PCR產物回收，酶切產物回收等試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司（Promega）；質粒測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 pCDH-Flag-Six1重組質粒的構建與測序

以myc-Six1（本實驗室保存）為模板，根據已知的Six1的編碼序列設計5'-CCCAAGCTTATGTC?GATGCTGCCGTCGTTTGGC-3'和5'-CCCAAGC TTCGATGTCGATGCTGCCGTCGTTTGGC-3'。目的基因Six1的PCR擴增條件：預變性（95℃/5 min），變性（95℃/30 s），退火（62℃/30 s），延伸（72℃/ 60 s），共34個循環，再延伸（72℃/7 min）。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶，與載體pCDH-Flag均分別用NotⅠ和BamHⅠ酶切，回收酶切產物，用T4DNA連接酶將載體pCDH-Flag與目的條帶于16℃連接5 h以上，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐西林的LB瓊脂板上培養，待單克隆形成肉眼可見的菌落時，將單克隆接種于含氨芐西林的液體LB培養基中，37℃、200 r/min培養12 h，所得菌液用于質粒提取，并經雙酶切鑒定，酶切陽性克隆進行測序。

1.3 Western印跡驗證Flag-Six1的表達

接種293T細胞于6 cm皿中，37℃培養24 h，將酶切陽性的質粒轉染293T細胞，轉染前1 h換液，此時細胞密度約為80%為宜。根據VigoFect轉染試劑劑量要求，6 cm皿VigoFect用量為4 μL，將4 μL VigoFect加入200 μL NaCl中，混勻，靜置5 min，此間將10 μg質粒與NaCl混合，用NaCl補足至200 μL，移液器吹吸數次混勻，最后將上述2種溶液混合，靜置15 min，同時轉染空質粒pCDH-Flag，將混合液加入293T細胞，于37℃、50 mL/L CO2常規培養箱中培養，6～8 h換液；24 h后3000 r/min離心5 min收集細胞，去上清，加等量的細胞裂解液，吹勻，冰上裂解30min，再加入等量的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮樣15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用Flag-HRP和tubulin抗體（1∶1000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 穩定克隆的篩選及表達水平鑒定

將293T細胞接種于6孔板，轉染前1 h換液，此時細胞密度約為80%為宜，將3種包裝質粒即0.84 μg PLP1、0.4 μg PLP2及0.56 μg VSVG分別與1 μg構建的重組質粒pCDH-Flag-Six1和對照病毒pCDH-Flag振蕩混勻于200 μL不含血清雙抗的DMEM中，分別加入10 μL Megatran1.0轉染試劑，立即渦旋混勻。室溫靜置10 min后將上述混合物輕輕滴加到已接種293T細胞的培養基中，3～4 h換液，48～72 h后收集上清，4℃、3000 r/ min離心10 min，棄去細胞碎片，取上清，-80℃保存。將300 μL上述病毒上清滴加至已經準備的密度約為70%的A549細胞中，24 h后更換為含10%胎牛血清的新鮮培養基。感染48 h后，將細胞消化至6 cm或10 cm培養皿中，待長滿時將10 μg/mL的嘌呤霉素按1∶1000加入上述培養基中進行篩選，待大部分細胞死亡后更換為新鮮培養基繼續培養至形成單個抗性集落，并增加上述嘌呤霉素的含量繼續篩選，待細胞數量不再減少時得到穩定的混合克隆。3000 r/min離心5 min收集pCDH-Flag-Six1和對照病毒pCDH-Flag感染后的肺癌A549細胞，去上清，加3倍體積的RI?PA，吹勻，冰上裂解30 min，再加入等量的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮樣15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用Flag-HRP和tubulin抗體（1∶1000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 Six1基因對肺癌細胞A549增殖的影響

用DEME將上述篩選出的穩定混合克隆A549細胞收集入EP管，10 μL測密度，計算體積，配制成每孔3000細胞的培養基100 μL，共10份，分置于96孔板，每日2孔，于溫箱中保存。待細胞貼壁后吸走原96孔板內上清液，加入Cell Counting Kit 8試劑100 μL，于保溫箱內放置1 h后，測定D450nm值。

1.6 總RNA的提取

接種A549細胞于6 cm皿中，用上述方法轉染pCDH-Flag空載體與重組質粒，培養24 h后收集細胞，3000 r/min離心5 min；用1 mL 1×PBS洗1次，加入1 mL TRIzol，用移液器吹打均勻，室溫靜置5 min裂解細胞；加入200 μL氯仿，吹勻，室溫靜置3 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清至新EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，于-80℃放置10 min；取出后于4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清，加入用DEPC水稀釋的75%乙醇溶液1 mL，上下顛倒數次，10 000 r/min離心5 min；棄上清，加入無水乙醇1 mL，混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，自然風干，加入40 μL DEPC水溶解RNA；測濃度，-20℃保存。

1.7 qRT-PCR檢測

采用提取的RNA進行反轉錄。反轉錄體系包括模板（即上步所得RNA）總量2 μg、oligo（dT）1 μL，用DEPC水補足至15.9 μL。短暫離心后，于70℃金屬浴中解鏈5 min，立即冰浴；分別加入酶反應體系（M-MLV 5×緩沖液5 μL，10 mmol/ L dNTPs 2.5 μL，RNase抑制劑0.6 μL，M-MLV 1.0 μL），于42℃金屬浴1 h，95℃金屬浴5 min，即得到cDNA。將得到的cDNA稀釋至500 μL，即可用于qRT-PCR；所得結果按2-ΔΔCt公式計算出基因的相對表達量。

2 結果

2.1 pCDH-Flag-Six1重組質粒的構建與鑒定

以本室原有的myc-Six1為模板擴增Six1基因，得到約855 bp的目的片段（圖1），與人Six1基因的大小相符。回收此PCR產物，經NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，與載體pCDH-Flag（經同樣雙酶切）于16℃連接5 h以上，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，于氨芐西林LB瓊脂培養基中培養后挑取單克隆，37℃培養2 h，進行菌液PCR（以myc-Six1為陽性對照，去離子水為陰性對照），在855 bp左右有特異條帶，初步說明此克隆為陽性克隆（圖2）。選取陽性克隆，提取質粒并經雙酶切，酶切產物與空載體經瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆出現2000 bp以上和約855 bp的2條帶，空載體則僅有較大帶型（圖3）。進而將酶切陽性的克隆進行測序，結果表明插入片段的DNA序列與人Six1基因的編碼序列是一致的（數據略）。

2.2 Western印跡檢測Flag-Six1在293T細胞中的表達

為了驗證pCDH-Flag-Six1能否在細胞中正確表達，我們將構建的pCDH-Flag-Six1質粒和pCDH-Flag空載體分別轉染293T細胞，24 h后收集細胞蛋白，進行Western印跡檢測。結果顯示，轉染pCDH-Flag-Six1質粒后在相對分子質量35× 103～40×103間檢出條帶，而轉染空載體后未在此處檢出條帶（圖4）。說明構建的pCDH-Flag-Six1能在293T細胞中正確表達。

圖1 PCR擴增人Six1的編碼序列

圖2 菌液PCR

圖3 重組質粒pCDH-Flag-Six1的NotⅠ/BamHⅠ雙酶切電泳圖譜

2.3 Western印跡檢測Flag-Six1在A549細胞中的表達

為了驗證pCDH-Flag-Six1能否通過感染在肺癌A549細胞中表達，分別收集由pCDH-Flag-Six1和pCDH-Flag包裝成的病毒感染的肺癌A549細胞蛋白進行Western印跡，檢測Six1蛋白的表達情況。結果表明，實驗組與對照組的tubulin表達沒有明顯差異，而pCDH-Flag-Six1感染組的蛋白表達水平明顯升高（圖5）。說明構建的pCDHFlag-Six1可感染A549細胞并表達。

2.4 pCDH-Flag-Six1在mRNA水平升高VEGF-C

為驗證pCDH-Flag-Six1慢病毒表達載體的功能，分別收集上述感染的肺癌A549細胞，提取總RNA，反轉錄后進行 qRT-PCR。結果表明，pCDH-Flag-Six1可明顯升高VEGF-C的mRNA水平（圖6），與文獻報道一致[11]，進一步證明pCDH-Flag-Six1表達載體構建成功，可用于后期研究。

圖4 Western印跡檢測pCDH-Flag-Six1在293T細胞中的表達

圖5 Western印跡檢測pCDH-Flag-Six1在A549細胞中的表達

圖6 qRT-PCR檢測pCDH-Flag-Six1對VEGF-C的影響

2.5 pCDH-Flag-Six1轉染A549細胞生長曲線變化

為進一步驗證pCDH-Flag-Six1慢病毒表達載體的功能，分別收集上述感染的肺癌A549細胞，鋪于96孔板，待細胞貼壁后，連續5 d于同一時間用Cell Counting Kit 8測定D450nm值，繪制生長曲線。結果表明，Six1基因可促進A549細胞的增殖（圖7）。

圖7 生長曲線驗證Six1基因的作用

3 討論

轉錄調控因子Six1是同源盒基因的一種，它在細胞增殖、分化、凋亡、形態、黏附和遷移等生命活動中起關鍵作用[12]。早有研究顯示，Six1不僅參與胚胎細胞的發育和器官分化，調控細胞周期進程，還可調節癌細胞啟動和轉移，在腫瘤發生、發展中發揮重要作用。事實上，已有研究表明Six1基因的異常表達與肺癌的增殖和遷移密切相關[13]，因而成為腫瘤學領域的研究熱點。

近年來，肺癌已成為我國發病率最高的惡性腫瘤，死亡率居高不下。找出肺癌的發病機理，已迫在眉睫。有研究發現，早期肺癌常發生淋巴結轉移現象，肺癌分期和臨床治療方案選擇的關鍵是根據有無淋巴結轉移以及淋巴結受累的程度，這也是臨床評估肺癌患者病情及預后的重要指標[14]。因此，研究肺癌淋巴結轉移機制，對于治療肺癌具有重要意義。研究表明，VEGF-C能夠調節腫瘤血管的生成，促進腫瘤細胞進入淋巴管并通過淋巴系統轉移至全身。VEGF-C是VEGF家族的新成員，在本研究中發現Six1基因能夠引起VEGF-C的轉錄，這對淋巴管生成及淋巴轉移也是必需的。

本實驗構建了慢病毒表達載體pCDH-Flag-Six1，通過qRT-PCR證明了Six1能在mRNA水平升高VEGF-C，并且驗證了它可以促進肺癌細胞系A549的增殖，這為進一步研究Six1基因的功能，及其與VEGF-C、肺癌發生和轉移等的關系奠定了理論基礎。

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Human Six1 Gene Promotes the Proliferation of Lung Can?cer Cell A549 Lines

CHEN Si-Yu1,LI Ling2,JIN Shuai1,HONG Tian2,HUANG Jun3, YOU Wen-Ye1,HAN Xiao4,CUI Yue5,YE Qi-Nong2*,WANG Yu-Qi1*
1.PLA General Hospital,Beijing 100089;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Affiliated Hospi?tal of Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;4.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;5. Capital Normal University,Beijing 100048;China

Objective:To construct the lentiviral vector of human Six1 labeled with CDH-Flag and preliminary detect the biological function of the expression product CDH-Flag-Six1.Methods:Human Six1 gene was obtained from myc-Six1 plasmid by PCR and cloned into pCDH-Flag vector.In the human kidney 293T cells,the expres?sion of the constructed pCDH-Flag-Six1 was identified by Western blotting.The recombinant plasmid pCDH-Flag-Six1 was co-transfected with three package plasmids into 293T cells,and then the supernatant containing lentivi?rus infected lung cancer A549 cell lines.After two weeks of puromycin screening,stable A549 cell lines were har?vested and subjected to Western blotting,growth curve experiment and qRT-PCR to identify Six1 expression,exam?ine growth condition,and mRNA level of VEGF-C respectively.Results:The growth curve showed Six1 overex?pressing A549 cell lines accelerated proliferation.The qRT-PCR showed human Six1 gene could up-regulate the VEGF-C mRNA expression in lung cancer A549 cells.Conclusion:The lentiviral vector of pCDH-Flag-Six1 has been constructed and the CDH-Flag-Six1 protein promotes the proliferation and regulates VEGF-C expression, which has laid foundation for the further study on the function of Six1.

human Six1 gene;lentiviral vector;biological function

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）02-0096-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.005

2016-11-10

國家自然科學基金（81472589）

陳思禹（1991-），男，碩士研究生；李玲（1991-），女，博士研究生；二者同為第一作者

王鈺琦，（E-mail）wyq301@qq.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com

*Co-corresponding anthors,WANG Yu-Qi,E-mail:wyq301@qq.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com