人PROKR2蛋白274位纈氨酸突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

周曉濤，陳丹娜，劉化蝶，周文濤，彭震，戴雨亭，李家大

1.新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.中南大學(xué) 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410000；3.新疆醫(yī)科大學(xué) 第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

人PROKR2蛋白274位纈氨酸突變質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

周曉濤1，陳丹娜2，劉化蝶2，周文濤3，彭震2，戴雨亭2，李家大2

1.新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.中南大學(xué) 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410000；3.新疆醫(yī)科大學(xué) 第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011

目的：構(gòu)建人前動力蛋白受體2（hPROKR2）274位纈氨酸殘基突變的真核表達(dá)質(zhì)粒pKR5-mGlu-FlaghPROKR2（V274D或V274R或V274T或V274A），并觀察其蛋白表達(dá)。方法：將pKR5-mGlu-Flag-mPKR2質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的hPROKR2編碼序列用MluⅠ、XbaⅠ酶切后連接，構(gòu)建pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2質(zhì)粒；以后者為模板，利用定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表達(dá)質(zhì)粒；用West?ern印跡驗(yàn)證Flag-hPROKR2（V274D）、（V274A）、（V274T）、（V274R）在真核細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：構(gòu)建了pKR5-mG?lu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表達(dá)質(zhì)粒，并觀察到相應(yīng)的蛋白表達(dá)。結(jié)論：pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，為后期檢測第274位纈氨酸對hPROKR2蛋白分子空間結(jié)構(gòu)及功能的影響創(chuàng)造了條件。

人前動力蛋白受體2；定點(diǎn)突變；纈氨酸

人前動力蛋白受體2（human prokineticin re?ceptor 2，hPROKR2）基因位于染色體20p12.3，mRNA全長2242 bp，編碼384個氨基酸殘基。hPROKR2屬于G蛋白偶聯(lián)受體，與相應(yīng)配體前動力蛋白（prokinticin，PK）結(jié)合后，參與平滑肌收縮、血管發(fā)生及促胚胎期神經(jīng)元發(fā)育和遷移[1-2]。基因型研究顯示，PK2和hPROKR2的突變與卡爾曼綜合征（Kallmann syndrome，KS）和/或特發(fā)性（單純性）促性腺激素型性腺功能減退（isolated hypogonadotropic hypogonadism，IHH）發(fā)病有關(guān)，表現(xiàn)為青春期延遲和不孕[3-5]。Sinisi等在一個KS合并性腺功能減退患者身上發(fā)現(xiàn)了hPROKR2基因的同源V274D突變[6]。先證者的母親為異源V274D突變，僅僅表現(xiàn)為月經(jīng)初潮延遲（15歲）并伴有規(guī)律的月經(jīng)周期[23]。突變的第274位纈氨酸（Val，V）位于PROKR2第三內(nèi)環(huán)（IL3）和第6跨膜區(qū)（TM6）之間連接處，這也是與許多G蛋白偶聯(lián)受體活化有關(guān)的重要區(qū)域。為了進(jìn)一步研究hPROKR2的第274位氨基酸在該受體信號傳導(dǎo)中的作用，需要構(gòu)建一系列hPROKR2第274位氨基酸突變的質(zhì)粒。在此，我們構(gòu)建了hPROKR2基因274位纈氨酸密碼子突變質(zhì)粒，并驗(yàn)證了其表達(dá)，為進(jìn)一步研究hPROKR2第274位纈氨酸對該受體的功能提供了條件。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH10B由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；鼠源PROKR2（mPROKR2）質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2由法國蒙彼利埃大學(xué)Philippe Rondard教授惠贈；pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his由本實(shí)驗(yàn)室儲備；DL2000 DNA marker、限制性內(nèi)切酶DpnⅠ購自NEB公司；Phusion高保真酶購自Thermo Scientific公司；Plasmid Mini KitⅠ柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；Nu?cleoSpin Gel and PCR Clean-up膠回收試劑盒購自Macherey-Nagel公司；LB液體和固體培養(yǎng)基、氨芐西林等試劑購自Sigma公司；LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；鼠單克隆M2抗Flag抗體購自Sigma公司；預(yù)染蛋白分子marker購自Thermo Scientific Pierce公司；培養(yǎng)基及耗材購自GIBCO公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)已報道的hPROKR2基因序列（NCBI序列號：NM_144773），利用在線軟件QuikChange Primer Design Program（https://www.genomics.agilent. com）設(shè)計擴(kuò)增突變質(zhì)粒引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成（PAGE純化）。

1.3 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2質(zhì)粒的構(gòu)建

以pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his為模板，用引物hPROKR2F和hPROKR2R擴(kuò)增出1169 bp的hPROKR2片段，回收后用1 μL MluⅠ于37℃酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，用1 μL XbaⅠ于37℃酶切2 h，再將酶切產(chǎn)物電泳回收，與經(jīng)同樣酶切的pKR5-mGlu-Flag-mPKR2質(zhì)粒連接，形成質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2。PCR反應(yīng)體系包括5 μL 10×HF反應(yīng)緩沖液，0.5 μL dNTP混合物（10 mmol/L），0.5 μL Phusion聚合酶，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），5 μL模板（20 ng/μL），加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃90 s，25個循環(huán)；72℃延伸7 min。用相應(yīng)的DNA內(nèi)切酶雙酶切目的基因和質(zhì)粒后，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，37℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)氨芐西林抗性標(biāo)記篩選得到陽性克隆，酶切鑒定后送上海Sangon公司測序，用DNAstar軟件及GenBank/Blast在線工具對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 引物及序列

1.4 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2突變質(zhì)粒的構(gòu)建

以pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2質(zhì)粒為模板，用 不 同 的 hPROKR2（V274D、V274A、V274T、V274R）突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括5 μL 10×HF反應(yīng)緩沖液，0.5 μL dNTP混合物（10 mmol/L），0.5 μL Phusion聚合酶，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），5 μL模板（20 ng/ μL），加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 5 min 25個循環(huán)；72℃延伸6 min。對照組不加引物。在25 μL PCR產(chǎn)物中加入1 μL DpnⅠ限制性內(nèi)切酶，37℃消化過夜。取10 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞（冰上2 min，42℃熱激90 s，再放置冰上2 min），用500 μL LB培養(yǎng)液于37℃、280 r/min振蕩培養(yǎng)45 min，再取200 μL菌液涂板，37℃培養(yǎng)過夜，在含氨芐西林（100 μg/mL）的固體平板培養(yǎng)基上挑取單克隆菌落培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，測序鑒定hPROKR2基因第274位纈氨酸是否分別被突變?yōu)楸彼幔ˋla，A）、天冬氨酸（Asp，D）、蘇氨酸（Thr，T）和精氨酸（Arg，R）。

1.5 Werstern印跡驗(yàn)證Flag-hPROKR2（V274D、V274A、V274T、V274R）蛋白的表達(dá)

將以3×105293T細(xì)胞傳至6孔板中，待次日細(xì)胞增殖融合達(dá) 70%左右，用 LipofectAMINE 2000分別轉(zhuǎn)染2 μg質(zhì)粒Flag-hPROKR2及2 μg Flag-hPROKR2（V274）突變質(zhì)粒，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS洗滌1次，加入100 μL完全細(xì)胞裂解液，95℃變性10 min，取20 μL上清，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃作用5 min變性，用10%SDSPAGE使蛋白分離，再經(jīng)290 mA電流濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉/TBST封閉1 h，加Flag抗體（1∶1000，鼠源）孵育2 h，TBST洗3次，加小鼠抗體（1∶10000）孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的hPROKR2片段長1169 bp，質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2和 pKR5-mGlu-FlaghPROKR2經(jīng)MluⅠ和XbaⅠ酶切后分別可見1146 bp的mPKR2（NM_144944）和1155 bp的hPROKR2（圖1）。經(jīng)NCBI的Blast比對，pKR5-mGlu-FlaghPROKR2測序結(jié)果完全符合，圖1C僅顯示hPROKR2第274位纈氨酸附近的堿基序列。

2.2 突 變 質(zhì) 粒 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D，V274R，V274T，V274A）的構(gòu)建

經(jīng)DpnⅠ酶切后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B后培養(yǎng)過夜，陰性對照無克隆出現(xiàn)，突變質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）出現(xiàn)30個克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274R）出現(xiàn)25個克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274A）出現(xiàn) 18個克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274T）出現(xiàn)20個克隆。提取克隆，擴(kuò)增后測序。從圖2測序結(jié)果可以看出，編碼hPROKR2第274位纈氨酸的堿基GTC已分別被突變?yōu)镚AC（天冬氨酸密碼子）、CGC（精氨酸密碼子）、GCC（丙氨酸密碼子）和ACC（蘇氨酸密碼子）。

2.3 突變蛋白Flag-hPROKR2（V274D，V274R，V274A，V274T）的表達(dá)

將各突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白，通過蛋白標(biāo)簽Flag抗體檢測，可以看出蛋白都能正常表達(dá)，相對分子質(zhì)量大于250×103，并且條帶彌散，跨度較大（圖3）。

3 討論

前動力蛋白PK1與PK2富含半胱氨酸，相對分子質(zhì)粒約 10×103[7]，是 PROKR（PROKR1與PROKR2）的配體。PROKR與其相應(yīng)配體結(jié)合后，可通過活化下游多種信號途徑參與機(jī)體的很多生物學(xué)功能，如血管發(fā)生、神經(jīng)生成、晝夜節(jié)律、情緒、痛覺、胃腸道運(yùn)動和攝食等[7-15]。KS和/或IHH是指下丘腦促性腺激素釋放素（GnRH）合成分泌缺陷致使垂體單純性促性腺激素分泌不足所引起的性腺功能減退，表現(xiàn)為青春期延遲和不孕[3-5]。遺傳學(xué)研究顯示PK2與PROKR2的突變與KS和/或IHH有關(guān)，疾病相關(guān)的PROKR2突變可表現(xiàn)為受體上膜障礙，與相應(yīng)配體PK2結(jié)合障礙或與下游G蛋白偶聯(lián)障礙[16-17]。

圖1 質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2的構(gòu)建

圖2 突變質(zhì)粒的測序結(jié)果（局部）

圖3 Werstern印跡檢測hPROKR2不同突變蛋白的表達(dá)

PROKR2屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其結(jié)構(gòu)包括7次跨膜螺旋、3個胞內(nèi)環(huán)（IL1～3）和1個胞內(nèi)C端。正確的分子結(jié)構(gòu)對于G蛋白偶聯(lián)受體通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜的過程非常重要，而跨膜區(qū)的很多突變可導(dǎo)致蛋白錯誤折疊，不成熟的受體蛋白會停滯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。PROKR2第274位纈氨酸位于其第三內(nèi)環(huán)（IL3）與第六跨膜區(qū)（TM6）之間的連接處，該處也是許多G蛋白偶聯(lián)受體活化的重要區(qū)域。由于先證者表現(xiàn)為KS合并性腺功能減退，并且其hPROKR2基因出現(xiàn)同源V274D突變。為此，我們嘗試將274位纈氨酸突變?yōu)樘於彼幔员阌^察hPROKR2（V274D）蛋白的功能改變。考慮到氨基酸的酸堿性及攜帶的電荷有可能影響蛋白肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步構(gòu)建hPROKR2（V274R），因?yàn)榫彼釣闃O性帶負(fù)電荷氨基酸，由此來判斷電荷對PROKR2空間結(jié)構(gòu)及功能的影響。隨后我們進(jìn)一步構(gòu)建hPROKR2（V274T），而蘇氨酸為極性不帶電荷氨基酸，以此考察蛋白分子極性對PROKR2空間結(jié)構(gòu)及功能的影響。

研究突變蛋白的分子生物學(xué)功能，首先要構(gòu)建一個真核表達(dá)質(zhì)粒。在本課題中，我們以法國蒙彼利埃大學(xué)Philippe Rondard教授惠贈的質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2作為骨架質(zhì)粒，利用引物擴(kuò)增出hPROKR2，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切出粘性末端，用DNA連接酶連入骨架質(zhì)粒。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，由于酶切效率以及酶切用緩沖液的緣故，雙酶切往往會出現(xiàn)酶切不盡的情況，會影響后期的連接。在本實(shí)驗(yàn)中，用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XbaⅠ同時進(jìn)行酶切時效率很低，我們采用的是依次單酶切的方法，即用MluⅠ單酶切過夜，保證質(zhì)粒盡可能被切成線性，線性質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳后出現(xiàn)的條帶通過切膠方式回收純化，再用XbaⅠ進(jìn)行第二次單酶切，XbaⅠ酶切效率很高，37℃酶切2 h后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，切膠回收，酶切后的骨架質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化載體后振蕩培養(yǎng)擴(kuò)增。在對突變克隆的鑒定中，因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶MluⅠ和XbaⅠ同時酶切的效率很低，此時鑒定方式也采取了單酶切鑒定法，我們選取目的基因構(gòu)入時消失的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，如果不能將環(huán)形質(zhì)粒切成線性，即表示質(zhì)粒中已連入目的基因。

定點(diǎn)突變技術(shù)非常適合用于氨基酸突變對蛋白功能影響的研究。其基本原理是以從大腸桿菌中純化抽提出的質(zhì)粒為模板，設(shè)計一對包含突變位點(diǎn)的引物和模板質(zhì)粒退火后用Phusion高保真酶循環(huán)延伸，延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。由于來源于大腸桿菌的模板質(zhì)粒是經(jīng)Dam甲基化修飾的，而體外新合成的帶突變序列的質(zhì)粒沒有被甲基化，故用限制性內(nèi)切酶DpnⅠ對延伸產(chǎn)物進(jìn)行酶切，則模板質(zhì)粒因?yàn)閷pnⅠ敏感而被切碎，新合成的質(zhì)粒在隨后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中缺口被修復(fù)，從而得到實(shí)驗(yàn)所需的突變質(zhì)粒。從單點(diǎn)突變的原理上可看出有幾個需要注意的地方：①因?yàn)槠胀≒CR中會出現(xiàn)點(diǎn)突變，在實(shí)驗(yàn)中需要保證在完整質(zhì)粒的擴(kuò)增中除了設(shè)計的突變位點(diǎn)外不能再發(fā)生其他突變，這就需要使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，我們使用的是Ther?mo Scientific公司的Phusion高保真酶。②需要采用低次數(shù)的循環(huán)延伸而非常規(guī)PCR，有助于減少無意錯配。使用質(zhì)粒作為PCR的模板利于目的基因的特異性擴(kuò)增，在實(shí)驗(yàn)中模板起始濃度為20 ng/μL，循壞次數(shù)為25個。③要保證模板質(zhì)粒盡可能被DpnⅠ切碎切盡，通常需要做陰性對照來對實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，陰性對照PCR體系中只放模板質(zhì)粒，不放引物，其余過程相同，經(jīng)DpnⅠ酶切后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，理想情況為在選擇性平皿上應(yīng)該沒有克隆長出，以此來判定DpnⅠ酶切效果是否完全徹底。

為了進(jìn)一步觀察第274位纈氨酸在hPROKR2蛋白功能中的意義，驗(yàn)證不同突變蛋白能否正常表達(dá)尤為重要。通過Uniprot查找，hPROKR2蛋白相對分子質(zhì)量為43.996×103，但由于hPROKR2能夠被糖基化，所以其相對分子質(zhì)量往往大于250× 103。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用免疫印跡方法對真核細(xì)胞中表達(dá)的各類突變蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示均能正常表達(dá)。

綜上所述，我們構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2，并進(jìn)一步構(gòu)建了hPROKR2第274位纈氨酸分別突變?yōu)樘於彼帷⒕彼帷⒈彼岷吞K氨酸的表達(dá)質(zhì)粒，檢測到它們均能正常表達(dá)，為下一步研究第274位纈氨酸對hPROKR2蛋白分子空間結(jié)構(gòu)及功能的影響提供了前提。

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Construction and Expression of the pKR5-mGlu-FlaghPROKR2（V274D/R/T/A）

ZHOU Xiao-Tao1,CHEN Dan-Na2,LIU Hua-Die2, ZHOU Wen-Tao3,PENG Zhen2,DAI Yu-Ting2,LI Jia-Da2*
1.Basic Medical College in Xinjiang Medical University,Urumqi 830011;2.State Key Laboratory of Medical Ge?netics of Centralsouth University,Changsha 410000;3.Department of Traditional Chinese Medicine,Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000;China

Objective:To construct eukaryotic expression plasmid pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）and verify their expression.Methods:The coding sequence of hPROKR2 was amplified by PCR and digested by XbaⅠ and MluⅠ,and was inserted into the same enzyeme cutting pKR5-mGlu-Flag-mPKR2 to construct pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2.The eukaryotic expression plasmid pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）were ob?tained by the site directed mutagenesis technique.The expression of Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）protein was verified by Werstern blot.Results:The four resulting plasmids were confirmed by DNA sequencing and the corre?sponding protein was expressed with the Mrover 250×103.Conclusion:The pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）have been consturcted and they will be used in the research of the effects of 274 valine on the spatial structure and function of hPROKR2 protein.

human prokineticin receptor 2;site directed mutagenesis;valine

Q78

A

1009-0002（2017）02-0090-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.004

2016-10-31

國家自然科學(xué)基金（31401218）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2015211C034）

周曉濤（1981-），女，副教授，博士

李家大，（E-mail）lijiada@sklmg.edu.cn

*Corresponding anthor,E-mail:lijiada@sklmg.edu.cn