過表達Rab27A基因?qū)ξ赴┘毎鸅GC823生物學(xué)行為的影響

王倩，楊靜文，王飛飛，王如良，李光輝,肖文華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100037

過表達Rab27A基因?qū)ξ赴┘毎鸅GC823生物學(xué)行為的影響

王倩，楊靜文，王飛飛，王如良，李光輝,肖文華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100037

目的：研究Rab27A與胃癌細胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。方法：以Rab27A低表達的胃癌細胞BGC823為出發(fā)細胞株，構(gòu)建Rab27A過表達穩(wěn)定細胞株，通過MTT實驗、軟瓊脂集落形成實驗、Transwell遷移和侵襲實驗，觀察過表達Rab27A后BGC823細胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)行為的改變。結(jié)果：過表達Rab27A后，BGC823細胞的遷移（P＜0.05）和侵襲能力（P＜0.05）顯著降低，但細胞增殖能力沒有明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論：Rab27A在胃癌細胞發(fā)生發(fā)展過程中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，這一結(jié)果為胃癌的臨床治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。

Rab27A；胃癌；增殖；遷移；侵襲

胃癌是比較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然在過去50年里胃癌的發(fā)病率有所下降，并且，近些年在胃癌的臨床早期診斷、手術(shù)治療、圍手術(shù)期護理方面取得的進步在一定程度上改善了病人的預(yù)后情況，但是據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2012年全球范圍內(nèi)有95.2萬胃癌新發(fā)病例以及72.3萬死亡病例，胃癌的發(fā)生率在各類腫瘤中位列第5[1-2]。在中國，胃癌是最常見的十大腫瘤之一，國家衛(wèi)計委的數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率緊隨肺癌之后，是國內(nèi)發(fā)病率第2、死亡率第3的惡性腫瘤。由于胃癌發(fā)病率高、預(yù)后差且治療方法有限，對胃癌的診斷和治療仍然是臨床上的一個挑戰(zhàn)[3]。胃癌的發(fā)生發(fā)展過程涉及致癌基因的激活和抑癌基因的失活，但具體作用機制仍然不是十分清楚。進一步了解胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制，將對今后胃癌的臨床診療起到十分重要的作用。

近年來大量研究表明囊泡運輸在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而胞漿內(nèi)保守的Ras相關(guān)小GTP酶超家族中的Rab蛋白被證實參與了胞內(nèi)囊泡運輸和分泌的調(diào)控過程。基因組學(xué)分析結(jié)果顯示，人類Rab家族由至少60個成員組成[4]。Rab蛋白定位于細胞亞結(jié)構(gòu)中，能夠調(diào)控細胞分泌、內(nèi)吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞生長等生物學(xué)過程[5-9]。在乳腺癌中，Rab27a過表達時，乳腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力相應(yīng)提高，這表明Rab27A能夠通過影響細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移進而促進乳腺癌的發(fā)展[10]。在胰腺癌中，Rab27A的高表達與腫瘤晚期、脈管侵犯及預(yù)后差密切相關(guān)[11]。在對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)Rab27A能夠促進細胞的增殖和侵襲，并抑制細胞凋亡，而這一作用是通過促進組織蛋白酶D的分泌實現(xiàn)的[12]。以上研究均表明Rab27a在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，但具體機制還有待深入探討。

我們的前期研究結(jié)果（未發(fā)表）表明：①Rab27A在胃癌細胞系中呈現(xiàn)差異性表達，在低分化的 BGC823細胞中低表達，而在中分化的SGC7901細胞中高表達；②Rab27A在胃癌與癌旁組織中也呈現(xiàn)差異性表達，在胃癌組織中低表達，在癌旁組織中高表達；③Rab27A低表達與腫瘤低分化、高TNM分期、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移等有明確的相關(guān)性。以上結(jié)果提示我們Rab27A很可能作為抑癌基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用。以此為基礎(chǔ)，我們以Rab27A低表達的BGC823細胞系為研究模型，建立了Rab27A過表達細胞株，進行細胞增殖、侵襲、遷移等細胞功能實驗，旨在進一步揭示Rab27A在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞系培養(yǎng)

人胃癌細胞系BGC823（國內(nèi)建系）由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室培養(yǎng)，采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）。細胞于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，選取生長狀態(tài)良好、密度適宜的細胞用于實驗。

1.2 PCR

將細胞生長狀態(tài)良好，密度為80%～90%的35 mm培養(yǎng)皿取出，棄去培養(yǎng)液，加入1 mL TRIzol試劑（Invitrogen公司），直接在培養(yǎng)皿中吹打細胞后，將溶液轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，冰浴5 min使之充分裂解；按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置2～3 min，4℃、12 000 r/ min離心15 min，取上層水相至新EP管內(nèi)；加異丙醇0.5 mL，混勻，冰浴10 min，4℃、12 000 r/ min離心10 min，棄上清；加75%乙醇1 mL，輕微振蕩洗滌沉淀，4℃、7500 r/min離心5 min，棄上清；于通風(fēng)櫥內(nèi)晾干20 min，待呈羊齒狀結(jié)晶后，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，得到細胞總RNA；分光光度計測定吸光度，-80℃保存。

總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)體系包括總RNA 1 μg、Oligo（dT）1 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，用無RNase的水補足20 μL，輕輕混勻。反應(yīng)條件為42℃30 min、85℃ 5 min，冷卻至4℃，-20℃保存。

采用Thermocycler PCR儀（Biometra公司）進行RT-PCR擴增。Rab27A基因正向引物為5'-GAAG CCATAGCACTCGCAGAG-3'，反向引物為5'-ATG ACCATTTGATCGCACCA-3'，擴增片段長度為174 bp；β-actin正向引物為5'-TTAGTTGCG TTACACCCTTTC-3'，反向引物為5'-ACCTTCACC GTTCCAGTTT-3'，擴增片段長度為150 bp。20 μL擴增體系包括cDNA 2 μL，2×Tag PCR Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，用ddH2O補足。擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，Rab27A和β-actin循環(huán)數(shù)分別為26和23次；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用Alphaimag?er 2200分析儀（Alpha Innotech公司）檢測反應(yīng)條帶并拍照記錄。

用 Applied Biosystem 7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)（ABi公司）及SYBR-Green Master PCR Mix試劑盒進行Real-Time PCR（qPCR）擴增。20 μL反應(yīng)體系包括cDNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，50×SybGreen DyeⅠ0.4 μL，2×qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL。擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，均為40個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參。用ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，溶解曲線用于檢測擴增產(chǎn)物的特異性。

1.3 Western印跡

取直徑100 mm平皿中生長狀態(tài)良好的細胞，密度為85%～95%，用PBS漂洗2次，加入200～300 μL 85℃預(yù)熱的1×SDS溶液裂解細胞，并加入1%蛋白酶抑制劑（Sigma公司）；裂解樣品經(jīng)超聲、離心，吸取上清進行UV定量，最后于-20℃分裝保存；取30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后于100℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min后上樣，恒壓電泳；350 mA恒流濕轉(zhuǎn)120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，孵育一抗（anti-Rab27A，1∶100稀釋，Abcam公司），4℃過夜；次日室溫平衡30 min，用PBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光（ECL Plus檢測試劑盒，Amersham Biosciences公司），顯影，定影。

1.4 細菌轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

從-80℃冰箱中取出50 μL Trans-T1感受態(tài)細胞，冰浴融化，加入1 μL目的質(zhì)粒（由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建），輕柔搖勻，冰浴30 min，42℃水浴中熱激45 s，冰浴2 min；加入500 μL無抗性LB培養(yǎng)基，混勻，于37℃搖床上200 r/min振蕩1 h，使細菌復(fù)蘇；取適量菌液涂布至LB固體培養(yǎng)基，倒置平皿，于37℃孵育箱中過夜，次日從每個平板上分別挑取3個點狀菌落放入帶有5 mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，于37℃搖床上200 r/min振蕩培養(yǎng)14～16 h；用無內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒快速提取試劑盒（北京博邁德公司）提取質(zhì)粒，紫外分光光度計定量后于-20℃保存。

1.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天在35 mm平皿中接種細胞貼壁生長過夜（2×105/皿），保證轉(zhuǎn)染時細胞密度為50%～70%；轉(zhuǎn)染前4～6 h，換無血清無雙抗（雙無）的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理；取250μL雙無DMEM，加入2 μg目的質(zhì)粒，另取250 μL雙無DMEM，加入6 μL LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司），輕輕搖勻后室溫靜置5 min；將稀釋后的質(zhì)粒加入含轉(zhuǎn)染試劑的DMEM中，輕柔搖勻，室溫靜置20 min；將上述混合物加入培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)4～6 h，換液為含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞以1∶10的比例傳代至100 mm平皿中稀釋培養(yǎng)，再過24 h加入G418（終濃度400 μg/mL，Gib?co-BRL公司）篩選，每隔3～4 d更換新鮮培養(yǎng)基一次，觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，直至3～4周后長出肉眼可見的抗性單克隆細胞集落。分別挑選過表達和空載單克隆擴大培養(yǎng)，提取細胞總蛋白和總RNA，采用PCR、Western印跡及免疫熒光鑒定過表達效率。待過表達穩(wěn)定細胞系建成后，將G418濃度減至初篩濃度的一半（200 μg/mL）用以保持篩選壓力，一部分細胞凍存于液氮保種，其余用于后續(xù)的生物學(xué)功能實驗。

1.6 免疫熒光

將貼壁生長的對數(shù)期細胞制作細胞爬片，24 h后用1×PBS漂洗3次，每次10 min；用4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS漂洗3次，每次10 min；用0.5%TritonX-100打孔，室溫孵育5 min，1×PBS漂洗3次，每次10 min；1%BSA封閉30 min后，滴加1×PBS稀釋的一抗（anti-Rab27A，1∶20），濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，次日用1×PBS漂洗3次，每次10 min；滴加 TRITC標(biāo)記的二抗（1∶50），37℃孵育1 h，1×PBS漂洗3次，每次10 min；DAPI（1∶50）染核，1×PBS漂洗3次，每次10 min；90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白在細胞中的定位和相對表達量，并拍照記錄。

1.7 細胞生長曲線（MTT法）

取生長狀態(tài)良好的細胞，消化計數(shù)，將細胞懸液接種于96孔板（2×103/孔），設(shè)置6個平行孔；以細胞6 h貼壁后為0 h，分別按0、24、48、72、96 h依次加入MTT（終濃度為5 mg/mL），繼續(xù)在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)4 h，避光輕輕吸去液體；待最后一天吸完后，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫避光水平輕搖15 min溶解細胞中的甲瓚，用Bio-Rad酶標(biāo)儀測定D570nm值，匯總實驗所得數(shù)據(jù)，繪制細胞生長曲線。

1.8 軟瓊脂集落形成實驗

配制底層膠［0.6%瓊脂50 mL：2×DMEM培養(yǎng)基25 mL，F(xiàn)BS 5 mL，100×青霉素/鏈霉素0.5 mL，100×谷氨酰胺（200 mmol/L）0.5 mL，1.4%瓊脂糖19 mL］，溫度保持在42℃左右；將2 mL底層膠鋪于60 mm平皿中，搖勻，室溫凝固30 min；取生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化，計數(shù)，制成細胞懸液；配制上層膠［2.2 mL細胞懸液（含1000個細胞）與1.8 mL底層膠混勻］，鋪至已凝固的底層膠上，室溫靜置30 min，待其凝固后轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2孵育箱中，每隔7 d加入2 mL上層膠（細胞懸液用培養(yǎng)基代替），以保證膠體培養(yǎng)基中細胞的正常營養(yǎng)供給和基本濕度；觀察細胞生長情況，4周后加0.2%的INT染料100 μL/皿，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)過夜；次日加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）100 μL/皿，室溫30 min，待瓊脂糖變黃，細胞集落呈黑紫色后，觀察并拍照計數(shù)，計算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%

1.9 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

實驗前一日，取未鋪膠的 Transwell小室（Corning公司）置于24孔板內(nèi)，上下室各加入500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵育箱中平衡過夜；實驗當(dāng)日，將預(yù)鋪Matrigel的Transwell小室（BD公司）置于24孔板內(nèi)，室溫平衡20 min，上下室各加500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育箱中水化2 h；取生長狀態(tài)良好的細胞饑餓處理4 h后用胰蛋白酶消化，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)；未鋪膠Transwell小室中上室接種5×104細胞（300 μL），下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL，于孵育箱中24 h；預(yù)鋪膠小室中上室接種5× 104細胞（500 μL），下室加入含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL，于培養(yǎng)箱中48 h；培養(yǎng)結(jié)束取出24孔板，棄小室內(nèi)液體，PBS漂洗1次，用棉簽擦洗上室中的細胞，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS漂洗，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min，PBS漂洗，室溫干燥，顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件（IBM公司）進行。數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用雙側(cè)t檢驗分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BGC823細胞中Rab27A過表達效率鑒定

以Rab27A低表達的胃癌細胞系BGC823為細胞模型，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，并經(jīng)4周的G418篩選，獲得候選的Rab27A過表達穩(wěn)定細胞株。PTPCR、Real-time PCR結(jié)果顯示，過表達單克隆細胞中Rab27A mRNA表達水平顯著高于空載對照（圖1，A～C）。Western印跡及免疫熒光結(jié)果也表明，與空載對照相比，過表達單克隆細胞中的Rab27A蛋白表達水平明顯升高（圖1，D、F）。以上結(jié)果表明該過表達單克隆可以用于下游的細胞功能實驗。

2.2 過表達Rab27A對BGC823細胞增殖能力沒有顯著影響

為了檢測過表達 Rab27A對胃癌細胞系BGC823增殖能力的影響，我們進行了MTT及軟瓊脂集落形成實驗。MTT實驗結(jié)果顯示，與空載對照相比，過表達單克隆細胞的生長曲線并無顯著變化（圖2A）。軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果也顯示，與空載對照相比，過表達單克隆細胞的克隆形成數(shù)量及大小并無顯著差異（圖2，B～D）。以上結(jié)果表明過表達Rab27A并不影響B(tài)GC823細胞的增殖能力。

2.3 過表達Rab27A可以抑制BGC823細胞的遷移和侵襲

采用Transwell小室檢測過表達Rab27A對細胞體外遷移和侵襲的能力的影響。通過鏡下觀察穿過基膜或基質(zhì)膠的細胞密度，我們發(fā)現(xiàn)過表達Rab27A后穿過基膜或基質(zhì)膠的細胞數(shù)量明顯減少，隨機選取至少3個視野進行細胞計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。以上結(jié)果說明過表達Rab27A可以抑制BGC823細胞的遷移和侵襲。

3 討論

圖1 BGC823細胞中Rab27A過表達效率鑒定

圖2 過表達Rab27A對BGC823細胞增殖能力的影響

圖3 過表達Rab27A對BGC823細胞遷移和侵襲能力的影響

本研究表明，過表達Rab27A對胃癌細胞系BGC823的增殖能力沒有明顯影響，但對體外遷移和侵襲能力有顯著抑制作用。我們的前期研究也顯示Rab27A在胃癌組織中低表達，并且其低表達與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良明確相關(guān)（未發(fā)表）。提示Rab27A很可能通過抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移進而阻止疾病進展，此外，我們在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)Rab27A作為抑癌基因發(fā)揮作用[13]。但這一觀點與文獻報道并不一致。在乳腺癌中，Rab27A的增殖性表達會促進人雌激素受體（ER）陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231與MDA-MB-435的侵襲和轉(zhuǎn)移[10，14]。在小鼠宮頸癌細胞中，由Rab27A依賴性途徑產(chǎn)生的外泌體與細胞因子或金屬蛋白酶共作用，會誘導(dǎo)聚集一定量的中性粒細胞，這些中性粒細胞會促進4T1腫瘤的局部生長；當(dāng)Rab27A表達受到阻滯時，4T1腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率會相應(yīng)降低[15]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，Rab27A在原發(fā)性肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁配對組織，且相比于Rab27A陰性表達患者，Rab27A陽性表達患者的生存期明顯縮短[16]。以上研究均說明Rab27A能促進腫瘤進展。因此，Rab27A在腫瘤進展中的作用具有腫瘤特異性，在不同類型的腫瘤中很可能發(fā)揮不同的作用。這種同一分子在不同類型腫瘤中作用截然相反的現(xiàn)象，很可能歸因于Rab27A的生物學(xué)作用受時間和空間的嚴(yán)格調(diào)控，因而在不同組織，乃至同一疾病的不同階段發(fā)揮完全不同的作用。具體來說，Rab27A很可能通過與不同的效應(yīng)分子相結(jié)合進而發(fā)揮不同的調(diào)控作用[17]。

Rab27A與外泌體的胞外分泌過程密切相關(guān)。在人宮頸癌細胞中，Rab27A與Rab27B能夠調(diào)控外泌體的胞外分泌過程[15]，其中Rab27A是調(diào)節(jié)分泌前階段的重要分子，它決定了分泌前階段顆粒池的大小[18]。研究表明，在裸鼠乳腺轉(zhuǎn)移癌移植瘤模型中，Rab27A與幾個其他的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因參與了囊泡運輸過程[19]。值得注意的是，腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用：一方面，含有腫瘤相關(guān)抗原的外泌體將抗原轉(zhuǎn)移給樹突細胞，樹突細胞將這些抗原呈遞給T淋巴細胞，發(fā)揮免疫促進作用，抑制腫瘤進展[20-21]；另一方面，外泌體可通過FAS/FASL通路使大量具有殺傷活性的T淋巴細胞凋亡[22-24]，通過可溶性NKG2D受體配體使NK細胞殺傷活性大幅下降[25-26]，并且還可以誘導(dǎo)骨髓來源抑制性細胞活化，最終使機體免疫系統(tǒng)癱瘓，促進腫瘤的進展[23]。因此，我們推測，Rab27A很可能通過調(diào)控外泌體的分泌過程影響胃癌進展。

綜上，胃癌中的Rab27A很可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，能夠延緩腫瘤進展，有助于病人預(yù)后。但是，Rab27A調(diào)控胃癌進展的分子機制尚未明確，有待深入探討。

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Im pact of Rab27A Overexpression on Biological Behavior of Gastric Cancer Cell Line BGC823

WANG Qian,YANG Jing-Wen,WANG Fei-Fei, WANG Ru-Liang,LI Guang-Hui,XIAO Wen-Hua*
Department of Oncology,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100037,China

Objective:To explore the relationship between Rab27A and the malignant biological behavior of gas?tric cancer cells.Methods:Rab27A was overexpressed in gastric cancer cell line BGC823.MTT,soft agar colony formation and transwell assay were used to observe the malignant behavior change.Results:The migrative and in?vasive ability of BGC823 cells were obviously reduced after Rab27A overexpression,while the proliferation of BGC823 cell line was not apparently changed.Conclusion:Rab27A might be an anti-oncogene during the devel?opment of gastric cancer,which provide new evidence and potential therapeutic target for the clinical treatment of gastric cancer.

Rab27A;gastric cancer;proliferation;migration;invasion

R735.2

A

1009-0002（2017）02-0077-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.002

2016-10-17

國家自然科學(xué)基金（81372220）

王倩（1990-），女，碩士研究生；楊靜文（1983-），女，博士，助理研究員；二者同為第一作者

肖文華，（E-mail）w_hxiao@hotmail.com

*Corresponding author,E-mail:w_hxiao@hotmail.com