液相色譜-原子熒光聯用技術與元素形態分析

壽淼鈞 李偉 趙富榮 裴曉華

(1.聚光科技(杭州)股份有限公司,杭州 310052；2.北京吉天儀器有限公司,北京 100015)

綜 述

液相色譜-原子熒光聯用技術與元素形態分析

壽淼鈞1,2李偉2趙富榮2裴曉華2

(1.聚光科技(杭州)股份有限公司,杭州 310052；2.北京吉天儀器有限公司,北京 100015)

原子熒光光度計(AFS)作為一種高靈敏度的分析技術在砷、汞、硒等元素的分析方面具有獨特優勢，在與色譜分離技術相結合后，具有可以與電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)相媲美的靈敏度。本文介紹了液相色譜與原子熒光(HPLC-AFS)聯用技術在元素形態分析方面的應用，目前的研究主要集中在砷、汞、硒、錫等元素的形態分析，研究對象以食品、海產品、農產品、水、土壤/沉積物、中藥/中成藥居多。

液相色譜-原子熒光(HPLC-AFS)聯用 重金屬、形態

元素的生物行為和毒理性質都與其在樣品中存在的化學形態緊密相關。汞和砷是有毒元素，但不同型態的汞和砷其毒性差別很大。以砷為例：常見的砷化合物包括亞砷酸(As(III))、砷酸(As(V))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(MMA)、砷甜菜堿、砷膽堿、砷糖等。其中無機砷毒性大于有機砷毒性，As(III)>As(V)>MMA>DMA，砷與有機基團結合越多，毒性越小，砷膽堿和砷甜菜堿普遍被認為是無毒的。僅測量體系中元素的總量已不能滿足科學家們在生物、環保、臨床醫學、毒理學等各個研究領域的需要，只有知道元素在樣品內的實際狀態以及化學活性、生物活性和毒性等重要信息，才能清楚地描述待測物的性質。而且因為元素的多種形態在不同條件下存在各種轉化情況，所以元素的形態分析比元素總量分析要復雜得多。

1 化學形態分析的主要方法

聯用技術是元素形態分析的主要分析手段，將樣品中的多種形態價態的混合物分離與測定結合在一起，綜合了色譜的高分離效率與檢測器的專一性、高靈敏度。分離技術主要以高效液相色譜(HPLC)、離子色譜(IC)、氣相色譜(GC)或毛細管電泳(CE)為主，檢測部分主要是原子熒光光譜(AFS)、質譜(MS)類儀器。

1.1 HPLC-ICP-MS

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)具有極高的靈敏度、干擾少、可以多元素同時檢測、動態范圍寬等特點。在元素形態分析中檢出限比ICP-AES低2～3個數量級[1]。

《中華人民共和國藥典 2015版》第四部[2]中采用了高效液相色譜法-電感耦合等離子體質譜測定法進行砷形態及其價態進行了測定。采用聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物載體鍵合三甲基銨陰離子交換材料或相當材料為填充劑，以磷酸二氫銨和水為流動相，梯度洗脫了亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿這幾種不同形態或價態的砷。文獻中關于HPLC-ICP-MS在形態方面的應用也以檢測中藥/中成藥[3-5]、食品[6，7]、環境[8，9]中的砷、汞、硒元素為主。

但是，ICP-MS儀器較昂貴，維護費用高，對操作人員技術要求較高，且存在同量異位素、多原子分子離子以及多電荷離子的干擾問題。ICP-MS對在色譜分離中常常使用的高鹽組分和高含量有機組分承受能力有限，一定程度上限制了ICP-MS與HPLC的聯用。

1.2 HPLC-AFS

AFS具有分析靈敏度高、線性范圍寬等特點。采用蒸氣發生-原子熒光(VG-AFS)聯用在某些元素上具有和ICP-MS相當的檢出限和靈敏度。對于ICP-MS不耐受高鹽組分和高含量有機組分的問題，由于蒸氣發生技術實現了待測組分與基體的有效分離，VG-AFS可以更大程度的避免鹽、有機組分的干擾。另一方面AFS成本低易維護、干擾少，更易于推廣[10]。目前有《中華人民共和國國家標準GB 5009.11-2014 食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》和《GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》兩個國家標準采用了HPLC-AFS進行無機砷和有機汞的檢測。

2 HPLC-AFS的主要應用

AFS受工作原理限制，目前主要可檢測的元素主要有砷(As)、汞(Hg)、銻(Sb)、鉍(Bi)、硒(Se)、碲(Te)、鉛(Pb)、錫(Sn)、鍺(Ge)、鋅(Zn)、鎘(Cd)等。而采用HPLC-AFS進行檢測的對象初期主要集中在砷、汞上，近年來也開始有越來越多的科研工作者開始進行硒、錫的形態分析研究。

2.1 砷

目前HPLC-AFS多用于食品、環境、中藥中的無機砷檢測。

(1)食品：《中華人民共和國國家標準GB 5009.11-2014 食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中無機砷的測定第一法即液相色譜-原子熒光光譜法(LC-AFS)。采用陰離子交換色譜柱，按分析基質的不同種類進行等度(分離了亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷)[11]或梯度(分離了亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿)洗脫。待測物為稻米類樣品時，可采取等度法進行分離；當待測物為海產品、或含有海產品的嬰幼兒輔食時，則必須采用梯度法進行分離，因這類樣品中可能含有砷甜菜堿，如果采用等度法進行分離容易造成As(III)的假陽性判斷。

(2)環境：龔倉等人[12]、顧海東等人[13]分別測定了大氣顆粒物中、土壤中的砷形態；龔倉等人采用大流量采樣器進行樣品采集、用1mol/L的H3PO4超聲提取，考察了流動相的種類、梯度洗脫時間與比例，最終確定了10mmol/L和200mmol/L的NH4H2PO4為流動相，在1～3min內，流動相配比為60%/40%為最佳分離條件。顧海東等人分別考察了檸檬酸銨-鹽酸、草酸銨、磷酸、磷酸鹽、碳酸鈉、碳酸氫鈉等提取劑對于土壤中砷形態的提取效果，結果表明磷酸提取效果最佳。采用正交實驗法考察了提取劑濃度、提取時間、提取次數、提取溫度這4種因素對結果的影響。

(3)中藥：姜泓等人[14]測定了雄黃在水、人工胃液、人工腸液中可溶性中As(III)的含量。結果發現雄黃在人工胃液及人工腸液中As(III)的溶出量均高于在水中的溶出量，從而增加了雄黃對機體的毒性。祖文川[15]等人測定了6種植物源性中藥中砷的形態。文中分別考察了酸熱浸提、超聲輔助提取、微波輔助提取這3種常用形態前處理手段，結果表明酸熱浸提法對于不同形態砷提取效果最佳，甲醇水溶液(1+1)超聲輔助提取和水微波輔助提取未能有效提取有機砷。在微波輔助提取中，加入適量酸對有機砷的提取效率有一定改善。

2007年，北京吉天儀器有限公司就曾采用HPLC-AFS聯用的方式檢測了原有無機砷檢測方法的中間產物[16]，證明了原有無機砷檢測方法的不能有效地區分有機和無機砷形態，所以對于有機砷中砷糖含量較高的海藻會造成誤報。另外還比較了鹽酸法和水甲醇法兩種提取效率，鹽酸提取法提取效率略高，且譜圖簡單，更適合無機砷的檢測。2009年曾發表文章對于化妝品中砷、銻同測的條件進行摸索[17]，優化了流動相配比、色譜分離和儀器檢測條件，為化妝品中砷、銻同測提供了新的方法。

2.2 汞

自然界中的汞以單質汞、無機汞和有機汞的形態存在，由于汞不同形態的毒性有較大差異，同時，在環境中的遷移以及在動植物體內的轉化和毒性與它們的形態直接相關，食品、環境和生態研究中汞的形態分析越來越引起人們的關注。有機汞的毒性大于無機汞，其中又以甲基汞的毒性最強，它也是一種主要的水體污染物，且對神經系統有強烈的毒性作用。甲基汞中毒主要為神經系統癥狀，例頭痛、疲乏、健忘等。為免消費者受到甲基汞殘留危害，我國國家標準《GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》和農業行業標準《NY 5073-2006 無公害食品：水產品中有毒有害物質限量》中都進行了甲基汞的含量要求。

目前，研究較多的是食品和環境應用領域，食品中尤其是海產品/水產品中甲基汞的含量測定[14-16]研究更多。趙凱等人[18]和劉慶陽等人[19]采用KOH甲醇溶液作為提取液，采用(乙酸銨+二巰基乙醇)和甲醇(或乙腈)作為流動相分析海產品中的甲基汞；國家標準《GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》和蔣天成等人[20]采用了酸性提取液提取樣品，采用(乙酸銨+L-半胱氨酸)溶液和甲醇(或乙腈)作為流動相進行汞形態分離。因無機汞、甲基汞及其他有機汞與特定的絡合劑形成復合物后，極性差異增大，可由液相色譜進行分離。常用的絡合劑主要有二硫代氨基甲酸鹽、巰基化合物、雙硫腙等。

戴彥韻等人[21]采用HPLC-AFS進行了嬰幼兒輔食中汞的形態研究，因為嬰幼兒輔食中廣泛添加深海旗魚和金槍魚等魚類，而之前媒體曾多次報道過嬰幼兒罐裝輔助食品中有總汞含量超標的情況，從測試結果中也發現在4種總汞陽性的樣品中，甲基汞的含量占到90.8～95.8%。毛永楊等人[22]進行了食用菌中的汞形態研究，因為食用菌對土壤及生長環境中汞具有較強的生物富集作用，因此分析食用菌中汞的不同形態對于避免人體慢性汞中毒具有現實意義。

當進行水或沉積物中汞形態時，樣品前處理方法尤為重要。趙云芝等人[23]對比了巰基棉富集與液-液萃取法，兩種方法的回收率都滿足實驗分析要求，最終選擇了萃取效率高且簡單快速的液-液萃取。冷庚等人[24]則選用了2-巰基乙醇絡合劑用于沉積物樣品中汞形態的微波輔助萃取，并對萃取條件與萃取物的穩定性進行了考察，實驗結果顯示該方法可以有效萃取沉積物中的汞，且方法簡單、快速。

吉天公司曾通過和多家應用單位合作，共同參與、推進了《SN/T 3034-2011 出口水產品中無機汞、甲基汞和乙基汞的測定 液相色譜-原子熒光光譜聯用(LC-AFS)法》、《SN/T 3134-2012 出口動物源性食品中硫柳汞殘留量的測定 液相色譜-原子熒光光譜法》的發布與實施。針對水、土壤、植物等基質中的汞形態，也進行了大量的研究。與四川宜賓市環境監測站合作采用HPLC-AFS法結合固相萃取技術優化了水樣中痕量甲基汞的富集條件[25]，使得甲基汞在0.2～20.0μg/L的濃度范圍內線性關系良好。與北京大學環境工程學院合作采用燈內紫外處理器將所有汞的形態在線消解為無機汞[26]，無需輔助氧化劑，抗有機溶液和基體的干擾能力強，采用整體柱進行流速梯度洗脫將分析時間縮短，采用控溫混旋提取裝置用于實際樣品提取，實驗樣品快速前處理。與清華大學合作進行了植物中的汞形態研究[27]，通過鹽酸混合提取液提取，C18分析柱分離，對于來自冶煉廠附近植物的不同部位汞形態含量進行測定。

2.3 硒

硒是生物體內必須的微量元素，具有重要的生理生物活性。無機形態的硒化物主要是Se(II)，H2Se有毒且不穩定；單質Se(0)以不溶態存在；Se(IV)、Se(VI)多以鹽的形式存在，穩定、耐堿、耐氧化。有機形態的硒化物包括：硒代蛋氨酸來自于植物體；硒代半胱氨酸來自于動物體。哺乳動物體內大部分的硒以硒代半胱氨酸的形式在相應功能蛋白中發揮生物活性作用。

對于硒的HPLC-AFS分析方法，肖志明[28]等人采用磷酸氫二銨緩沖液作為流動相，Hamilton陰離子交換柱PRP X-100(250mm×4.1mm，10μm)，7%鹽酸作為載液，2%硼氫化鉀(含0.5%氫氧化鉀和0.1%碘化鉀)作為還原劑，基線分離了SeMet、SeMeCys、Se(IV)、Se(VI)四種硒形態并測試了活性酵母飼料添加劑中的硒含量。姚晶晶[29]等人采用15mM磷酸氫二銨(pH=4.5)作為流動相，陰離子交換色譜柱Dionex IonPac AS10(250mm×4mm i.d.，5μm)，10%鹽酸作為載液，2%硼氫化鉀(含0.5%氫氧化鉀和0.1%碘化鉀)作為還原劑，開UV燈，基線分離了SeCys、SeMet、Se(IV)三種硒形態并測試了茶葉中的硒含量。

吉天公司針對富硒營養品同時進行了砷和硒的形態測定[30]，考察了流動相中磷酸氫二銨的濃度、氫化物發生的條件、AFS測量條件對于分離的影響，并測試了富硒營養品中的砷和硒含量；與中國水產科學研究院黃海水產研究所合作考察了水產品中硒的形態[31]。水產品中的硒經浸提后，由于陰離子交換色譜柱對硒的各種形態吸附能力不同，流動相將其依次洗脫，優化了前處理條件和儀器條件，建立了水產品中硒形態含量的測定方法。

2.4 錫

金屬錫在自然環境中具有多種形態，無機錫被認為基本無毒，有機錫則表現出了復雜的毒性模式，歐盟各國通過了系列法令限制有機錫的使用。有機錫即含有金屬元素又具有有機物的性質，因此可以采用氣相色譜、液相色譜與原子吸收、質譜等聯用的方式。因采用GC進行分離時前處理過于復雜，而采用HPLC則相對簡單，不需要衍生。

李勇[32]等人檢測了海產品中的三甲基錫、一丁基錫、二丁基錫、三丁基錫。采用紫外光照射使得C-Sn鍵斷裂，分解后的錫為四價錫，如果直接進入氫化物發生，產生的SnH4不穩定，在室溫下易分解。使用硫脲和抗壞血酸將四價錫還原為二價錫，再進行氫化物發生就能生成較為穩定的SnH2。

鄧愛華[33]等人研究發現二甲基錫、三甲基錫和二苯基錫均能在酸性條件下與硼氫化鉀形成可揮發性有機錫氫化物，經載氣帶入原子熒光光度計后被激發產生熒光。采用Agela-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇-水-醋酸-三乙胺(60∶40∶1∶0.03)作為流動相，5%鹽酸作為載液，2%硼氫化鉀作為還原劑，5分鐘內基線分離了二甲基錫、三甲基錫和二苯基錫。另外，研究顯示流動相的組成對于化合物的分離有非常大的影響。

3 總結與展望

將HPLC和AFS聯用可以利用色譜技術將不同形態的金屬化合物進行分離，再利用原子熒光檢測技術對各形態的金屬化合物進行檢測，充分利用原子熒光的高靈敏度、專一性和抗干擾能力的優勢，開發更多應用領域與待測元素，HPLC-AFS法是一項非常有前途的分析方法。

HPLC-AFS聯用法中的樣品前處理步驟不僅需要盡可能完全的提取出待測物，還需要最大程度的保存各元素的形態，在提取過程中減少或避免元素間不同價態的轉化，這就使得樣品前處理過程尤為重要。當樣品基質過于復雜，或樣品基質中包含某些具有氧化性或還原性的物質時，提取方式、提取溶劑、提取溫度都將影響最終測試結果。應用、發展有效的前處理技術是保證元素形態分析成功的關鍵步驟。

[1]張華,王英鋒,施燕支,陳玉紅.高效液相色譜及聯用技術在砷形態分析中的應用.光譜學與光譜分析，2007,27(2)：386-390.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 2015版.(4部).

[3]陳秋生,程奕,孟兆芳,劉燁潼,張強,張璽,范朝暉.仿生提取HPLC-ICP-MS測定含雄黃中成藥中可溶性砷含量. 藥物分析雜志，2010,(10),1829-1835.

[4]李麗敏,夏晶,王欣美,王枚博,王柯，季申.HPLC-ICP-MS法研究5種含雄黃中成藥的可溶性砷及其形態. 中成藥，2012,34(11)：2118-2123.

[5]陳軍輝，謝明勇，王鳳美，王小如，黎先春.RP-HPLC-ICP-MS技術用于西洋參中多元素溶出特性及形態分析. 高等學校化學學報，2006,27(10)：1844-1848.

[6]周瑛，葉麗，竹鑫平.HPLC-ICP-MS在食品中硒和砷形態分析及其生物有效性研究中的應用. 化學進展，2007,19(6)：982-995.

[7]鐵梅，方禹之，孫鐵彪，李闖，費金巖，等.HPLC-ICP-MS聯用技術在富硒金針菇硒的形態分析中的應用. 高等學校化學學報，2007,28(4)：635-639.

[8]劉鋒，石志芳，姜霞，李炯源，陳玉紅.HPLC-ICP-MS法分析太湖沉積物中砷的形態及分布特征. 質譜學報，2011,32(3)：170-175.

[9]王征，游飛明,邱秀玉，黃紅霞.HPLC-ICP-MS法測定水樣中的甲基汞，乙基汞和無機汞. 福建分析測試，2009,18(1)：28-31.

[10]李明章，李崇江.液相色譜-原子熒光聯用技術及產品介紹. 分析儀器，2016，(2)：96-99.

[11]姚晶晶，袁友明，王明銳，廖李.高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光法測定大米中的4種砷形態. 分析儀器，2012，(4)：37-39.

[12]龔倉，徐殿斗，馬玲玲，賀婷婷，楊國勝，等.HPLC-HG-AFS測定大氣顆粒物中砷的形態. 分析試驗室，2014，(6)：664-667.

[13]顧海東，陳邵鵬，秦宏兵.高效液相色譜-原子熒光光譜聯用分析土壤中形態砷. 環境監測管理與技術，2012,24(1)：38-42.

[14]姜泓，張穎花，敬華，石松田，薛鵬，高雙，宮慧芝，孫貴范.HPLC-HG-AFS法測定雄黃中As(III)的含量. 化學研究，2008,19,67-69.

[15]祖文川，汪雨，劉聰，常久樂，李明章.高效液相色譜-原子熒光光譜聯用技術分析6種植物源性中藥中砷的形態. 分析試驗室，2016(1)：82-85.

[16]韋昌金，徐浩，劉霽欣，韓昊.原子熒光形態分析儀測量海藻中無機砷. 農業質量標準，2007年增刊.

[17]秦德元，張新智，劉霽欣.化妝品中砷，銻無機形態的HPLC-HGAFS同測. 生命科學儀器，2009,7(3)：33-37.

[18]趙凱，楊大進.高效液相色譜原子熒光分光光度聯用法測定海產品中的甲基汞含量. 中國食品衛生雜志，2011,23(6)：534-539.

[19]劉慶陽，何濱，胡敬田，江桂斌.高效液相色譜與原子熒光光譜聯用分析海產品中的甲基汞. 分析試驗室，2009,28(5)：41-44.

[20]蔣天成，劉守廷，高明義，黃殿貴，羅艷，宋業成.高效液相色譜原子熒光聯用測定廣西北部灣海產品中汞的形態. 現代儀器與醫療，2012,18(4)：22-25.

[21]戴彥韻，胡子峰，鮑笑嶺，裴煒.高效液相色譜-原子熒光測定嬰幼兒輔食中汞的形態. 食品工業，2016，(6)：292-294.

[22]毛永楊，舒平，趙浩軍，郭啟新，張燕.高效液相色譜-原子熒光聯用測定食用菌中無機汞、甲基汞、乙基汞. 云南大學學報自然科學版，2016,38(3)：471-476.

[23]趙云芝，錢蜀，王俊偉，李海霞，萬旭.高效液相色譜-原子熒光聯用測定天然水中烷基汞. 中國環境監測，2011,27(3)：17-19.

[24]冷庚，王俊偉，萬旭，錢蜀，但德忠.微波萃取高效液相色譜-冷原子熒光光譜法測定沉積物中甲基汞和無機汞. 分析化學，2012,40(2)：191-195.

[25]唐興偉，王欣.飲用水中甲基汞的測定. 現代科學儀器，2013，(6)：139-141.

[26]曹小丹，秦德元，郝偉，焦曉琳.低壓液相色譜-原子熒光快速測定魚肉和土壤樣品中汞形態. 分析化學，2014，(7)：1033-1038.

[27]蒲麗梅，曹小丹.液相色譜-原子熒光聯用測定植物中汞形態. 現代儀器與醫療，2012，18(5)：64-67.

[28]肖志明，宋榮，賈錚，李陽，樊霞.液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法測定富硒酵母中硒的形態. 分析化學研究報告，2014,(9),1314-1319.

[29]姚晶晶，袁友明，王明銳，廖李.高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光法測定茶葉中的3種硒形態. 現代農業科技，2015,(21),297-298.

[30]韋昌金，劉霽欣，裴曉華.離子交換色譜-氫化物發生雙道原子熒光法同時測定砷和硒形態. 分析化學研究報告，2008,(8),1061-1065.

[31]尚德榮，秦德元，趙艷芳，翟毓秀，寧勁松，丁海燕，盛曉風，徐正.高壓液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS)聯用技術檢測水產品中硒的賦存形態. 食品安全質量檢測學報，2013，(6)：1847-1852.

[32]李勇，林燕奎，李莉，顏治，王丙濤.液相色譜-原子熒光光譜聯用檢測海產品中不同形態錫的研究. 食品安全質量檢測學報，2014，(11)，3467-3475.

[33]鄧愛華，龐晉山，彭曉俊，梁偉華.高效液相色譜-氫化物發生原子熒光法同時測定塑料制品中的3種有機錫. 分析測試學報，2014，33(8)：928-933.

更 正

因本刊編輯工作上的疏漏，2017年第三期《焦爐煤氣原位整體式干法樣氣處理系統研究與實踐》一文的基金項目重慶市教委科學技術項目(KJ1713322)；重慶科技學院研究生科技創新項目(YKJCX1620409)漏登，特此更正，并向張恒健等作者致歉。

《分析儀器》編輯部

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.04.001

2017-04-05

壽淼鈞，男，1978年出生，高級工程師，主要從事實驗室儀器行業產品開發和管理工作。