腫瘤細胞微環境對膠質瘤血管生成擬態形成的影響

凌耿強，馬東營，何瑞星，王悅娜，葉偉

腫瘤細胞微環境對膠質瘤血管生成擬態形成的影響

凌耿強，馬東營，何瑞星，王悅娜，葉偉

目的探討腫瘤細胞微環境改變對膠質瘤血管生成擬態（VM）形成的影響。

膠質瘤； 血管生成擬態； 腫瘤細胞微環境； 缺氧； 抗血管生成治療

腦膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤之一，其血供豐富，應用抗血管生成治療對控制膠質瘤生長效果明顯[1]。但是，近年發現膠質瘤對抗血管生成藥物具有抗藥性，其機制可能與血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）相關[2]。VM 是一種不依賴于內皮細胞而形成的供血管道，已經被發現存在于多種惡性腫瘤中[3]，并且有研究提示 VM 與膠質瘤患者的預后相關[4]。因此，VM 可能是膠質瘤治療的新靶點之一[5]。

既往認為，VM 形成與否跟腫瘤細胞自身特性有關，不形成 VM 的腫瘤細胞對周圍基質環境進行重塑的能力很弱，即使添加了一些與形成管道相關的細胞因子，包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，也無法產生管道樣結構[2]。最近有研究顯示，原本無法形成 VM 的低度惡性腫瘤細胞在某些環境中（如大于 2% 的缺氧環境）也可以形成 VM 結構[6-7]。因此我們推測腫瘤細胞所處的微環境才是其能否形成 VM 的決定因素。微環境的改變與細胞外基質中 VM 相關的細胞因子（VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF、TNF-α）濃度變化以及基質金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）活性水平相關。在本課題中，我們擬采用多種改變微環境的方法誘導低惡性度膠質瘤細胞 SHG44 形成VM 結構，并通過檢測微環境中多種細胞因子的濃度變化和基質金屬蛋白酶的活性水平探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質瘤細胞系 U251 購自上海博士德生物工程有限公司；人腦膠質瘤細胞系 SHG44 購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；10% 胎牛血清、胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；高糖DMEM 培養基購自美國 Gibco 公司；Matrigel 購自美國 Becton Dickson 公司；CoCl2購自美國Sigma 公司；VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海史瑞可生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常規細胞培養 所有的培養基中均添加100 U/ml 的青霉素和 100 μg/ml 的鏈霉素，臨用前再添加 10% 胎牛血清，細胞置于 37 ℃、5% CO2的培養箱中，每 2～3 天傳代一次。

1.2.2 細胞的三維培養及管道計數實驗 參照 El Hallani 等[8]的方法并加以改進，把 200 μl Matrigel膠于 4 ℃ 過夜融化，并加入預冷的 24 孔板中，置于 37 ℃ 培養箱中 30 min 固化，細胞消化離心后重懸，不加血清，接種于 24 孔板中，每孔接種5×104個，37 ℃ 培養 24 h 后用倒置顯微鏡于×200 隨機選取上、下、左、右、中 5 個視野，每個視野的管道總長度取平均值進行組間比較。

1.2.3 誘導 SHG44 細胞形成 VM

1.2.3.1 缺氧環境誘導 采用張熙等[7]的方法，將無血清培養的 SHG44 細胞種入預鋪 Matrigel 的孔板后，每孔加入 CoCl2100 mmol/L。37 ℃ 培養24 h，觀察各組 SHG44 細胞 VM 的形成情況。

1.2.3.2 U251 上清誘導 將 U251 進行無血清培養約 24 h，收集其上清并離心。將 U251 上清混合 SHG44 細胞后，均勻接種至預鋪 Matrigel的孔板上，37 ℃ 培養 24 h 后觀察。

1.2.3.3 接種過 U251 的 Matrigel 誘導 參照Seftor 等[9]的方法并加以改進，先將 U251 細胞種入預鋪 Matrigel 的孔板中，置于 37 ℃ 培養箱中培養 24 h 后，U251 細胞形成 VM。依次用 20 mmol/L的 NH4OH、蒸餾水、PBS、常規培養基沖洗并浸泡 1 h，將 U251 細胞完全除去。然后將無血清培養的 SHG44 細胞接種至上述孔板中，37 ℃ 培養24 h 后觀察。

1.2.4 ELISA 檢測細胞因子濃度 各組細胞種到Matrigel 上 24 h 后，上層培養基離心取上清，按照試劑盒說明書進行 VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 的 ELISA 檢測。每組設 2 個復孔。

1.2.5 明膠酶譜檢測 MMP-2、MMP-9 活性水平 取對數生長期細胞至無血清培養基中培養24 h，收集上清離心，進行 SDS-PAGE 電泳，洗脫、漂洗后孵育，然后染色及脫色，顯示 MMP-2（72 kD）和 MMP-9（92 kD）為位于藍色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統分析讀取條帶光密度值（OD），記錄數據。實驗重復 2 次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 用不同的方法誘導 SHG44 細胞形成 VM 并比較組間管道長度差異

三維培養時，SHG44 細胞并不形成 VM。部分細胞呈球形并聚集成大小不等的細胞集落，部分細胞呈梭形散在分布。管道計數實驗（圖 1）可見缺氧組形成 VM 的能力最強為（2479.67 ± 286.09）μm，U251 上清組次之為（2166.73 ± 171.80）μm，接種過 U251 的 Matrigel 組能力最弱為（1406.00 ± 155.37）μm。

2.2 ELISA 檢測

不同處理組的 SHG44 細胞培養上清中VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 的濃度采用 ELISA 測定。結果顯示，對照組、缺氧組、U251上清組、預處理 Matrigel 組的 VEGF 濃度分別為（115.40 ± 8.99）、（362.19 ± 25.69）、（306.02 ± 11.30）、（261.90 ± 18.57）pg/ml，TGF-β 濃度分別為（1309.87 ± 32.69）、（5699.63 ± 38.67）、（5311.67 ± 34.20）、（5036.37 ± 22.30）pg/ml，bFGF 濃度分別為（785.07 ± 18.16）、（4214.26 ± 188.70）、（4068.63 ± 164.82）、（4172.73 ± 145.66）pg/ml，PDGF 濃度分別為（49.44 ± 5.12）、（157.83 ± 1.67）、（124.19 ± 0.85）、（92.03 ± 5.59）pg/ml，TNF-α 濃度分別為（3.26 ± 0.16）、（8.27 ± 0.25）、（8.04 ± 0.16）、（7.89 ± 0.43）pg/ml。各實驗組 VEGF、TGF-β、bFGF、PDGF、TNF-α 濃度與未處理組相比均有顯著升高（P ＜ 0.05），但缺氧組、U251 上清組、預處理Matrigel 組有明確遞減趨勢的因子為 VEGF、TGF-β、PDGF，并且經過 Spearman 相關分析發現VEGF、TGF-β、PDGF 與 VM 形成能力具有相關性（P ＜ 0.05），而 bFGF（P=0.893）和 TNF-α（P=0.258）與 VM 形成無明顯相關性。

2.3 明膠酶譜檢測

明膠酶譜檢測結果（圖 2）顯示，缺氧組MMP-2 和 MMP-9 活性均顯著高于對照組（P ＜0.05）。U251 上清組的 MMP-2 與對照組相比顯著增高（P ＜ 0.05），但較缺氧組下降（P ＜ 0.05），而MMP-9（P=0.855）與對照組無顯著差異。U251 預處理的 Matrigel 組的 MMP-2（P=0.669）及MMP-9（P=0.068）與對照組均無顯著差異。Spearman 相關分析顯示，MMP-2 與 VM 形成能力相關性顯著（P ＜ 0.05），而 MMP-9 無相關性（P=0.195）。

圖1 不同方法誘導 SHG44 細胞形成 VM 及管道形成實驗（A：各組細胞三維培養形態；B：實驗組組間比較柱狀圖；*P＜ 0.05）Figure 1 SHG44 VM formation was induced by different methods and tube formation assays (A:Three dimentional culture of each group of cells; B:Histogram between experimental groups;*P ＜ 0.05)

圖2 MMP-2（A）及 MMP-9（B）活性測定（與對照組相比，P ＜ 0.05）Figure 2 Activity of MMP-2 (A) and MMP-9 (B) in each group (*P ＜ 0.05 compared with control group)

3 討論

腫瘤微環境指腫瘤在生長過程中，腫瘤細胞及細胞外間質相互作用形成的特殊環境[10]。有研究指出，腫瘤細胞在缺氧環境下其增殖、侵襲及遷移的能力明顯增加[11-12]。VM 往往出現在高侵襲性及高惡性度的腫瘤中，一些研究已經表明缺氧的微環境可以誘導腫瘤細胞形成 VM。U251 細胞做為一種VM 陽性細胞已為許多研究證實[13-14]。U251 細胞系來源于人腦膠質母細胞瘤 IV 級，生長迅速，惡性度高，因此容易形成一個相對缺氧的微環境。本次實驗中，我們用 U251 上清及 U251 預處理Matrigel 等多種方法均成功誘導 SHG44 細胞形成 VM。同時，我們根據張熙等[7]的報道在 SHG44培養基中加入 CoCl2，制造化學缺氧環境，也成功誘導其形成 VM。這表明能否形成 VM 可能與腫瘤細胞自身的性質關系并不大，腫瘤所處的微環境才是 VM 形成的關鍵因素。在一定的條件下，腫瘤細胞會根據微環境改變自身的形態及行為。

另外，我們還檢測了 SHG44 腫瘤細胞在形成VM 過程中 VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF及 TNF-α的表達變化。這些因子已證實在內皮細胞依賴的血管形成的過程中起著重要作用。據報道，這些因子在具有不同 VM 形成能力的細胞中表達量也有明顯差異，與細胞形成 VM 的能力相關[15]。本實驗結果顯示，以上因子在各處理組的表達量與對照組相比均有明顯增高，但尤其以 VEGF、TGF-β 和PDGF 這三種因子與 VM 形成能力具有相關性。同時，我們通過明膠酶譜檢測還發現，應用 CoCl2制造缺氧環境時，MMP-2 和 MMP-9 的活性明顯增高，表明 MMP-2 和 MMP-9 是微環境改變的重要指標。但是，僅 MMP-2 活性與 VM 形成能力具有相關性，表明 MMP-2 及 MMP-9 可能是VM 形成的充分條件之一而非必要條件。由此我們推測，缺氧微環境中 VEGF、TGF-β 和 PDGF 三因子濃度及 MMP-2 活性在誘導低惡性度腫瘤細胞形成 VM 的過程中起重要作用，但其機制目前尚不完全清楚，需要進一步探索。結合既往文獻，我們推測缺氧誘導因子（HIF）可能是微環境中誘導 VM 形成的關鍵因素[16]。

根據本實驗的結果，我們認為在治療腫瘤時一旦采取僅僅針對血管內皮細胞的血管抑制治療，由于血供減少，腫瘤細胞必然會處于缺氧環境。但是，腫瘤細胞為了滿足自身的營養需要，就可能形成VM，重新向腫瘤細胞提供營養。這不但不能殺死腫瘤，還會導致腫瘤侵襲性和惡性度增加，導致病程急劇進展[17]。因此，進一步了解腫瘤細胞所處的微環境對腫瘤細胞供血的改變有助于我們更好地應用抗血管生成療法，并且提示我們通過改變腫瘤細胞的缺氧微環境才能在早期徹底切斷腫瘤供血，達到抑制腫瘤生長甚至“餓死”腫瘤的效果。

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Influence of tumor microenvironment on vasculogenic mimicry formation in glioma

LING Geng-qiang,MA Dong-ying,HE Rui-xing,WANG Yue-na,YE Wei

ObjectiveTo study the influence of tumor microenvironment on vasculogenic mimicry (VM) formation in glioma.MethodsWe induced VM formation in glioma cell line SHG44 by three ways,including creating a chemical hypoxic environment,adding U251 cell culture supernatant and preteating Matrigel with U251.Then,we detected the expression of VEGF,TGF-β,bFGF,PDGF and TNF-α in the supernatant of each culture.The MMP activities were also tested.ResultsVM network formed by SHG44 was successfully induced in all the groups.The capability of VM formation was different among the three groups,with the best result seen in the hypoxic group.In the other two groups,the group with U251 supernatant was better than the Matrigel pretreatment by U251 group.Expression of VEGF,TGF-β and PDGF in each group were correlated with capability of VM formation.MMP-2 activity was also correlated with capability of VM formation.ConclusionVM formed by glioma cells might be induced by multi-factor in the hypoxic tumor microenvironment.Expression of VEGF,TGF-β,PDGF and MMP-2 were correlated with VM formation in glioma.

Glioma; Vasculogenic mimicry; Tumor microenvironment; Hypoxia; Antiangiogenic therapy

LING Geng-qiang,Email:lgq1013@sina.com

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12541412）

150081 哈爾濱醫科大學附屬第二醫院神經外科

凌耿強，Email：lgq1013@sina.com

2016-12-03

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.006

方法通過制造化學缺氧環境、添加 U251 上清和用 U251細胞預處理 Matrigel 等 3 種方法誘導膠質瘤細胞 SHG44形成 VM，并檢測上述幾種培養基上清中的血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板源生長因子（PDGF）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達與對照組 SHG44 細胞的差異，同時比較組間基質金屬蛋白酶（MMP）活性水平。

結果幾種方法均能誘導 SHG44 細胞形成 VM 結構，其中缺氧組 VM 形成能力最強，添加 U251 上清組次之，U251 細胞預處理 Matrigel 組最弱，且幾個處理組上清中的 VEGF、TGF-β 和 PDGF 濃度與各組 VM 形成能力相關，MMP-2 活性也與 VM 形成能力相關。

結論膠質瘤 VM 形成很可能是微環境改變后多種因素作用的結果，其中 VEGF、TGF-β、PDGF、MMP-2 與 VM形成關系具有相關性。

Author Affiliation:Department of Neurosurgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150081,China