人胎盤間充質干細胞微環境對心肌細胞增殖的影響

章毅，陳亮，李萍，許惠利，王哲，伍婷，張澄宇

人胎盤間充質干細胞微環境對心肌細胞增殖的影響

章毅，陳亮，李萍，許惠利，王哲，伍婷，張澄宇

目的觀察胎盤間充質干細胞微環境對心肌細胞增殖的影響。

肌細胞，心臟； 細胞微環境； 胎盤間充質干細胞

隨著人類對間充質干細胞的生物學特性及研究進一步加深，已從骨髓、外周血、脂肪等組織中成功分離鑒定出間充質干細胞。胎盤作為胚胎發育期間維系母體和胎兒營養物質交換和氧氣運輸的重要臨時性器官，富含大量的間充質干細胞，其在胎兒娩出時即完成最后使命，成為“醫療廢棄物”，對其研究和臨床應用不涉及任何倫理道德問題，目前已經成為尋找人間充質干細胞的新來源，并成為臨床應用效果研究的新熱點。利用人胎盤間充質干細胞（placenta derived mesenchymal stem cell，pMSC）增殖分化這一潛能，進行心肌細胞再生修復，心肌細胞損傷修復并進一步修復心臟功能，也已成為心臟病等心血管疾病治療的一種新醫療手段。人胎盤間充質干細胞為再生受損組織器官提供了巨大的希望，但受其有效性、尚不清楚的機制、缺血環境中移植細胞的生存問題等諸多因素的阻礙。因此，開發無細胞組分如人胎盤間充質干細胞微環境制劑部分替代干細胞治療顯得尤為重要。本文從胎盤組織絨毛膜中分離鑒定獲得間充質干細胞，采用人胎盤間充質干細胞培養基上清模擬胎盤間充質干細胞微環境，觀察人胎盤間充質干細胞微環境對心肌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

胎盤采集于足月健康新生兒，符合國家相關法律和倫理委員會規定，經產婦或家屬簽署知情同意書后獲得。成脂、成軟骨、成骨誘導套裝購自美國Gibco 公司；CCK8 試劑盒購自碧云天公司；PI、RNase A 購自美國 Sigma 公司；MSC Phenotyping kit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP） 購 自 德 國Miltenyi Biotec 公司；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液購自南京建成公司；H9C2 細胞購自中科院細胞庫；transwell 小室購自美國Thermofisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSC 的分離培養 無菌條件下剪取胎盤絨毛膜組織，剪成約 5 mm3的碎塊，加入 II 型膠原酶恒溫消化 1.5 h，室溫 2000 r/min 離心 10 min，加入含 10% FBS 的培養液重懸細胞，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養箱內進行培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，待細胞融合度達到80%～90% 時，胰酶消化傳代，每 2～3 天傳代1 次，倒置顯微鏡下觀察 pMSC 形態并拍照記錄。

1.2.2 pMSC 表面抗原檢測 取 pMSC，用1 ml PBS 調整細胞總數為 5×106，分別加入標記抗體 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作為同型對照，室溫避光孵育 30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.3 pMSC 三向分化檢測 取對數生長期的pMSC，以 1×105/ml 密度接種于 6 孔板中，置于37 ℃、體積分數為 5% 的 CO2恒溫培養箱中培養24 h，待細胞融合度達到 60%～70% 時，分別更換為成脂、成軟骨及成骨誘導分化培養基，每 3 天換液。誘導 14 d 后，成脂誘導、成軟骨誘導、成骨誘導分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅S 染液染色，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 pMSC 培養基上清收集及與心肌細胞共培養 選擇對數期生長的 pMSC 進行消化傳代，于10 mm×10 mm 的細胞培養皿中培養，每 2 天換液，觀察細胞生長形態，待細胞生長密度達到 80%～ 90% 收集細胞培養基上清待用。

1.2.5 Transwell 共培養及 H9C2 生長狀態觀察 將對數生長期 H9C2 細胞以 5×104/ml 密度接種于 6 孔 transwell 板下室中，上室處理共分6 組，分別加入 2 ml 10% FBS 的 DMEM 培養基、2 ml pMSC-CM、2 ml 5×104/ml 的 pMSC；4 ml 10% FBS 的 DMEM 培養基、4 ml pMSC-CM、4 ml 1×105/ml 的 pMSC。每個處理設置 3 個重復。共培養 72 h，倒置顯微鏡下觀察 transwell 下室心肌細胞生長狀態并拍照記錄。

1.2.6 細胞增殖檢測 將上述 6 組共培養處理72 h 后的心肌細胞分別計數處理，以 5×104/ml密度種于 96 孔細胞培養板（100 μl/孔）中，每個處理設置 6 個復孔，在 37 ℃，5% CO2恒溫細胞培養箱中連續培養 24、48 h，每孔加入 10 μl CCK8工作液，置于 37 ℃，5% CO2恒溫細胞培養箱反應 2 h，在酶聯免疫檢測儀檢測 450 nm 處各孔吸光值（A）。心肌細胞增殖率=（A實驗組/A對照組– 1）×100%。

1.3 統計學處理

流式檢測結果采用 FlowJo 7.6.1 軟件分析結果。采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進行作圖、統計學分析，實驗數據用±s表示，組間比較采用one-way ANOVA 分析。以 P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 pMSC 形態及表面抗原鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養的 pMSC接種 48 h 后，大部分細胞貼壁，形態為典型成纖維細胞樣，3～5 d 可發現貼壁細胞增殖形成細胞島，6～9 d 后所有細胞島匯合成單細胞層鋪滿全皿，均為長梭形，細胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長，中間散在些透亮圓形雜細胞（圖 1）。

間充質干細胞表型抗原標志物流式細胞術檢測結果發現，本實驗原代分離獲得的 pMSC 表面標記物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+細胞數百分比含量為 0.13%；同時間充質干細胞相關抗原CD73、CD90、CD105 陽性細胞數百分比表達率分別為 99.86%、99.87%、99.71%。提示本實驗分離獲得了高純度的人胎盤間充質干細胞，可用于后續實驗（圖 2）。

2.2 pMSC 三向分化鑒定

pMSC 成脂誘導 14 d，油紅 O 染色結果顯示，細胞胞漿周圍均含有大小不等的脂滴，脂滴被染成紅色。隨著誘導天數的增加，細胞形態未發生改變，仍為梭形，誘導成脂肪細胞的數目增多；pMSC 成骨誘導 14 d 結果顯示，茜素紅 S 染色結果顯示，細胞出現大量橘紅色沉淀，呈圓形或類圓形或堆積成片狀，有明顯的“礦化”結節形成且數量上呈遞減趨勢。pMSC 成軟骨誘導 14 d，倒置相差顯微鏡下觀察細胞貼壁良好，細胞扁平伸展，由長梭形變成多邊多角形態，具有軟骨細胞樣的形態，Masson 染色結果顯示細胞膠原纖維呈現藍紫色（圖 3）。

圖2 人胎盤間充質干細胞流式鑒定（A：總顆粒散點分布圖；B：活細胞；C：陰性對照染色；D～F：CD105+、CD90+、CD73+細胞比例；G：細胞比例統計）Figure 2 Characterization of pMSC phenotype through flow cytometry (A:Total particles scatter diagram; B:Alive cells; C:Negative staining; D-F:CD105+,CD90+,CD73+cells ratio; G:Cell ratio analysis)

圖3 人胎盤間充質干細胞成脂（油紅 O 染色）、成骨（茜素紅 S 染色）、成軟骨（Masson 染色）分化鑒定Figure 3 Adipogenic,osteogenic and chondrogenic differentiation of pMSC characterized by oil red O staining,alizarin red S and Masson staining,respectively

圖4 pMSC 微環境及 pMSC 對 H9C2 心肌細胞生長狀態的影響（A：上室/下室 pMSC 細胞數量或培養基體積比為 1∶1；B：上室/下室 pMSC 細胞數量或培養基體積比為 2∶1）Figure 4 Effects of pMSC conditioned medium on the growth of H9C2 (A：Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=1∶1; B:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1)

上下室培養基體積 1∶1 和 2∶1 中對照組H9C2 細胞生長速度均相對緩慢，培養 24 h 后匯合率為 50% 左右，上下室培養基體積 1∶1 和 2∶1胎盤間充質干細胞微環境處理組，H9C2 心肌細胞與對照組相比，細胞匯合率顯著增加，匯合率達80%～90%，與胎盤間充質干細胞共培養處理組無顯著差異。結果顯示，胎盤間充質干細胞微環境與胎盤間充質干細胞一樣，顯著促進了 H9C2 心肌細胞的增殖，同時，微環境添加比例 1∶1 效果最佳（圖 4）。

2.4 CCK8 法檢測心肌細胞增殖

進一步 CCK8 細胞增殖檢測結果顯示（圖 5和表 1），微環境干預組，當上室培養基體積與下室培養基體積比例為 1∶1 時，與對照組相比，胎盤間充質干細胞微環境顯著促進了 H9C2 細胞增殖（圖 5），干預后培養 24 和 48 h 后增殖率分別增加 17.99%（P ＜ 0.001）和 15.37%（P ＜ 0.001）；當上室培養基體積與下室培養基體積比例為 2∶1時，24 和 48 h 增殖率相比對照組僅分別增加10.87%（P ＜ 0.05）和 10.28%（P ＜ 0.001）；胎盤間充質干細胞干預組，上室胎盤間充質干細胞與下室 H9C2 心肌細胞按 1∶1 共培養時，與對照組相比，24 和 48 h 增殖率分別增加 26.23%（P ＜ 0.01）和 15.97%（P ＜ 0.01），上室胎盤間充質干細胞與下室 H9C2 心肌細胞按 2∶1 共培養時，24 和48 h 增殖率與對照組相比分別增加 20.13%（P ＜0.001）和 8.49%（P ＜ 0.001）。由結果可看出，胎盤間充質干細胞微環境能顯著促進 H9C2 心肌細胞的增殖，與胎盤間充質干細胞作用相當，且胎盤間充質干細胞微環境干預處理有最優劑量選擇。本實驗結果提示，胎盤間充質干細胞微環境干預處理體積與 H9C2 培養體積為 1∶1 對心肌細胞增殖的促進作用顯著優于體積比為 2∶1 的干預體系；胎盤間充質干細胞和胎盤間充質干細胞微環境對心肌細胞促增殖作用具有一定的時間效應，處理 24 h時，胎盤間充質干細胞的促心肌細胞增殖作用高于胎盤間充質微環境，但在處理 48 h 時，兩者無顯著差異。提示，隨著干預時間的增加，胎盤間充質干細胞微環境的促心肌細胞增殖作用與胎盤間充質干細胞達到相同水平。

圖5 H9C2 心肌細胞 CCK8 增殖檢測結果（A：上室 pMSC∶下室 H9C2 細胞數量或培養基體積比為 1∶1，24 h；B：上室 pMSC∶下室 H9C2 細胞數量或培養基體積比為 1∶1，48 h；C：上室 pMSC∶下室 H9C2 細胞數量或培養基體積比為 2∶1，24 h；D：上室 pMSC∶下室 H9C2 細胞數量或培養基體積比為 2∶1，48 h；*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001，nsP＞ 0.05）Figure 5 H9C2 cell proliferation detection by CCK8 method (A:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=1∶1,24 h; B:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC :up chamber vs down chamber=1∶1,48 h; C:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1,24 h; D:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1,48 h;*P＜ 0.05,**P＜ 0.0l ,***P＜ 0.001,nsP＞ 0.05)

表1 H9C2 心肌細胞增殖率結果分析（%）Table 1 H9C2 cell proliferation rate analysis (%)

3 討論

在心肌損傷修復的研究中，心肌細胞增殖及再生是心肌損傷修復的關鍵。間充質干細胞是一種具有高度自我更新能力與多向分化潛能的多能干細胞，目前已應用于臨床治療自身免疫性疾病、心肌損傷性疾病、神經損傷性疾病等，然而其治療機制尚不明確。細胞移植是一種有希望的組織再生的治療手段。多種類型的細胞已經用于動物心肌損傷的修復中，包括胚胎干細胞、胚胎和新生動物的心肌細胞、骨骼肌成肌細胞、骨髓干細胞、脂肪來源的干細胞、可誘導的多能干細胞等。但是，這些用于移植的細胞對機體環境具有一定的限制性要求，當在低氧低血環境中就存在成活率低、在心臟局部存留少、與宿主心肌細胞不能整合和免疫排斥等問題，這些問題限制了它們的應用。

現已明確，間充質干細胞對創傷皮膚、脊髓損傷、軟骨損傷、神經元損傷、血管內皮損傷等具有修復功能。Rasulov 等[1]2005 年首次采用異體骨髓MSC 移植治療 1 例大面積深度灼傷皮膚損傷，并于細胞移植后 4 d 實施自體皮膚移植術。結果發現，骨髓間充質干細胞可以促進創面愈合過程中血管的生成，縮短患者的康復時間。MSC 不僅可通過促血管生成作用加速創傷皮膚的愈合，同時可以大大降低創傷面炎癥反應，促進新生皮膚細胞募集。2014 年，Liu 等[2]利用間充質干細胞對皮膚灼傷小鼠進行移植，移植后創傷皮膚中 IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎因子顯著降低，同時抑炎因子 IL-10和 TSG-6 顯著升高，皮膚愈合速度大大提升。不僅如此，MSC 對慢性難愈性傷口或遷延不愈的傷口也有很好的療效[3-5]。除了直接將 MSC 以不同方式輸注進行治療外，將 MSC 培養于一些支架材料上后移植到創傷部位，也具有較好的療效[6-7]。此外，根據現有研究報道，不僅骨髓來源的 MSC 具有促進皮膚創傷愈合的作用，其他來源的 MSC，如臍帶間充質干細胞[2,8-10]、臍帶血間充質干細胞[10-11]、脂肪間充質干細胞[12-13]、胎盤間充質干細胞[14]、羊水間充質干細胞[15-16]等也具有較好的治療作用，且在不同個體甚至不同物種間移植時沒有明顯的限制。另有研究人員通過鞘內注射方法對脊髓損傷患者進行了自體骨髓間充質干細胞移植，術后移植患者在術后神經功能得到改善[17-19]。軟骨損傷修復研究表明，植入間充質干細胞后兔子缺損處軟骨和軟骨下骨修復良好[20-22]。且間充質干細胞對人骨、軟骨、肌腱等的損傷修復臨床應用已經廣泛開展，并取得不俗效果，被廣泛報道。體外培養的 MSC 能夠分化為血管內皮細胞這一特定功能已多次被科研工作者證實，并且發現移植的 MSC 能夠向血管損傷部位募集，并進一步分化為內皮細胞，修復損傷血管[23-25]。經耳緣靜脈注射間充質干細胞，能有效抑制椎動脈血管炎癥反應，修復受損椎動脈血管[26-27]。

然而，以往認為間充質干細胞治療潛能是由于MSC 歸巢并分化、代替損傷組織。后來觀察到移植的 MSC 大部分都停留在肝、脾和肺，到達損傷部位的數量小于 1%。在到達靶組織的 MSC 中，大部分幾天后消失，只有少量的 MSC 長期停留在損傷部位。用基因命運圖譜技術顯示再生的細胞來自于模型中存活的固有細胞。這些信息提示，MSC對組織的修復作用可能不是由于其分化能力。另有研究者發現，MSC 的條件培養基（CM）能模擬MSC 修復組織的功能。因此推測 MSC 可能是通過分泌營養因子以內分泌和旁分泌的方式促進組織修復。間充質細胞可以自分泌和（或）旁分泌腦源性神經營養因子、神經生長因子、血管內皮生長因子等多種神經保護性營養因子，這些因子表達上調，可以促進局部微血管再生、神經再生和重構，從而使損傷細胞得以修復。趙貴芳[28]通過實驗發現，間充質干細胞分泌的外泌體可以促進 HaCaT 細胞的增殖及遷移，抑制 caspase 非依賴的線粒體凋亡信號通路，即 AIF-PARP 信號通路促進皮膚創面的修復，在皮膚創傷修復機制上形成了新的突破。

綜上，我們的研究提示，胎盤源間充質干細胞微環境具有心肌損傷修復調節功能。這可能是由于其分泌的營養因子或外泌體所發揮作用，胎盤間充質干細胞培養基上清對心肌細胞增殖的分子機制有待進一步研究，其后期開發較之 MSC 的直接輸注，去除活細胞的培養基上清的應用更為安全，更為高效，可望成為未來細胞治療的新手段，更好發揮 MSC 的臨床治療價值。

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Effects of microenvironment produced by human pMSC on the proliferation of cardiomyocytes

ZHANG Yi,CHEN Liang,LI Ping,XU Hui-li,WANG Zhe,WU Ting,ZHANG Cheng-yu

ObjectiveTo investigate the effect of microenvironment created by human placental mesenchymal stem cells (pMSC) on the proliferation of cardiomyocytes.MethodsThe cultured medium of pMSC was used to simulate the microenvironment produced by pMSC and co-culture with cardiomyocytes (H9C2) through the method of transwell experiment (the microenvironment group).At the same time,the DMEM medium containing 10% FBS and pMSC/H9C2 transwell group were treated as blank and positive control,respectively.After 72 h,the cell proliferation and morphology were observed under microscope.Then H9C2 cells were digested by trypsin to plant 96-well plate with cell concentration of 5×106/ml.CCK8 test was carried out at 24 and 48 h after cell seeding,respectively.ResultsCompared with the control group,H9C2 cells grew more rapidly in the microenvironment group after 72 h of co-culture.The density of H9C2 reached 80%,significantly higher than that in the control group.There was no significant difference between the medium group and pMSC group.CCK8 cell proliferation assay at 24 and 48 h showed that the values of the microenvironment group and the pMSC group were significant higher than that in the control (P ＜ 0.01).Significant difference was observed betweenthe microenvironment group and pMSC group at 24 h (P ＜ 0.01),while no difference observed between the two groups at 48 h (P ＞0.05).ConclusionBoth microenvironment and pMSC can promote the cell proliferation of H9C2.The results imply that the microenvironment of pMSC is expected to partly take place of the repair function of pMSC in the myocardial injury field.

Myocytes,cardiac; Cellular microenvironment; Placental mesenchymal stem cells

WU Ting,Email:wuting@shanghaicordblood.org

上海市自然科學基金（16ZR1429200）；上海市科委研發平臺專項（16DZ2293000）；嘉定區工程技術研究中心項目；2016 年上海市專利試點企業項目

200051 上海市臍帶血造血干細胞庫/上海市干細胞技術有限公司/中國干細胞集團有限公司

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2016-12-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.009

方法用胎盤間充質干細胞培養基上清模擬胎盤間充質干細胞微環境，與 H9C2 心肌細胞 transwell 共培養（微環境組），觀察其對 H9C2 細胞的生長狀態、細胞增殖影響情況。同時設置 10% FBS 的 DMEM 為空白對照、pMSC/H9C2 transwell 共培養為陽性對照（pMSC 組），倒置顯微鏡觀察心肌細胞增殖狀態；共培養 72 h 后將 H9C2 胰酶消化按5×106/ml 每孔進行 96 孔板鋪板，分別在 24 和 48 h 進行 CCK8 細胞增殖檢測。

結果與對照組相比，胎盤間充質干細胞培養基上清與心肌共培養 72 h 后心肌細胞密度達到 80% 以上，顯著高于對照組，與 pMSC 組無明顯差異。共培養處理后的心肌細胞培養 24 和 48 h 增殖結果均顯示，微環境組與 pMSC 組心肌細胞增殖高于對照組，差異極顯著（P ＜ 0.01），24 h 增殖結果顯示 pMSC 組與微環境組心肌細胞增殖差異極顯著（P ＜ 0.01），而 48 h 增殖結果顯示 pMSC 組與微環境組心肌細胞增殖差異不顯著（P ＞ 0.05）。

結論胎盤間充質干細胞微環境與胎盤間充質干細胞對心肌細胞的增殖均具有顯著的促進作用，提示胎盤間充質干細胞微環境有望部分替代胎盤間充質干細胞的心肌損傷修復治療功能。

Author Affiliation:Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co.,Ltd./China Stem Cell Group Co.,Ltd.,Shanghai 200051,China