調控基因對萬古霉素生物合成的影響

韓婷，魏維，戈梅，錢秀萍

調控基因對萬古霉素生物合成的影響

韓婷，魏維，戈梅，錢秀萍

目的通過對東方擬無枝酸菌的調控基因進行研究及改造以獲得高產萬古霉素的突變株。

萬古霉素； 調節元件，轉錄； 東方擬無枝酸菌

20 世紀 80 年代，由于 β-內酰胺類抗生素的大量使用，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）逐漸流行，目前，萬古霉素是臨床上用于由 MRSA 引起的嚴重感染性疾病的一線藥物，受到人們的重視[1]。東方擬無枝酸菌（Amycolatopsisorientalis）是萬古霉素的產生菌，屬革蘭陽性放線菌，假諾卡菌亞目，假諾卡菌科，擬無枝菌酸菌屬[2]，歷史上曾將其歸為鏈霉菌屬，諾卡菌屬。近年來國內許多學者通過對萬古霉素產生菌的反復自然分離、物理化學方法誘變和發酵條件優化等途徑提高其產量[3-5]。

隨著生物化學、分子生物學等的發展，萬古霉素產生菌的分子信息越來越清晰，2014年，Xu等[6]對一株萬古霉素高產菌東方擬無枝酸菌HCCB10007 進行了全基因組測序，就其基因序列與已報道的基因序列比對與分析，推測到有 10%的基因編碼調控蛋白，本研究從中選取了AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 六個基因進行過表達實驗，考察這六個調控基因對萬古霉素合成的作用。AORI_1475 推測為 strR 型轉錄調控基因，可能與Amycolatopsisbalhimycina 中的 bbr（strR 型轉錄調控基因）一樣起正調控作用[7]。AORI_1832、AORI_2956 和 AORI_3531 推測為 araC 型轉錄調控基因，可能也具有正調控作用，因為有文獻報道 araC 型的 rapG 正調控雷帕霉素（產生菌為鏈霉菌屬）的合成[8]。AORI_3398、AORI_7412 推測為 lysR 型調控基因，lysR 被認為是全局轉錄調控基因，一般作為激活子或阻遏子起作用。微生物的次級代謝途徑受許多調控基因影響，通過對HCCB10007 中數個調控基因的研究，確定其對萬古霉素合成的影響，為提高萬古霉素產量，減少副產物的發酵工藝完善提供重要的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質 粒 東方擬無枝酸菌HCCB10007、E.coli JM110 由上海來益生物藥物研發中心保藏，E.coli DH5α 購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒 pLYW2（pSET152含有 ermEp*啟動子）由上海來益生物藥物研發中心提供，pMD19-Tsimple vector 購自日本 Takara 公司。

1.1.2 培養基 LB 培養基、TSB 培養基、高氏1 號培養基、本氏培養基、種子培養基及發酵培養基配方參見文獻[9]。

1.2 實驗方法

1.2.1 六個調控基因的調取及驗證 參考文獻[10]提取 HCCB10007 基因組，采用 PCR 方法調取六個調控基因，所用引物見表 1，亞克隆后測序驗證。

1.2.2 調控基因過表達質粒的構建 利用Nde I/Xba I 酶切調取到的調控基因和質粒pLYW2，并用 T4 連接酶連接起來，構建過表達質粒 pLYW2-1475、pLYW2-1832、pLYW2-2956、pLYW2-3531、pLYW2-3398、pLYW2-7412，構建流程如圖 1 所示。

1.2.3 過表達菌株的構建與驗證 文獻報道東方擬無枝酸菌存在限制-修飾（R-M）系統[11]，因此先將構建好的過表達質粒電轉進 E.coli JM110，再將JM110 轉化子中的過表達質粒電轉入東方擬無枝酸菌 HCCB10007。

1.2.4 過表達菌株的發酵及發酵產物的驗證 發酵培養條件參考文獻[12]。發酵液用 4 mol/L 的HCl 調 pH 至 4～4.5，4 ℃ 高速離心，取上清液于 HPLC 檢測。

表1 本實驗所用 PCR 擴增引物Table 1 PCR primers used in this study

2 結果

2.1 六個調控基因的調取及驗證

PCR 方法成功提取到 HCCB10007 基因組，調取到的調控基因經測序驗證正確。

2.2 調控基因過表達質粒的構建與驗證

抽提 JM110 轉化子的過表達質粒，Pst I 酶切驗證，經計算，pLYW2-1475、pLYW2-2956、pLYW2-3398、pLYW2-7412 應切出約 0.8、2.6、3.5 kb 三條帶；LYW2-1832 應切出約 0.8 和 2.6 kb兩條帶；pLYW2-3531 應切出約 0.8、0.9、2.6 kb 三條帶。實際酶切結果如圖 2 所示，與理論值相符。

2.3 過表達菌株的構建與驗證

挑取東方擬無枝酸菌轉化子于 TSB 液體培養3 d，菌液 PCR 驗證，由于調控基因本就來自HCCB10007，所以 PCR 驗證時，設計引物將質粒上紅霉素啟動子基因 ermP 與調控基因一起PCR，得到的條帶應約為 1.2 kb。實際 PCR 結果如圖 3 所示，由此可證實已獲得調控基因過表達菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531、HHT3398 和 HHT7412。

2.4 過表達菌株的發酵及發酵產物的驗證

過表達菌株發酵 5 d，發酵液預處理后經HPLC 分析。分析檢測結果如圖 4 所示，過表達菌株 HHT1475、HHT1832、HHT2956、HHT3531 的萬古霉素峰面積均高于 HCCB10007，特別是HHT1475 和 HHT1832 分別提高了 55% 和51%，HHT2956 和 HHT3531 分別提高了 18% 和29%，而 HHT3398 和 HHT7412 卻下調了萬古霉素的量，都降低了 12% 左右。可以初步判斷，AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531在萬古霉素合成中起正調控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 起負調控作用，而且 AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的調控作用不明顯。

圖1 過表達質粒構建流程Figure 1 Construction of overexpression plasmids

圖2 過表達質粒 Pst I 酶切驗證Figure 2 Overexpression plasmids digestion by Pst I

圖3 過表達菌株 PCR 驗證Figure 3 Mutants verification by PCR

圖4 HCCB10007 和過表達菌株的萬古霉素和無糖萬古霉素的產量Figure 4 Product of HCCB10007 and other overexpression strains

對其他發酵產物分析發現，過表達菌株HHT1475 的無糖萬古霉素的產量約為 HCCB10007的 5 倍，HHT1832 約為 HCCB10007 的 7 倍，其他菌株與原始菌株 HCCB10007 相差不大。

3 討論

根據生物信息分析，萬古霉素基因簇位于基因組的核心區，共編碼 35 種酶（AORI_1471 到AORI_1505）。AORI_1475 推測為 strR 型調控基因，存在于萬古霉素合成基因簇內[6]，為萬古霉素合成途徑特異性調控基因，這可能是 AORI_1475明顯提高萬古霉素產量的原因之一。作為可能的全局性調控基因，AORI_1832 位于萬古霉素合成基因簇外，但非常靠近合成簇，所以其也明顯上調了萬古霉素的產量。根據其他發酵產物量的變化，推測這兩個基因是通過調控萬古霉素的前體——無糖萬古霉素的合成來調控萬古霉素的產量，但具體怎樣調控還需進一步研究。AORI_2956、AORI_3531、AORI_3398、AORI_7412 的調控作用都比較弱，可能有兩個原因：①這四個基因距離萬古霉素基因簇比較遠，可能是間接調節基因簇中的某個基因或者調節其他次級代謝途徑。②可能存在反饋調節。萬古霉素生物合成是由一個復雜的代謝網絡調控而成的，怎樣從調控基因入手，提高萬古霉素的生物合成，還需更詳細的研究。

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Effect of several regulatory genes on the biosynthesis of vancomycin

HAN Ting,WEI Wei,GE Mei,QIAN Xiu-ping

ObjectiveThe objective of this study was to obtain the mutant strains with high productivity of vancomycin through studying and transformation of regulatory genes in Amycolatopsisorientalis.MethodsSix putative regulatory genes AORI_1475,AORI_1832,AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 and AORI_7412 were selected based on DNA sequence analysis of HCCB10007 genome,and overexpressed in this study,respectively.ResultsThe yields of vancomycin of the first four overexpressed strains were increased by 55%,51%,18%,29% while the last two were reduced by about 12%.ConclusionAORI_1475,AORI_1832,AORI_2956 or AORI_3531 plays positively regulatory roles in vancomycin synthesis while AORI_3398 and AORI_7412 negatively regulate the synthesis.Furthermore,the regulatory role of AORI_2956,AORI_3531,AORI_3398 or AORI_7412 is weak.

Vancomycin; Regulatory elements,transcriptional; Amycolatopsisorientalis

QIAN Xiu-ping,Email:qianxp@sjtu.edu.cn

國家高技術研究發展計劃（863 計劃）（2012AA02A706）

200240 上海交通大學藥學院（韓婷、魏維、錢秀萍）；201203上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司（魏維、戈梅）

錢秀萍，Email：qianxp@sjtu.edu.cn

2016-11-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.005

方法選取經基因組測序分析獲得的 6 個推測具有調控作用的基因：strR 型的 AORI_1475、araC 型的AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 和 lysR 型的 AORI_3398、AORI_7412 進行過表達實驗。

結果發現 AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 的過表達分別將萬古霉素產量上調了 55%、51%、18%、29%，而 AORI_3398、AORI_7412 卻使萬古霉素產量下降了 12% 左右。

結論初步判斷 AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531 對萬古霉素合成有正調控作用，而 AORI_3398、AORI_7412 對萬古霉素合成起負調控作用。

Author Affiliations:School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China (HAN Ting,WEI Wei,QIAN Xiu-ping); Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D,Shanghai 201203,China (WEI Wei,GE Mei)