黃芩苷抗丙型肝炎病毒的活性研究

李健蕊，陳金花，李虎，董飚，馬雪梅，彭宗根

黃芩苷抗丙型肝炎病毒的活性研究

李健蕊，陳金花，李虎，董飚，馬雪梅，彭宗根

目的研究黃芩苷抗丙型肝炎病毒（HCV）的活性。

肝炎病毒屬； 黃芩苷； 蛋白酶抑制藥； 藥物協(xié)同作用

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬[1]，是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，呈全球性流行。近年來(lái)，國(guó)外多個(gè)靶向 HCV 復(fù)制酶的直接抗病毒藥物（DAA）已經(jīng)相繼進(jìn)入臨床應(yīng)用，大幅度地提高了患者的治愈率[2]，但由于 HCV RNA 聚合酶沒(méi)有校正功能，HCV 快速?gòu)?fù)制易導(dǎo)致耐藥突變，使治療無(wú)效或反彈[3-5]，因此研發(fā)新的抗 HCV 藥物刻不容緩。我們?cè)趯ふ铱?HCV 藥物的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物黃芩苷（baicalin）具有抗 HCV 蛋白酶的活性。黃芩苷具有廣泛的藥理作用，除抗炎、抗癌、抗氧化及解熱作用外，還具有抗呼吸道合胞病毒、新城疫病毒、流感病毒、登革熱病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等病毒的作用[6-11]，但未見(jiàn)黃芩苷有抗HCV 活性的報(bào)道。本文利用本實(shí)驗(yàn)室建立的一系列抗 HCV 藥物研發(fā)模型分析了黃芩苷的抗 HCV活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 人肝細(xì)胞系 Huh7.5 細(xì)胞為美國(guó) Vertex 制藥公司惠贈(zèng)；感染性 HCV 病毒株為 J6/JFH-1/JC，本實(shí)驗(yàn)室將含有重組全長(zhǎng) HCV cDNA 的 pFL-J6/JFH/JC1 質(zhì)粒（美國(guó) Vertex 制藥公司惠贈(zèng)）經(jīng) Xba I 酶切純化，得到 HCV cDNA，經(jīng) T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄得到 HCV RNA，轉(zhuǎn)染正常 Huh7.5 細(xì)胞，收集上清獲得具有感染性的病毒液[12]。感染性 HCV 突變株 A156T、D168V 和S282T 為 J6/JFH-1/JC 的定點(diǎn)突變株，按照野生型方法制備具有感染性的 HCV 突變病毒。

1.1.2 藥物、抗體及底物 黃芩苷和黃芩素（baicalein）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；特拉匹韋（telaprevir）、西咪匹韋（simeprevir）和索非布韋（sofosbuvir）三種原料藥物均購(gòu)自MedChemExpress 公司。小鼠抗 β-actin 單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；HCV Core 蛋白單克隆抗體（抗體號(hào) ab2740）、HCV NS3 蛋白單克隆抗體（抗體號(hào) ab13830）購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司?？剐∈?IgG HRP-linked 購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling公司；HCV Protease 底物 FRET Substrate（RET S1）購(gòu)自美國(guó) AnaSpec 公司；HCV Helicase 底物（Cy5 top strand：5'-/CY5/CCTACGCCACCAGCTCCGTA GG/BHQ/-3' 和 HairpinCy5 bottom strand：5' CCTA CGGAGCTGGTGGCGTAGG(T)203'）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 主要試劑 DMEM、胎牛血清、Penicillin-Streptomycin 雙抗、PBS 和 0.05%-EDTA胰酶均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒 AgPath-ID one-step RT-PCR kit 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；CytoBusterTM細(xì)胞蛋白提取液購(gòu)自美國(guó) Novagen 公司；30% 丙烯酰胺溶液購(gòu)自美國(guó) Bio-Red 公司；PVDF 膜和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；1.5 mol/L Tris-Cl（pH 8.8）和 1 mol/L Tris-Cl（pH6.8）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化合物抑制 HCV-NS3/4A 蛋白酶活性的測(cè)定 采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）法[13]，以特拉匹韋作為陽(yáng)性對(duì)照藥，檢測(cè)化合物抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶活性，并用 Reed-Muench 法計(jì)算化合物抑制蛋白酶活性的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.2 化合物抑制解旋酶活性的測(cè)定 應(yīng)用FRET 法檢測(cè) HCV NS3 解旋酶活性[14]。96 孔熒光酶標(biāo)反應(yīng)板中反應(yīng)體積為 200 μl，緩沖液 pH值為 7.0，底物終濃度為 5 nmol/L，酶終濃度為5 μg/ml，ATP 的終濃度為 2.5 mmol/L。在 22 ℃開(kāi)始反應(yīng)，熒光檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)前后的熒光信號(hào)（ex=620，em=665），計(jì)算化合物對(duì)解旋酶的抑制率。抑制率（%）=（酶對(duì)照熒光強(qiáng)度 – 加藥熒光強(qiáng)度）/（酶對(duì)照熒光強(qiáng)度 – 空白對(duì)照熒光強(qiáng)度）×100%。

1.2.3 化合物對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 用 MTT 染色法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性[15]。Huh7.5 細(xì)胞以 3×104個(gè)/cm2的密度種入 96 孔板培養(yǎng)。藥物處理細(xì)胞 72 h 后，每孔加入 10 μl 濃度為 5 μg/ml 的MTT 溶液，4 h 后，每孔加 100 μl DMSO，室溫振蕩孵育 10 min，測(cè)定 570 nm 處的吸光值。用Reed-Muench 法計(jì)算化合物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）。

1.2.4 化合物在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗 HCV 活性的檢測(cè) Huh7.5 細(xì)胞以 3×104個(gè)/cm2的密度接種到6 或 96 孔板中。培養(yǎng) 24 h 后，感染野生型或A156T、D168V 和 S282T 耐藥突變 HCV，用45 IU/細(xì)胞的病毒感染量，同時(shí)加藥物處理。培養(yǎng)72 h后，用 RNeasy mini kit 提取細(xì)胞總 RNA，用細(xì)胞蛋白提取液提取細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞內(nèi) HCV RNA 水平用 qRT-PCR 法檢測(cè)[16]。細(xì)胞內(nèi) HCV Core 及 NS3 蛋白的表達(dá)水平用 Western blot 檢測(cè)[17]。結(jié)果中蛋白條帶信號(hào)密度值用 Gelpro 32 軟件掃描分析，并以對(duì)照組中目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值為 1.00 作標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.5 黃芩苷與已知抗 HCV 藥物聯(lián)用抗 HCV作用 Huh7.5 細(xì)胞以 3×104個(gè)/cm2的密度接種到 6 孔板中。24 h 后分別給予單劑量的黃芩苷、索非布韋、西咪匹韋、黃芩苷與索非布韋聯(lián)用或黃芩苷與西咪匹韋聯(lián)用，并同時(shí)用 HCV 病毒上清液感染 Huh7.5 細(xì)胞。感染 72 h 后提取總蛋白，用Western blot 法檢測(cè) HCV Core 蛋白。用金正均 q值法[18]判斷藥物聯(lián)用后的作用性質(zhì)。q=Ea+b /（Ea+Eb–Ea×Eb），Ea 為 A 藥單獨(dú)給藥時(shí)藥效，Eb為 B 藥單獨(dú)給藥時(shí)藥效，Ea+b 為兩藥聯(lián)用時(shí)藥效，q=1為相加作用，q ＞ 1為協(xié)同作用，q ＜ 1為拮抗作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶的活性

FRET 法測(cè)定結(jié)果（圖 1）顯示，黃芩苷在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶的IC50值為（74.43 ± 1.16）μmol/L，陽(yáng)性藥特拉匹韋抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶的 IC50值為（0.13 ± 0.13）μmol/L。黃芩素是黃芩苷的苷元，其對(duì) HCV NS3/4A 蛋白酶也具有抑制作用[IC50值為（24.13 ± 3.75）μmol/L]。

2.2 黃芩苷對(duì) HCV NS3 解旋酶無(wú)抑制活性

FRET 法分析黃芩苷對(duì) HCV NS3 解旋酶的抑制作用顯示，黃芩苷對(duì) HCV NS3 解旋酶沒(méi)有抑制活性（表 1）。

2.3 黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)具有抗 HCV 感染活性

由于黃芩苷在體外無(wú)細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)中有特異性抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶的活性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析其在 Huh7.5 細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗野生型 HCV感染的活性。結(jié)果見(jiàn)圖 2A，黃芩苷對(duì) Huh7.5 細(xì)胞的 CC50為（781.667 ± 144.140）μmol/L，EC50為（31.306 ± 9.559）μmol/L，并呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，選擇指數(shù)（SI）為 25。陽(yáng)性藥特拉匹韋也具有較強(qiáng)的抗 HCV 作用（圖 2B）。隨后，我們?cè)诘鞍姿缴蠈?duì)黃芩苷的抗 HCV 活性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果如圖 3 所示，黃芩苷給藥處理 72 h 后，細(xì)胞內(nèi)HCV Core 和 NS3 蛋白均顯著降低，且隨給藥濃度增加其抑制活性增強(qiáng)，說(shuō)明黃芩苷確有抗 HCV的作用。

圖1 化合物抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶活性（A：黃芩素；B：黃芩苷；C：陽(yáng)性對(duì)照特拉匹韋）Figure 1 Compounds inhibited HCV NS3/4A serine protease activity detected with FRET assay (A:Baicalein; B:Baicalin; C:Positive compound telaprevir)

表1 黃芩苷對(duì) HCV NS3 解旋酶的抑制活性Table 1 Baicalin did not inhibit HCV NS3 helicase activity detected with FRET

圖2 黃芩苷（A）和特拉匹韋（B）在 Huh7.5 細(xì)胞內(nèi)抗 HCV 感染的活性Figure 2 Baicalin (A) and telaprevir (B) inhibited HCV replication at RNA level in Huh7.5 cells with no cytotoxicity

2.4 黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì) HCV 耐藥突變株的抑制活性

D168V 和 A156T 是臨床上報(bào)道最多的針對(duì)NS3/4A 蛋白酶抑制劑的耐藥突變株，分別對(duì)西咪匹韋和特拉匹韋耐藥，S282T 突變則是針對(duì)多聚酶抑制劑索非布韋的耐藥突變株[19]。為分析黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì) HCV 耐藥突變株的抑制活性，分別用野生型（WT）HCV 和耐藥突變型 HCV 感染Huh7.5 細(xì)胞，同時(shí)用陽(yáng)性藥和黃芩苷處理細(xì)胞72 h 后，結(jié)果見(jiàn)表 2。

圖3 黃芩苷在 Huh7.5 細(xì)胞內(nèi)抗 HCV 感染的活性Figure 3 Baicalin inhibited HCV replication at protein level in Huh7.5 cells

表2 藥物在 Huh7.5 細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)野生型和突變型 HCV 的抑制作用Table 2 Compounds inhibited HCV replication against WT and mutant type HCV in Huh7.5 cells

圖4 黃芩苷在 Huh7.5 細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)與索非布韋（A）或西咪匹韋（B）聯(lián)合抗 HCV 的作用（Con：溶劑對(duì)照組；Bac：25 μmol/L 黃芩苷；Sof：0.05 μmol/L 索非布韋；Sim：0.01 μmol/L 西咪匹韋）Figure 4 Baicalin inhibited HCV replication with sofosbuvir (A) or simeprevir (B) in Huh7.5 cells (Con:Control; Bac:25 μmol/L baicalin; Sof:0.05 μmol/L sofosbuvir; Sim:0.01 μmol/L simperivir)

特拉匹韋對(duì) A156T 突變株 HCV 的抑制作用明顯弱于對(duì)野生型 HCV 的抑制作用，耐藥倍數(shù)高達(dá) 43 倍，說(shuō)明 A156T 突變株對(duì)特拉匹韋耐藥。而黃芩苷對(duì)野生型和 A156T 突變型 HCV 抑制作用無(wú)顯著性差異，提示黃芩苷對(duì) A156T 耐藥突變病毒具有高耐藥屏障。

西咪匹韋對(duì)野生型和 D168V 突變型 HCV的抑制作用具有明顯差異，其耐藥倍數(shù)為 41 倍，說(shuō)明 D168V 突變型 HCV 對(duì)西咪匹韋耐藥。而黃芩苷對(duì)野生型和 D168V 突變型 HCV 的抑制作用則無(wú)明顯差異，提示黃芩苷對(duì) D168V 突變型HCV 耐藥突變病毒具有高耐藥屏障。

索非布韋對(duì)野生型和 S282T 突變型 HCV 的抑制作用具有明顯差異，但其耐藥倍數(shù)僅為 4 倍，說(shuō)明索非布韋也具有高耐藥屏障的特性[20]。黃芩苷對(duì)野生型和 S282T 突變型 HCV 的抑制作用也沒(méi)有明顯差異，提示黃芩苷對(duì) S282T 突變型 HCV具有高耐藥屏障。

2.5 藥物聯(lián)用的抗 HCV 作用

為了進(jìn)一步探討黃芩苷抗病毒的優(yōu)勢(shì)，我們選擇有不同作用機(jī)制的上市藥物索非布韋和西咪匹韋聯(lián)用觀察其聯(lián)合抗 HCV 的作用。結(jié)果顯示，25 μmol/L 黃芩苷與 0.05 μmol/L 索非布韋聯(lián)合用藥時(shí)，兩者具有協(xié)同抗病毒作用（圖4A，q=1.05），但 25 μmol/L 黃芩苷與 0.01 μmol/L 索非布韋聯(lián)合用藥時(shí)，兩者具有拮抗作用（圖 4B，q=0.43）。

3 討論

黃芩苷屬于黃酮類(lèi)化合物，是中草藥中常見(jiàn)的天然化合物，功能多效，不良反應(yīng)少，具有抗多種病毒的活性[6-11]，是一種廣譜抗病毒候選物。我們首先發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗 HCV 的作用。機(jī)制研究結(jié)果顯示，黃芩苷抗 HCV 的作用是通過(guò)抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶活性發(fā)揮，而對(duì) HCV NS3 解旋酶則沒(méi)有抑制活性。

現(xiàn)有 NS3/4A 蛋白酶抑制劑根據(jù)其作用特點(diǎn)可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是基于 NS3/4A 蛋白酶的底物設(shè)計(jì)的，其抑制原理是利用不易被切割的底物類(lèi)似物來(lái)競(jìng)爭(zhēng) NS3/4A 蛋白酶反應(yīng)中心；另一類(lèi)是基于NS3/4A 蛋白酶的酶切產(chǎn)物而設(shè)計(jì)，其抑制原理是NS3/4A 蛋白酶產(chǎn)生的酶切 N 末端產(chǎn)物可占據(jù)NS3/4A 蛋白酶的活性位點(diǎn)，這兩類(lèi)均為擬肽類(lèi)大分子抑制劑[21-24]。黃芩苷是小分子黃酮類(lèi)化合物，與現(xiàn)有多肽類(lèi)蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)差異很大，雖然其活性尚不如現(xiàn)有 DAA 藥物的活性，但可作為先導(dǎo)化合物，為今后的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化提供可能。

由于 HCV RNA 聚合酶沒(méi)有校正功能，HCV快速?gòu)?fù)制易導(dǎo)致耐藥突變。這些突變的出現(xiàn)，使治療無(wú)效或反彈。我們的結(jié)果顯示，黃芩苷對(duì)這些耐藥突變位點(diǎn)均具有抑制作用，其活性與其抑制野生型的相當(dāng)，顯示了黃芩苷具有高耐藥屏障的優(yōu)勢(shì)。這可能是其與現(xiàn)有 DAA 藥物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型不同的緣故，這為產(chǎn)生耐藥的患者提供了一種選擇。

由于黃芩苷結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，有望與其他 DAA藥物聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用。但我們的結(jié)果顯示，黃芩苷只與有不同作用機(jī)制的索非布韋有協(xié)同抗 HCV的作用，與有相同作用機(jī)制的西咪匹韋聯(lián)用則顯示出了拮抗作用，提示黃芩苷在蛋白酶上的作用位點(diǎn)與現(xiàn)有蛋白酶抑制劑的作用位點(diǎn)有重疊，或由于黃芩苷與蛋白酶結(jié)合后導(dǎo)致構(gòu)象改變從而影響了西咪匹韋的活性，也或由于其他因素如代謝等問(wèn)題影響了它們之間的聯(lián)合抗 HCV 的作用，其機(jī)制有待深入研究。

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The inhibitory activity of baicalin and its mechanism against hepatitis C virus in vitro

LI Jian-rui,CHEN Jin-hua,LI Hu,DONG Biao,MA Xue-mei,PENG Zong-gen

ObjectiveTo evaluate the inhibitory activity of baicalin against hepatitis C virus (HCV) in vitro.MethodsThe effect of compounds against HCV NS3/4A protease and NS3 helicase was detected with fluorescence resonance energy transfer assay in cell free system.The anti-HCV activity on wild and mutant type HCV replication was evaluated in HCV-infected Huh7.5 cells at RNA and protein levels.ResultsBaicalin showed inhibitory activity on HCV NS3/4A protease with no effect on HCV NS3 helicase.In Huh7.5 cells,baicalin inhibited wild type of HCV replication with half maximum effective concentration (EC50) of (31.306 ± 9.559) μmol/L,and inhibited A156T,D168V and S282T drug-resistance mutant HCV replication with EC50of (53.175 ± 19.141) μmol/L,(66.722 ± 30.994) μmol/L,and (63.673 ± 19.770) μmol/L,respectively.Baicalin also showed synergistic effect against HCV with polymerase inhibitor sofosbuvir,but showed antagonistic action with protease inhibitor telaprevir.ConclusionBaicalin shows anti-HCV effect with the action mechanism of inhibiting HCV protease and it is effective for common drug-resistant mutant HCV and exerts synergistic antiviral effect with polymerase inhibitor.

Hepacivirus; BAICALIN; Protease inhibitor; Drug synergism

PENG Zong-gen,Email:pumcpzg@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金（81322050）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-12-0072）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和學(xué)者特聘教授項(xiàng)目（2016）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒室（李健蕊、陳金花、李虎、董飚、彭宗根）；100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院（馬雪梅）

彭宗根，Email：pumcpzg@126.com

2017-02-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.002

方法在體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)黃芩苷對(duì) HCV NS3/4A 蛋白酶和 NS3 解旋酶的抑制活性；在 Huh7.5 細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)分析其對(duì)野生型及臨床常見(jiàn)耐藥型 HCV 感染的抑制作用，并考察與目前臨床應(yīng)用的抗病毒藥物聯(lián)合抗 HCV 的活性。

結(jié)果黃芩苷具有抑制 HCV NS3/4A 蛋白酶活性，但對(duì)NS3 解旋酶無(wú)抑制作用。細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗 HCV 活性測(cè)定顯示，黃芩苷抑制野生型 HCV 復(fù)制的半數(shù)抑制濃度（EC50）為（31.306 ± 9.559）μmol/L，抑制蛋白酶抑制劑常見(jiàn)耐藥突變 A156T 和 D168V 突變 HCV 復(fù)制的 EC50分別為（53.175 ± 19.141）μmol/L 和（66.722 ± 30.994）μmol/L，抑制多聚酶抑制劑常見(jiàn)耐藥突變 S282T 突變 HCV 復(fù)制的 EC50為（63.673 ± 19.770）μmol/L。黃芩苷與多聚酶抑制劑索非布韋聯(lián)用還具有協(xié)同抗病毒效果，但與具有相同作用機(jī)制的西咪匹韋聯(lián)用有拮抗作用。

結(jié)論黃芩苷具有抗 HCV 作用，其機(jī)制為抑制 HCV 蛋白酶，對(duì)蛋白酶抑制劑常見(jiàn)耐藥突變病毒有效，與多聚酶抑制劑聯(lián)用有協(xié)同抗病毒作用。

Author Affiliations:Department of Antiviral Research,Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100050,China (LI Jian-rui,CHEN Jin-hua,LI Hu,DONG Biao,PENG Zong-gen); College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China (MA Xue-mei)