注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白的藥效學、藥代動力學及安全性評價研究

富巖，馬金玲，李開通，孔衛青，楊小楠，于在林

注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白的藥效學、藥代動力學及安全性評價研究

富巖，馬金玲，李開通，孔衛青，楊小楠，于在林

目的對擁有獨立自主知識產權的世界原創原研注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）創新藥開展臨床前藥效學、藥代動力學和安全性評價研究。

白蛋白； 促紅素； 重組融合蛋白； 藥代動力學； 藥理學； 毒理學

人血清白蛋白（HSA）結構穩定，其半衰期長達 20 d，它在血管和血管外循環中分布較廣，是人體血液中最為重要的組分，是血液中重要的運輸載體，因此也成為改善藥物半衰期的最佳載體蛋白之一[1-2]。重組人血清白蛋白融合蛋白以蛋白質結構基因重組形成新的氨基酸多肽序列和新藥物分子結構，在臨床研究中顯示具有長效化，在臨床上獲得較好的治療效果，在國內外開展了廣泛的應用研究。已經有多種重組人血清白蛋白融合蛋白作為長效藥物進入臨床試驗和生產銷售階段[3-6]。

重組人促紅素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）已成為貧血癥治療的重要支持手段之一[7]?？紤]到現有的同類重組促紅素藥物臨床給藥頻次高，并易于產生給藥后的紅細胞壓積或血紅蛋白處于異常高位的毒副反應，于在林和富巖在 2002 年提交了重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白（rHSA/EPO）分子結構的美國發明專利申請，同年進入中國發明專利申請，并先后獲得了中國和美國發明專利授權[2,6]。專利公開了 hEPO 基因的 N 端直接融合到人血清白蛋白基因的 C 端形成融合蛋白，兩個蛋白質分子之間不設有連接肽（no-linker），與 rhEPO 相比有更長的血液半衰期，在臨床使用中預計可以減少給藥頻率，減少患者痛苦，提高治療的依從性，從而可獲得較好的臨床治療和較好的藥物經濟學效果。

rHSA/EPO 首次以新藥研發為目的開展臨床前研究，為此結合國家有關新藥注冊法規規定及生物（基因工程）制品的特點，完成了其藥學研究、理化特性分析[7]，并依據重組人促紅素安全性評價，特別是猴藥代和毒代、大鼠藥代和毒代、大鼠生殖毒性等動物實驗研究[8-14]，設計和開展了本項研究，獲得了藥效學、藥代/毒代研究以及毒理學安全性評價數據，可以支持臨床試驗所需的安全性指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ICR 小鼠（SPF）、SD 大鼠（SPF）、新西蘭兔（SPF）、食蟹猴（普通級）分別購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司、中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心、高要市康達實驗動物科技有限公司。本實驗涉及的所有動物處理內容均遵從實驗動物實驗管理和動物福利相關條例和法規，并由北京昭衍新藥研究中心股份有限公司動物倫理委員會批準和監督執行。

1.1.2 受試物、試劑及檢測試劑盒 注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白凍干粉針劑由天津溥瀛生物技術有限公司生產，批號為1882/20090101，規格為每支 1.0 mg/ml；批號為1882/20090102，規格為每支 0.5 mg/0.5 ml；陽性對照藥重組人促紅素注射液（環爾博）由北京四環生物制藥有限公司生產。其他試劑為藥用級、分析級純度。檢測試劑盒 EPO ELISA kit 由美國 R&D 公司生產。

1.1.3 儀器 Advia 2120 全自動血球分析儀為美國 Bayer 公司產品；MP150 多導生理記錄儀為美國 Biopac 公司產品；TBA-120FR 型全自動生化分析儀為日本東芝公司產品；Easylyte 型全自動電解質分析儀為美國 Medica 公司的產品；LC-10AT 高效液相色譜儀為日本島津公司產品；TSK G3000 SWXL，300 A，10 μm，7.8 mm×300 mm 的凝膠柱購自日本 Tosoh 公司；Multiskan MK3 酶標儀購自美國 Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 藥效學研究

1.2.1.1小鼠體內生物活性（藥效學）試驗 rHSA/EPO 供試品皮下注射給予小鼠，觀察網織紅細胞數與紅細胞數的比值變化，判斷rHSA/EPO 體內生物學活性。

1.2.1.2 食蟹猴的升紅刺激生成效果藥效學研究 本試驗是結合藥代同時開展的，試驗方法見1.2.2.2。

1.2.1.3 對大鼠藥物損傷所致腎性貧血的治療作用 以腺嘌呤 250 mg/kg 每天灌胃給予大鼠3 周，建立大鼠藥物損傷誘導的腎性貧血模型。成模動物按血紅蛋白水平隨機分為 5 組，分別為模型對照組（生理鹽水）、陽性對照組（環爾博，450 IU/kg）、供試品低劑量組（5 μg/kg）、供試品中劑量組（25 μg/kg）和供試品高劑量組（100 μg/kg），另設未造模動物作為正常對照組，除陽性對照品每周給藥 3 次，其余各組每周給藥 1 次，連續給藥3 周。給藥期間每天觀察動物一般臨床癥狀，造模前、首次給藥前、藥后每周 2 次監測血液學指標紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、網織紅細胞（Retic）；造模前、首次給藥前及藥后 D23 取血監測其血生化指標肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）。D23 所有存活動物安樂死后解剖觀察是否有肉眼可見的病理改變，取胸骨骨髓和脾臟進行組織病理學檢查。

1.2.1.4 對大鼠 5/6 腎切除損傷誘導的腎性貧血的治療效果 切除大鼠 5/6 腎，建立損傷誘導的腎性貧血模型。成模動物按 HGB 水平隨機分為5 組，分別為模型對照組（生理鹽水）、陽性對照組（環爾博，450 IU/kg）、供試品低劑量組（5 μg/kg）、供試品中劑量組（25 μg/kg）和供試品高劑量組（100 μg/kg），另將假手術動物作為正常對照組。給藥方法和檢測指標同 1.2.1.3，安樂死動物的時間為給藥后 D24。

1.2.1.5 對藥物損傷誘導的腎性貧血 2 周給藥一次的治療效果 試驗方法同 1.2.1.3，給藥周期改為：生理鹽水及供試品每 2 周給藥 1 次，陽性對照品每周給藥 3 次，連續給藥 3 周。

1.2.2 藥代動力學研究

1.2.2.1125I-rHSA/EPO 的大鼠體內分布及代謝動力學研究 大鼠分為 10 組，1～3 組動物分別單次皮下注射給予 5、25、125 μg/kg 的

125I-rHSA/EPO，第 4 組單次靜脈注射給予 25 μg/kg的125I-rHSA/EPO，1～4 組主要進行藥代動力學研究；其余各組單次皮下注射給予 25 μg/kg 的125I-rHSA/EPO，5～8 組用于分布研究，9～10 組考察糞尿排泄和膽汁排泄。

1.2.2.2 rHSA/EPO 在食蟹猴體內的藥代動力學及藥效動力學研究 30 只食蟹猴分為 5 組（雌雄各半）。1 組皮下注射給予 270 IU/kg 的市售制劑（環爾博），每周 3 次，給藥 4 周。2～5 組分別給予 0.005、0.015、0.045 和 0.015 mg/kg 的rHSA/EPO，組 2、組 4 為單次皮下給藥，組 3 每周給藥一次，給藥 4 周，共給藥 4 次，組 5 為單次靜脈注射給藥。采用經驗證的 ELISA 方法檢測食蟹猴血漿中 rHSA/EPO 和環爾博的濃度，方法的定量下限分別為 2 ng/ml 和 2.5 mIU/ml。試驗期間監測網織紅細胞和血紅蛋白的變化。

1.2.2.3 rHSA/EPO 大鼠和猴的毒代動力學研究 在 rHSA/EPO 重復皮下注射給予 SD 大鼠和食蟹猴的 13 周中伴隨進行毒代動力學研究，大鼠和食蟹猴重復給藥的毒性試驗的劑量分別為 20、60、200 μg/kg，10、30、100 μg/kg，大鼠每個時間點雌雄各 4 只動物，食蟹猴每組雌雄各 5 只。首次、第 5 次和末次的取血時間點為藥前，藥后 2、8、24、48、72、120、168 h，試驗采用經驗證的 ELISA方法檢測血漿中 rHSA/EPO 的濃度，方法的定量下限為 2 ng/ml。

1.2.3 毒理學研究

1.2.3.1 一般藥理學研究

1.2.3.1.1 單次皮下注射對正常小鼠中樞神經系統的影響 rHSA/EPO 單次皮下注射給予小鼠，考察動物的自發活動、抓力、體溫、閾下催眠，每組 10 只動物，雌雄各半，劑量為 100、300、1000 μg/kg。

1.2.3.1.2 食蟹猴安全藥理研究 食蟹猴急性毒性試驗單次皮下注射 rHSA/EPO 在 0.25、1、4 mg/kg 劑量范圍內，觀察食蟹猴的呼吸和心電圖變化；重復給藥毒性試驗中 10、30、100 μg/kg 劑量下，觀察食蟹猴的呼吸和心電圖變化。

1.2.3.2 單次給藥毒性研究

1.2.3.2.1 rHSA/EPO 單次皮下和靜脈注射給予大鼠的毒性試驗 30 只 SD 大鼠，按性別區段隨機分為輔料對照組、皮下注射組、靜脈輸注組，每組 10 只，雌雄各半；劑量為 10 mg/kg。觀察 14 d，試驗期間稱量體重和飼料量。觀察期結束后，進行病理學大體解剖觀察。

1.2.3.2.2 rHSA/EPO單次皮下注射給予食蟹猴的毒性試驗 6 只食蟹猴，區段隨機分為 3 組，每組 2 只，雌雄各半，分為低、中和高劑量組，劑量分別為 0.25、1 和 4 mg/kg，觀察期為 14 d，試驗期間對動物進行體重、體溫、心電圖、血細胞計數、凝血功能和血液生化的檢測。觀察期結束后，所有動物實施安樂死，進行大體解剖觀察。

1.2.3.3 重復給藥毒性研究

1.2.3.3.1 大鼠重復給藥毒性試驗 232 只 SD大鼠，雌雄各半，采用區段隨機分組法將動物分為8 組，1～4 組為毒理學研究組，每組 40 只，分別為輔料對照組、低劑量組（20 μg/kg）、中劑量組（60 μg/kg）和高劑量組（200 μg/kg），5～8 組為毒代動力學研究組，頸背部皮下注射給藥，每周給藥 1 次，連續給藥 13 周，共給藥 14 次?；謴推?4 周。試驗期間進行各項指標的檢測，詳見參考文獻[4]，并在首次給藥、第 5 次和末次給藥前后進行毒代動力學分析。對安樂死動物進行大體解剖觀察，毒理學研究組動物主要臟器稱重、計算臟體比、臟腦比，并對 40 多種組織器官進行組織病理學檢查。

1.2.3.3.2 食蟹猴重復給藥毒性試驗 試驗選用40 只食蟹猴，雌雄各半，按性別區段隨機分為4 組，每組 10 只，分別為輔料對照組，供試品低劑量組（10 μg/kg）、供試品中劑量組（30 μg/kg）、供試品高劑量組（100 μg/kg），皮下注射給藥，每周給藥 1 次，連續給藥 13 周，共給藥 14 次，恢復期 6 周。試驗期間進行各項指標的檢測，詳見參考文獻[4]，首次、第 5 次、第 13 次給藥前后進行毒代動力學分析。安樂死動物進行大體解剖觀察、主要臟器稱重、骨髓涂片，并對 40 余種臟器/組織進行組織病理學檢查。

1.2.3.4 生殖毒性研究 156 只 SD 雌性大鼠，隨機分為 8 組，1～4 組為毒理學研究組，每組30 只，分別為輔料對照組、低劑量組（20 μg/kg）、中劑量組（60 μg/kg）和高劑量組（200 μg/kg）；5 ～8 組為毒代動力學研究組。孕鼠于妊娠第 6 天（GD6）和 GD13 皮下注射給藥，共給藥 2 次，GD20 對孕鼠實施安樂死進行大體解剖觀察，對孕鼠生殖能力、胚胎-胎仔發育、胎仔外觀、骨骼、內臟進行檢查，并在雌鼠首次給藥和末次給藥前后以及 GD20 解剖時采集血樣進行毒代動力學分析。

2 結果

2.1 藥效學研究

2.1.1 小鼠體內生物活性（藥效學） 小鼠皮下注射 rHSA/EPO，劑量在 15～120 ng 范圍之間，具有線性促進小鼠網織紅細胞增生的作用，并具有一定的劑量-反應關系，該方法也作為本制品體內生物活性的測定方法。

2.1.2 食蟹猴的升紅刺激生成效果 結果顯示，從絕對數值的變化和與藥前本底數值比較的雙重角度看，rHSA/EPO（0.015 mg/kg，qw）組和環爾博（270 IU/kg，tiw）組網織紅細胞（Retic）、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞容積（HCT）的變化趨勢非常一致，但是 rHSA/EPO 組的上升程度略高于環爾博組。rHSA/EPO 低劑量組（0.005 mg/kg，單次給藥）、中劑量組（0.015 mg/kg，qw）、高劑量組（0.045 mg/kg，單次給藥）Retic（%）隨著劑量的升高而上升，呈現出較明顯的劑量關系，RBC、HGB、HCT 未見明顯的劑量關系。食蟹猴的網織紅細胞計數和血紅蛋白變化趨勢見圖 1、2，rHSA/EPO 和環爾博相當劑量的比較詳見表 1 和表 2，圖 3 和 4。

圖1 Retic（%）-時間（d）關系Figure 1 The corresponding relation of Ret (%)-time (d)

圖2 HGB（g/L）-時間（d）關系Figure 2 The corresponding relation of HGB (g/L)-time (d)

表1 網織紅細胞計數（%）-時間（d）關系Table 1 The corresponding relation of Ret (%)-time (d)

2.1.3 對大鼠藥物損傷所致腎性貧血的治療作用 給藥后正常對照組平均 HGB 在 148.5 ～156.8 g/L 范圍內波動，模型對照組 HGB 均值在98.9～120.5 g/L 范圍內波動，各時間點均顯著低于正常對照組（P≤ 0.05）。陽性對照組（環爾博，450 IU/kg）HGB 均值藥后 D4 降至 121.4 g/L，在D8 恢復至造模前水平，之后持續升高，D22 升至最高點 169.7 g/L，D4～D22 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），且 D15～D18 顯著高于正常對照組（P≤ 0.05）。供試品低劑量組（5 μg/kg）HGB 均值藥后 D4 降至 110.1 g/L，D8 開始緩慢回升，D15 升至最高點 123.0 g/L，之后又持續降低，D22降至 100.6 g/L，D8～D15顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D22 顯著低于模型對照組（P≤ 0.05），D4～D22 顯著低于正常對照組（P≤ 0.05）。供試品中劑量組（25 μg/kg）HGB 均值藥后 D4 降至117.8 g/L，D8 恢復至造模前水平，D11 升至最高145.3 g/L，之后持續降低，D22 降至 105.1 g/L，D8～D15 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D18 ～D22 與模型對照組比較無顯著差異（P＞ 0.05）。供試品高劑量組（100 μg/kg）HGB 均值藥后 D4 降低至 123.1 g/L，D8 恢復至造模前水平，D11 升至最高 157.6 g/L，之后持續降低，D22 降至最低123.1 g/L，D8～D18 顯著高于模型對照組（P≤0.05），D22 與模型對照組比較無顯著差異（P＞0.05），D4～D22 顯著高于供試品低劑量組（P≤0.05）（圖 5）。實驗期間 RBC、HCT 和 Retic 的變化趨勢與 HGB 基本一致。各指標變化趨勢見圖 6～8。

表2 血紅蛋白（g/L）-時間（d）關系Table 2 The corresponding relation of HGB (g/L)-time (d)

圖3 Retic（%）-時間（d）關系Figure 3 The corresponding relation of Ret (%)-time (d)

圖4 HGB（g/L）-時間（d）關系Figure 4 The corresponding relation of HGB (g/L)-time (d)

圖5 各組 HGB 均值變化趨勢圖Figure 5 The mean change trend chart of HGB in different groups

動物造模后 BUN 和 CREA 較正常對照組明顯升高（P≤ 0.05），藥后 D23 各組模型動物的BUN 和 CREA 均值均出現部分回落，陽性對照組和供試品各劑量組與模型對照組相比均無顯著差異（P＞ 0.05）。

2.1.4 對大鼠 5/6 腎切除損傷誘導的腎性貧血的治療效果 給藥后正常對照組 HGB 均值在 146 ～160 g/L 范圍內波動，模型對照組 HGB 均值在109～121 g/L 范圍內波動，各時間點均顯著低于正常對照組（P≤ 0.05）。陽性對照組（環爾博，450 IU/kg）HGB 均值于藥后 D4 開始升高，D8 即恢復至造模前水平，D15 升至最高點 175 g/L，之后緩慢下降，至 D22 降為 156 g/L，D8～D19 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D19 顯著高于正常對照組（P ≤ 0.05），D4 顯著低于正常對照組（P ≤0.05）。供試品低劑量組（5 μg/kg）HGB 均值藥后未見升高，D19 開始降低，D22 降至 91 g/L，D4 ～D22 顯著低于正常對照組（P ≤ 0.05），D22 顯著低于模型對照組（P ≤ 0.05）。供試品中劑量組（25 μg/kg）HGB 均值藥后 D4 開始升高，D8 即恢復至造模前水平，D11 開始降低，D22 降至最低95 g/L，D8、D15 顯著高于模型對照組（P ≤ 0.05），D4、D15～D22 顯著低于正常對照組（P ≤ 0.05），D22 顯著低于模型對照組（P ≤ 0.05）。供試品高劑量組（100 μg/kg）HGB 均值藥后 D4 開始升高，在 D8 即恢復至造模前水平，D11 升至最高點165 g/L，D22 回落至 124 g/L，D4～D11、D19 顯著高于模型對照組（P ≤ 0.05），D4 顯著低于正常對照組（P ≤ 0.05），D11 顯著高于正常對照組（P≤ 0.05），D8～D11、D19～D22 顯著高于供試品低劑量組（P ≤ 0.05）（圖 9）。實驗期間，RBC、HCT和 Retic 的變化趨勢與 HGB 基本一致。各指標變化趨勢見圖 10～12。

圖6 各組 RBC 均值變化趨勢圖Figure 6 The mean change trend chart of RBC in different groups

圖7 各組 HCT 均值變化趨勢圖Figure 7 The mean change trend chart of HCT in different groups

圖8 各組 Retic 均值變化趨勢圖Figure 8 The mean change trend chart of Ret in different groups

圖9 各組 HGB 均值變化趨勢圖Figure 9 The mean change trend chart of HGB in different groups

圖10 各組 RBC 均值變化趨勢圖Figure 10 The mean change trend chart of RBC in different groups

動物造模后 BUN 和 CREA 較正常對照組明顯升高（P≤ 0.05），給藥后 D24 各組模型動物的BUN 和 CREA 均未見降低，陽性對照組和供試品各劑量組與模型對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.5 對藥物損傷誘導的腎性貧血 2 周給藥一次的治療效果 造模前動物 HGB 均值為 140 g/L左右，造模結束后（D1），模型動物 HGB 均值降至 124 g/L 左右，給藥后模型對照組在給藥后HGB 均值繼續下降，在 D8 降至 106.6 g/L，D11略有回升至 112.0 g/L，D14 降至 103.4 g/L，D19為 113.6 g/L。陽性對照組（環爾博，450 IU/kg）HGB 均值給藥后 D4 進一步降低至 114.5 g/L，從D7 開始持續升高，D11 恢復至造模前水平，D18升至最高點 184.0 g/L，D7～D18 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05）。供試品低劑量組（5 μg/kg）HGB均值給藥后 D4 進一步降低至 111.6 g/L，從 D8開始緩慢回升，D14 回升至最高點 131.7 g/L，D19降至 120.6 g/L，D7～D14 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D7～D18 顯著低于陽性對照組（P≤0.05）。供試品中劑量組（25 μg/kg）HGB 均值給藥后 D4 出現進一步降低至 118.6 g/L，從 D7 開始升高，D11 恢復至造模前水平，即最高 157.3 g/L，之后持續降低，D18 降至 139.9 g/L，D7～D18 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D14～D18 顯著低于陽性對照組（P≤ 0.05）。供試品高劑量組（100 μg/kg）HGB 均值給藥后 D4 出現輕微降低至 120.0 g/L，從 D7 開始升高，D11～D18 恢復至造模前水平，D11 升至最高 165.9 g/L，之后持續降低，D18 降至 150.6 g/L，D7～D18 顯著高于模型對照組（P≤ 0.05），D18 顯著低于陽性對照組（P≤ 0.05），D7～D18 顯著高于供試品低劑量組（P≤ 0.05）。實驗期間 RBC、HCT 和 Retic 的變化趨勢與 HGB 基本一致。

圖11 各組 HCT 均值變化趨勢圖Figure 11 The mean change trend chart of HCT in different groups

圖12 各組 Retic 均值變化趨勢圖Figure 12 The mean change trend chart of Retic in different groups

與模型動物比較，陽性對照組和供試品各劑量組各血液生化指標均無顯著差異（P＞ 0.05）。

2.2 藥代動力學研究

2.2.1125I-rHSA/EPO 的大鼠體內分布及代謝動力學研究125I-rHSA/EPO 經皮下注射給藥后，在5～100 μg/kg 劑量范圍內，125I-rHSA/EPO 在動物體內的代謝特征基本無明顯性別差異，125I-rHSA/EPO的Cmax及AUC(0-240h)隨劑量的增加而增加。5 ～20 μg/kg 劑量范圍內，Cmax及AUC(0-240h)的增加比例略高于劑量的增加，20～100 μg/kg 劑量范圍內，Cmax及AUC(0-240h)基本隨劑量的增加成比例增加。

125I-rHSA/EPO 皮下注射給藥后，絕對生物利用度為 58.27%（總放射性）及 57.40%（沉淀放射性）。放射性主要分布在血漿、肺、腎、肝、腎上腺、心臟、生殖腺、脾腺和胰腺等組織/體液，而腦、脂肪和脊髓濃度最低。藥物不易透過血腦屏障。主要排泄器官為腎，藥后 16 d 排泄出注入放射性的71.44% ± 12.64%。尿、糞合計排出注入放射性的73.86% ± 12.36%。膽汁排泄很少。詳見圖 13。

2.2.2 rHSA/EPO 多次給藥在食蟹猴體內的藥代動力學 在 0.005～0.045 mg/kg 劑量范圍內的rHSA/EPO 皮下注射給藥后，0.015 mg/kg 的rHSA/EPO 靜脈注射給藥后，及 270 IU/kg 的環爾博皮下注射給藥后的代謝動力學特征無明顯性別差異。各劑量組動物 rHSA/EPO 的 Cmax的比值和AUCinf的比值分別為 1∶2.57∶11.46（雄）、1∶1.63∶5.76（雌）和 1∶3.58∶10.90（雄）、1∶2.78∶6.47（雌）。在 0.005～0.045 mg/kg 劑量范圍內，rHSA/EPO 的 Cmax及 AUCinf與劑量呈線性增加趨勢，同時各劑量組動物的末端清除率（Cl）的平均值未見明顯變化，所以 rHSA/EPO 在動物體內基本呈現線性動力學特征。rHSA/EPO 皮下注射給藥的絕對生物利用度為 31.92%（雄）和 45.80%（雌）。rHSA/EPO 在動物體內的藥代動力學參數詳見表 3，藥時曲線見圖 14。

圖13 大鼠皮下注射125I-rHSA/EPO 后組織分布圖Figure 13 Map of distribution in different tissues after injection125I-rHSA/EPO through the sc

2.2.3 rHSA/EPO 大鼠毒代動力學研究 20～200 μg/kg 劑量范圍內，首次藥后（D1），各劑量組動物 rHSA/EPO 的 Cmax的比值和 AUC(0-168h)的比值分別為 1∶3.85∶12.05（雄）、1∶2.82∶11.10（雌）和 1∶3.88∶12.43（雄）、1∶3.26∶10.54（雌）。與劑量呈線性增加趨勢，基本呈現線性動力學特征。20、60、200 μg/kg 劑量組，雄性動物和雌性動物的 Cmax分別為 54.76 和 67.40 ng/ml，210.58 和190.08 ng/ml，660.02 和 747.97 ng/ml。雄性動物和雌性動物的 AUC(0-168h)分別為 3023.35 和3796.91 (h·ng)/ml，11743.40 和 12372.84 (h·ng)/ml，37572.36 和 40031.12 (h·ng)/ml。從絕對數值上看，同一劑量組雄性動物和雌性動物的 Cmax和AUC(0-168h)非常接近，不存在明顯的性別差異。5 次藥后和 14 次藥后時，絕大多數動物的血漿rHSA/EPO 濃度均低于最低定量限，無法計算代謝動力學參數。

2.2.4 rHSA/EPO 食蟹猴毒代動力學研究 首次藥后，rHSA/EPO 在食蟹猴體內基本呈現線性動力學特征。10～100 μg/kg 劑量范圍內，首次藥后（D1），rHSA/EPO 的平均 Cmax及 AUC(0-168h)與劑量呈線性增加趨勢，第 5 次藥后（D29）及第13 次藥后（D85）平均Cmax及AUC(0-168h)的增加明顯慢于劑量的增加，尤其以高劑量組變化最為顯著，可能是由于部分產生了抗藥抗體，對血漿藥物濃度檢測有較大的影響。在 10～100 μg/kg 劑量范圍內，rHSA/EPO 在動物體內的代謝特征無明顯性別差異。

食蟹猴毒代動力學參數見表 4。

表3 rHSA/EPO 皮下注射給予食蟹猴的藥代動力學參數Table 3 The pharmacokinetic parameters after injection rHSA/EPO to cynomolgus monkey through sc

圖14 平均血藥濃度-時間曲線匯總（0.005、0.015 和 0.045 mg/kg rHSA/EPO，sc）Figure 14 The curve summary of rHSA/EPO in blood concentration-time (0.005、0.015 和 0.045 mg/kg rHSA/EPO,sc)

2.3 藥理學研究

2.3.1 一般藥理學研究

⑴單次皮下注射對正常小鼠中樞神經系統的影響

藥后 4 h、8 h、2 d 和 6 d 觀察，供試品各劑量組和對照組動物行為活動自如，未見異常姿勢、步態，無流涎、肌顫等現象發生，瞳孔正常大小；供試品各劑量組小鼠的總路程、活動次數、抓力和體溫與同期輔料對照組比較未見顯著性差異（P＞0.05）。閾下催眠試驗，供試品各劑量組的翻正反射消失動物數與輔料對照組比較未見顯著性差異（P＞ 0.05）。

表4 rHSA/EPO 在食蟹猴體內的毒代動力學參數Table 4 The toxicokinetic parameters of rHSA/EPO administration in cynomolgus monkey

⑵食蟹猴安全藥理研究

食蟹猴急性毒性試驗單次皮下注射 rHSA/EPO在 0.25、1、4 mg/kg 劑量范圍內對食蟹猴的呼吸和心電圖進行考察，顯示均無明顯影響，重復給藥毒性試驗中 10、30、100 μg/kg 劑量下對食蟹猴的呼吸觀察和心電圖測試，心血管系統也未見明顯影響。

2.3.2 單次給藥毒性研究

⑴rHSA/EPO 單次皮下和靜脈注射給予大鼠的毒性試驗

試驗期間各組動物臨床觀察狀態良好，未見異常反應，與 rHSA/EPO 制劑空白組相比，供試品組動物體重、食量均未見異常變化，皮下注射組動物大體解剖可見脾臟體積略增大，鏡下未見明顯異常，靜脈輸注組動物大體解剖可見脾臟體積增大，鏡下表現為脾臟紅髓髓外造血，上述變化考慮均與供試品的藥理作用相關。本試驗條件下，最大耐受劑量（MTD）≥ 10 mg/kg。

⑵食蟹猴單次給藥毒性試驗

試驗期間，未發現動物死亡或瀕死；1 mg/kg 劑量組雄性動物藥后注射局部可見潮紅，D3 恢復，其余動物臨床觀察均未見與給藥相關的異常反應。與給藥前相比，1、4 mg/kg 劑量組雌性動物藥后D11 和（或）D14 RBC 略有升高，HGB、HCT 可見升高趨勢，0.25 和 4 mg/kg 劑量組動物藥后部分時間點 APTT 升高，0.25、1、4 mg/kg 劑量組動物藥后 D2 或 D3 開始可見 Retic（%）升高，D7 或 D11 達到最高，之后逐漸恢復，至 D14 未見完全恢復，期間 Retic（×1012/L）可見升高趨勢。以上變化認為與供試品的藥理學作用相關。各劑量組動物體重、體溫、心電圖、血液生化等各指標均未見明顯異常變化。大體解剖觀察供試品各劑量組均未見給藥相關的異常改變，未進行病理組織學檢查。在本試驗條件下，食蟹猴的最大耐受劑量（MTD）為 4 mg/kg。

2.3.3 重復給藥毒性研究

⑴大鼠長期毒性試驗

注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白20、60、200 μg/kg 重復皮下注射給予 SD大鼠，每周給藥 1 次，連續給藥 13 周，動物主要表現為給藥初期藥理學作用引起的外周血紅細胞相關指標升高，給藥 4 周后逐漸降低，隨著抗體的產生，各組均有部分動物因貧血引起骨髓造血細胞減少甚至消失，引起重要臟器如肝臟、腎上腺、心肌和腦細胞缺血缺氧性損害，導致動物死亡。rHSA/EPO 重復皮下注射給予 SD 大鼠，可檢測到抗 EPO 的抗體，抗體具有中和藥物活性作用。100～1000 μg/ml 的 rHSA/EPO 重復皮下注射給予 SD 大鼠，給藥局部未見明顯刺激性反應。這主要是由于藥物分子結構中含有人源的白蛋白，其中和抗體可導致 rHSA/EPO 和大鼠體內的鼠源 EPO也被完全中和，導致嚴重的貧血現象。

⑵食蟹猴長期毒性試驗

注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白重復皮下注射給予食蟹猴，每周給藥 1 次，連續給藥 13 周，共給藥 14 次，可見藥理學作用相關的變化包括紅細胞相關指標、PLT 升高，APTT 延長，Eos 和 Lymph 降低，TBil、DBil、Cre 升高，CD3+降低，胸骨骨髓可見紅系造血細胞增生，胃腸、食管、心臟心肌間質黏膜下層、腎臟腎小球毛細血管及間質的血管擴張淤血，腎小管紅細胞管型，停藥后基本恢復或有恢復趨勢。100 μg/kg 組有 1 只動物在給藥后期可見尾巴僵硬、尾椎關節變粗，皮下組織水腫伴散炎細胞浸潤，左后肢踝關節腫大，關節囊炎細胞散在浸潤伴纖維素滲出、血管擴張。因此認為 30 μg/kg 為本試驗的安全劑量。rHSA/EPO重復皮下注射給予食蟹猴，產生了抗 EPO 的抗體，抗體可中和藥物活性作用。rHSA/EPO 以 100 ～1000 μg/ml 的濃度每周 1 次皮下注射給予食蟹猴，注射局部未見與給藥相關的刺激性反應。

2.3.4 生殖毒性研究 注射用重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白以 20、60 和 200 μg/kg 劑量重復皮下注射給予 SD 大鼠，于孕鼠 GD6 和 GD13給藥，每只動物給藥 2 次，200 μg/kg 劑量下孕鼠可見與藥理作用相關的髓外造血，20 和 60 μg/kg劑量下孕鼠未見明顯不良反應；20、60、200 μg/kg劑量下未見胚胎毒性和致畸性，但可出現由于供試品藥理作用放大導致的胎仔宮內發育遲緩和骨骼發育不良。

3 討論

3.1 研究項目選擇的依據

rHSA/EPO 是重組融合蛋白，其分子結構包含HSA 和 EPO 兩個部分，這個設計是希望達到如下目的：①保持 EPO 的生物學活性，升高紅細胞，治療因腎衰引起的腎性貧血、放療和化療藥物引起的貧血以及手術引起的急性貧血癥。②長效作用：常規 rhEPO 需要每周給藥 3 次，以維持紅細胞水平；希望本制品的半衰期延長，給藥 1 次，維持1～2 周（7～14 d）的升紅作用；但不希望紅系細胞增生過快、過急，過快過急將會使血積壓提高而出現安全隱患。③在發揮長效治療作用的同時，不出現常規 rhEPO 以外的毒性反應。④與現有的rhEPO 相比，rHSA/EPO 在達到臨床貧血癥治療的相同效果的同時，更為顯著地減少給藥次數和頻率，治療費顯著降低。

為評價 rHSA/EPO 是否達到上述研制目標，我們開展了藥效學、藥理、毒理動物試驗研究。

3.2 對研究結果的分析和評價

3.2.1 有效性分析 升紅作用：試驗結果顯示，rHSA/EPO 在健康小鼠模型和健康猴模型都顯示出顯著的升紅（升網織紅細胞）的作用，且表現出一定的量效關系，在小鼠和猴試驗中量效關系良好，表明 rHSA/EPO 具有 rhEPO 相似的生物學作用，在給藥后次日網織紅細胞就出現明顯升高，起效快，與常規 rhEPO 相比，還具有顯著地緩慢釋放的長效功能和作用。

有效劑量：在小鼠試驗中 15～120 ng 為線性升高 Ret%、在猴試驗中 15 μg/kg 顯示出顯著的升紅作用，達到 rhEPO 相同的臨床貧血治療的作用。

長效化特征：小鼠、猴和大鼠兩種腎性貧血動物模型的藥效試驗都顯示出相似的長效作用，給藥1 次，可維持網織紅細胞水平高于模型組（最低點與陽性對照組相似）7～14 d；藥代動力學研究顯示，大鼠皮下注射的 t1/2為 43.97 h；單次皮下注射給予食蟹猴的 t1/2分別為 49.84（5 μg/kg）、51.25（15 μg/kg）和 43.87 h（45 μg/kg）；在嚙齒類和 NHP 相似。

劑量與作用時間：小鼠和猴的藥效試驗都顯示，較高的劑量可以使紅細胞計數增加幅度大；這與不同劑量的 t1/2相似，甚至高劑量的 t1/2更短有關。劑量增加，但生物作用時間不延長，可能與動物產生針對異源人血清白蛋白和人 EPO 抗體，或者和 EPO 正常代謝消除相關。

聚乙二醇化的人促紅素（PEG-EPO）在大鼠的半衰期 t1/2約為 27.6 h[15]，其是重組人促紅素在大鼠中的半衰期（1.98～2.7 h）的 9 倍[13]，重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白在大鼠中的半衰期43.97 h，較 PEG 化促紅素的半衰期還要更長，約是文獻報道的 PEG-EPO 的 2 倍，rhEPO 的18 倍，也符合每 2 周給藥一次的預期。

3.2.2 安全性分析 本制品的總體安全性好，食蟹猴單次給藥的劑量高達 4 mg/kg 時，未出現嚴重的毒性反應。大鼠和食蟹猴重復給藥的毒性試驗結果提示，大鼠主要出現因中和抗體產生的貧血為主的變化，食蟹猴主要出現與 rHSA/EPO 藥理學作用或擴大的藥理學作用相關的一系列改變，如紅細胞相關指標、PLT 升高，APTT 延長，Eos 和Lymph 降低，TBil、DBil、Cre 升高，CD3+降低，胸骨骨髓可見紅系造血細胞增生，胃腸、食管、心臟心肌間質黏膜下層、腎臟腎小球毛細血管及間質的血管擴張淤血，腎小管紅細胞管型。上述結果提示 rHSA/EPO 的毒性表現與常規 rhEPO 產品相似，未出現新的不良反應。

在大鼠和猴重復給藥毒性試驗中，給藥組動物均可檢出抗 EPO 的抗體，猴的免疫原性略弱于大鼠，由于本品含有人血清白蛋白，對于動物而言，為異源蛋白，更容易產生抗體，臨床應用時產生抗體的風險應該會很低，但仍提示臨床用藥時需注意監測抗體的產生情況。

于在林和富巖是最早開展人血清白蛋白與人促紅素蛋白質的直接連接融合，之間不設有連接肽[2,6]。其后中國成都迪奧公司在中國發明專利申請中提出在人血清白蛋白和促紅素之間設有一個由 20 個氨基酸組成的連接肽[16]，韓國研究者也同樣設計了含有連接肽的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白[17]，兩者獲得的研究結果則都與本研究結果相近。連接肽的存在肯定會增加作為藥物蛋白質的免疫原性。不設有連接肽的重組人血清白蛋白/促紅素融合蛋白的藥物分子結構更符合作為藥物用于臨床的多種貧血癥，特別是腎性貧血癥、化療導致的貧血癥以及手術外周急性貧血癥的治療?？傊⑸溆弥亟M人血清白蛋白/促紅素融合蛋白臨床前研究結果顯示其對腎性貧血癥有顯著的治療作用，表現出長效特征，總體安全性好，為腎衰、腎透析患者、化療患者和因手術所致的貧血提供了新的更長效、更優生物治療藥物選擇。

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Studies on pharmacodynamics,pharmacokinetics and safety evaluation of recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein for injection as a bio-better drug

FU Yan,MA Jin-ling,LI Kai-tong,KONG Wei-qing,YANG Xiao-nan,YU Zai-lin

ObjectiveTo evaluate and study in animals for the efficacy,pharmacokinetics and safety of recombinant human serum albumin/erythropoietin fusion protein as a bio-better innovation long-acting drug in pre-clinic.MethodsThe increase of red blood cells for rHSA/EPO was observed by in vitro and in vivo animal experinments.Effects of rHSA/EPO on the erythropoiesis in mice,cynomolgus monkeys and in different renal anemia rat models were studied from pharmacodynamics.Pharmacokinetics studies were conducted to study the kinetics of rHSA/EPO in rats and cynomolgus monkeys after different doses,single dose,multiple drug administration.The general toxicity and reproductive toxicity of rHSA/EPO in mice,rats and cynomolgus monkeys were studied,and the safety evaluation was made.ResultsThe results from pharmacodynamic studies showed that rHSA/EPO stimulatee mice,rats and monkeys to erythropoiesis,increased reticulocyte count Ret%.At the same time,rHSA/EPO and rhEPO (the positive contro) both exerted obvious curative effect and rHSA/EPO showed more long-acting than rhEPO did in anemia rat model caused by drugs or nephrectomy at rHSA/EPO administered every 1 weeks or once every 2 weeks and rhEPO administered 3 times weekly.From pharmacokinetic studies,the average half-life of rHSA/EPO in the cynomolgus monkeys was about 53.34 hours,much longer than the average half-life of rhEPO at 7.16 hours.rHSA/EPO did not bind to plasma proteins,not easily penetrated the blood-brain barrier,and the main excretory organ was kidney.Furthermore,its body absorption and elimination in animals were slower than the rhEPO.The results from toxicological studies displayed that there was no effects on the central nervous system function after rHSA/EPO was given subcutaneously at the single dose of 100 μg/kg,300 μg/kg,1000 μg/kg in ICR mice and no obvious effect on the respiratory and cardiovascular system after cynomolgus monkeys subcutaneously administered with a single dose of 25 μg/kg and 100 μg/kg,400 μg/kg.No obvious toxicity was observed in SD rats and cynomolgus monkeys subcutaneously given a single injection and then the maximum tolerated dose were 10 mg/kg and 4 mg/kg,respectively.rHSA/EPO showed no embryo toxicity and teratogenicity.The changes of the blood biochemistry,bone marrow and/or gastrointestine,kidney in cynomolgus monkeys and rats with repeated dose toxicity test were associated with pharmacological effects on erythropoiesis and showed recovery trend after drug withdrawal.Anti-rHSA/EPO antibody IgG was produced for 3 weeks after the drug given.Antibodies in rats were produced more easily than that in monkeys because rHSA/EPO contained HSA,for which severe anemia was also occurred due to antibody neutralizing EPO in repeated dose toxicity study.ConclusionsrHSA/EPO increases the reticulocytes with the long-acting characteristics of the overall good safety.Furthermore,its toxicity is similar with conventional rhEPO products without new adverse reactions.The results of the studies can provide references and important guiding significances for the clinical trial of rHSA/EPO.

Albumin; Erythropoietin; Fusion protein; Pharmacokinetics; Pharmacology; Toxicology

s:YU Zai-lin,Email:yuzailin88@sina.com; MA Jin-ling,Email:majinling@joinn-lab.com

“重大新藥創制”國家科技重大專項（2009ZX09103-706）；天津市科學技術委員會科技支撐計劃（11ZCKFSY00200）

300457 天津溥瀛生物技術有限公司（富巖、楊小楠、于在林）；100026 北京，中美福源生物技術（北京）股份有限公司（富巖、于在林）；100176 北京昭衍新藥研究中心股份有限公司（馬金玲、李開通、孔衛青）

于在林，Email：yuzailin88@sina.com；馬金玲，Email：majinling@joinn-lab.com

2016-12-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.001

方法通過對動物體內外試驗研究，觀察 rHSA/EPO 升紅細胞（網織紅細胞）作用。藥效學研究觀察 rHSA/EPO 對小鼠、食蟹猴以及不同的大鼠腎性貧血模型的紅細胞生成影響。藥代動力學研究則是對 rHSA/EPO 不同劑量、單次、多次給藥大鼠與食蟹猴后的藥代/毒代進行研究。毒理學研究通過 rHSA/EPO 給予小鼠、大鼠和食蟹猴后，觀察其一般毒性以及生殖毒性等反應，從而對安全性做出評價。

結果藥效學研究結果顯示 rHSA/EPO 可刺激小鼠、大鼠和食蟹猴生成紅細胞，升高網織紅細胞計數（Ret%），同時對藥物或腎切除造成損傷所致的腎性貧血大鼠模型，rHSA/EPO 每周或者每 2 周給藥一次，與陽性對照藥rhEPO 每周給藥 3 次均顯示出顯著的治療作用，且較rhEPO 具有明顯的長效性。藥代動力學研究結果顯示rHSA/EPO 在食蟹猴體內的半衰期平均值約為 53.34 h，比rhEPO 的平均半衰期 7.16 h 要長，rHSA/EPO 不與血漿蛋白結合，不易透過血腦屏障，主要排泄器官為腎，在動物體內的吸收和消除均慢于 rhEPO。毒理學研究結果顯示rHSA/EPO 以 100、300、1000 μg/kg 單次皮下注射給予ICR 小鼠，對其中樞神經系統功能無影響，以 25、100、400 μg/kg 單次皮下注射給予食蟹猴，對其呼吸與心血管系統無明顯影響，單次皮下注射給予 SD 大鼠和食蟹猴未見明顯毒性反應，最大耐受劑量分別為 10 mg/kg 和 4 mg/kg，rHSA/EPO 未見胚胎毒性和致畸性。食蟹猴及大鼠重復給藥毒性試驗可見與藥理學作用相關的即紅細胞增多引起的血液生化、骨髓造血和（或）胃腸、腎臟的一些變化，停藥后可見恢復趨勢，給藥后 3 周可產生抗 rHSA/EPO 的結合抗體 IgG。大鼠體內產生的抗體較食蟹猴的強，與受試物中含有 HSA 相關，因而在大鼠重復給藥毒性試驗中也就出現由于抗體的產生中和了體內的 EPO，進而可見嚴重貧血現象。

結論rHSA/EPO 具有顯著的升紅作用，表現出長效特征，總體安全性好，毒性表現與常規 rhEPO 產品相似，沒有出現新的不良反應。研究結果可為 rHSA/EPO 臨床試驗研究提供參考，并具有重要的指導意義。

Author Affiliations:Tianjin Biotech Ltd.,Tianjin 300457,China (FU Yan,YANG Xiao-nan,YU Zai-lin); FortuneRock (China) Co.,Ltd.Beijing 100026,China (FU Yan,YU Zai-lin); Beijing Joinn Laboratory Co.,Ltd.,Beijing 100176,China (MA Jin-ling,LI Kai-tong,KONG Wei-qing)