G蛋白信號轉導調節因子4在腎癌組織中的表達及意義

安豐，楊繼宏，崔振宇，師曉強，劉明鍇，郭景陽，王洪福

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2 華北石油總醫院)

腎細胞癌(RCC)是泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一，起源于腎小管上皮細胞，占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。近50%的RCC患者缺乏早期癥狀，25%的患者就診時已屬于晚期，存在局部侵襲或轉移[2]。因此，明確RCC的起源、復發轉移的分子機制對于RCC的診斷、治療和預后具有重要意義。G蛋白信號轉導調節因子(RGS)是G蛋白偶聯信號通路中一類重要的調節蛋白，通過激活GTP酶激活蛋白(GAP)活性來中止G蛋白信號通路，從而調控G蛋白介導的下游信號傳遞[3]。RGS4是RGS蛋白家族中的重要成員之一，能有效中止G蛋白αq亞型(Gαq)介導的信號通路，參與神經調節和生物體發育等過程[4]。近年研究發現，RGS4參與了乳腺癌的發生發展，并在乳腺癌的轉移中發揮重要的調節作用[5]。但目前對RGS4在RCC發生發展過程中的作用尚不明確。我們收集了2002年4月～2015年11月就診的120例RCC患者的癌及癌旁組織，檢測 RGS4的表達情況，探討RGS4的表達變化及其與RCC患者臨床病理特征的關系，為RCC的診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院住院行根治性腎切除術的RCC患者120例，男75例、女45例，年齡2～79歲、中位年齡49歲，均經病理診斷確診RCC。術中切取癌組織及距腫瘤邊緣至少2 cm的0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm癌旁組織。排除有嚴重心肺肝腎等功能異常及全身感染史的患者。

1.2 RCC癌組織及癌旁組織RGS4蛋白定性表達檢測 采用免疫組化兩步法。取癌旁組織、癌組織制備石蠟切片，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水，雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，微波抗原修復，5%山羊血清封閉。RGS4兔抗人一抗1∶100稀釋后室溫孵育1 h，酶標抗鼠聚合物室溫孵育，常規DAB顯色。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，同時設空白對照。根據陽性、陰性和空白對照的顯色情況，計數每例患者腫瘤組織中的所有腫瘤細胞，以陽性細胞率>5%判定為陽性，計算陽性率。

1.3 RCC癌組織及癌旁組織RGS4蛋白半定量表達檢測 采用Western blot法。取新鮮冰凍RCC的癌組織和癌旁組織，加入0.5 mL組織裂解液進行裂解。BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取50 μg組織總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白濕轉至 PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗RGS4(1∶500)及抗內參GAPDH(1∶20 000)抗體室溫孵育1 h，TBST漂洗后辣根過氧化物酶標記的二抗(抗鼠/抗兔)(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗后電化學發光法檢測。所有陽性條帶均利用Image J軟件分析其灰度值，以內參條帶為蛋白定量參考，以RGS4與GAPDH的相對表達量作為RGS4表達量。

1.4 RCC癌組織及癌旁組織RGS4 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。提取癌旁組織、癌組織RNA，反轉錄后，SYBR法檢測mRNA水平。2-ΔCt法分析數據。

2 結果

2.1 RCC癌組織及癌旁組織RGS4蛋白定性表達比較 RGS4特異性表達于腎細胞的細胞質中，在癌旁組織中為淺黃色，在癌組織中多數為深黃色。癌旁組織、RCC癌組織RGS4蛋白表達陽性率分別為24.2%(29/120)、37.5%(45/120)，RCC癌組織RGS4蛋白表達陽性率高于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 RCC癌組織及癌旁組織RGS4蛋白半定量表達比較 癌旁組織、RCC癌組織RGS4蛋白表達量分別為0.66±0.03%、1.02±0.03，RCC癌組織RGS4蛋白表達量高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 RCC癌組織及癌旁組織中RGS4蛋白表達情況(Western blot法)

2.3 RCC癌組織及癌旁組織RGS4 mRNA表達比較 癌旁組織、RCC癌組織RGS4 mRNA表達量分別為0.93±0.04、1.67±0.04，RCC癌組織RGS4 mRNA表達量高于癌旁組織(P<0.05)。

2.4 不同臨床病理特征的RCC患者癌組織RGS4蛋白表達情況 RGS4在中重度腫瘤浸潤患者中的陽性率顯著高于輕度浸潤患者(P<0.05)。不同性別、年齡、腫瘤直徑的RCC患者癌組織中RGS4表達差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征的RCC患者癌組織RGS4蛋白表達情況(例)

3 討論

作為泌尿系統最常見的腫瘤之一，RCC的診斷及治療手段十分有限，其致病和發展的調控機制一直是RCC相關分子研究的重點，但對RCC相關信號通路的研究尚不深入。G蛋白信號通路是生物體中作用最廣泛的信號通路，其中多種調節因子參與腎癌的致病調節[6,7]。有研究表明，RGS5在腎癌組織中的表達率是正常組織的6.6倍，并可抑制血管緊縮素Ⅱ、血小板衍生生長因子等多種血管發育關鍵因子，在腫瘤血管生成中發揮作用[8]。RGS4作為G蛋白信號通路的調節因子之一，在肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌中均發揮作用，但在腎癌中的研究仍為空白。

G蛋白偶聯受體(GPCR)屬于細胞表面受體蛋白，可以激活G蛋白三聚體，從而將細胞外信號傳導到細胞內部，參與多種生物體信號的調控，并在腫瘤發生發展中具有重要的調節作用[9]。大量研究顯示，許多GPCR在多種類型的腫瘤中與血管生成和轉移密切相關，如CXC趨化因子受體4(CXCR4)、溶血磷脂酸受體和前列腺素E2受體[10,11]。RGS是GPCR通路的關鍵調節因子，含有高度保守的RGS結構域，具有GAP活性，可阻斷GPCR介導的信號傳遞并抑制其下游級聯效應，對G蛋白信號轉導發揮負性調節作用。研究發現，RGS蛋白能夠加速GTP酶活性達1 000倍，從而產生巨大的生理效應。除了作為異三聚體G蛋白的GAP功能，RGS結構域也作為效應拮抗劑起作用，通過競爭性結合G亞基或效應酶或動力支架，促進Ga亞基在激活和失活狀態之間快速循環，從而實現對信號通路的調節作用[12,13]。近年研究[14,15]發現，RGS在多種類型癌組織中表達異常，RGS基因突變與肺癌和膀胱癌的患病風險降低相關。此外，RGS蛋白在前列腺癌、急性髓細胞白血病、卵巢癌、結腸癌和腫瘤血管生成中均發揮特異性作用[16～18]。研究顯示，在高轉移性乳腺癌細胞中，RGS4的mRNA水平顯著增加，并通過調節小G蛋白Rac活性調節腫瘤轉移[19]。在RCC中，小G蛋白Rac信號途徑參與調節金屬蛋白酶組織抑制劑等重要分子的活性，因此RGS4可能通過調節小G蛋白Rac活性或G蛋白的激活頻率及活化時間，從而參與RCC調控[20]。然而，關于RGS4蛋白在RCC發病中的作用尚不明確。本研究發現，RCC癌組織中RGS4蛋白及mRNA表達均高于癌旁組織，提示RGS4可能參與了RCC的發生發展；中重度浸潤的RCC患者RGS4陽性率高于輕度浸潤患者，提示RGS4可能與腫瘤浸潤程度有關，進而發揮其促進RCC生長的作用。

綜上所述，RCC癌組織中RGS4表達增高，其增高程度與腫瘤浸潤程度有關，參與RCC的發生發展，RGS4有望成為RCC治療中一個潛在的有效靶點。