氯沙坦對動脈粥樣硬化兔主動脈內皮細胞凋亡的影響及機制探討

黃文，談紅，王潞，晉群

(1武警山東省總隊醫(yī)院，濟南250014；2濟南軍區(qū)總醫(yī)院)

內皮功能損傷在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用。引起內皮功能損傷的因素眾多，其中內皮細胞凋亡是重要因素之一。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)抑制劑廣泛應用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)的治療，可改善患者的長期預后。近年研究發(fā)現，血管緊張素Ⅱ1型受體阻斷劑(ARB)氯沙坦具有保護血管內皮細胞功能的作用，但其作用機制尚不完全明確。2016年3～7月，我們觀察了氯沙坦對兔動脈粥樣硬化模型粥樣斑塊內皮細胞凋亡的影響，探討氯沙坦對粥樣斑塊內皮細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及干預方法 14周齡雄性清潔級新西蘭大白兔25只，體質量(2.2±0.2)kg，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心。將25只兔隨機分為正常對照組5例、高膽固醇組10例、氯沙坦組10例。高膽固醇組、氯沙坦組均以高脂飼料(含1%膽固醇和0.5%豬板油)喂養(yǎng)，正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)。氯沙坦組同時給予氯沙坦25 mg/(kg·d)灌胃，正常對照組和高膽固醇組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。共干預16周。

1.2 主動脈內皮細胞形態(tài)觀察 干預結束后處死各組兔，取主動脈弓處1 mm3左右動脈組織，2.5%戊二醛固定，制成超薄組織切片，采用JEM-1200EX透射電鏡觀察選取組織的超微結構。

1.3 內皮細胞增殖周期及凋亡檢測 于髂總動脈分叉以上取2 cm主動脈，仔細分離內膜層，70%乙醇固定，充分研磨，過濾后1 500 r/min離心5 min，加入PI工作液0.5 mL，避光30 min。調整流式細胞儀，變異系數穩(wěn)定在2%以內，收集2×104個細胞，檢測完成后根據流式細胞圖分析細胞周期和凋亡率，以G0、G1期為細胞靜止期，S、(G2+M)期分別為細胞分裂前期和分裂期，以ModiFit軟件進行數據分析，計算細胞凋亡率。

1.4 動脈壁內c-myc蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取主動脈組織，以c-myc鼠單克隆抗體進行免疫組化染色，c-myc陽性顆粒呈棕黃色，在細胞核和核漿中均有表達。在400倍光學顯微鏡下觀察10個視野，計數陽性細胞所占細胞總數的百分比，取其平均值。采取半定量記分，表達陰性為0分，陽性細胞數<25%為1分，陽性細胞數25%～50%為2分，陽性細胞數51%～75%為3分，陽性細胞數>75%為4分。

1.5 動脈壁內半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspases-3) mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取-80 ℃保存的動脈壁組織，TRIzol法提取總RNA。引物序列：5′-TTTGTTTGTGTGCTTCTTCTGAGGCC-3′，5′-ATTCTGTTGCCACCTTTCGG-3′。擴增條件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。以GAPDH做為內參照，Caspases-3與GAPDH擴增條帶的光密度比值作為Caspases-3相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用完全隨機設計的t檢驗；以Ridit檢驗計算半定量資料平均Ridit值(Ri)和95%可信區(qū)間(95%CI)，組間Ri比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組主動脈內皮細胞形態(tài)變化 正常對照組主動脈內皮細胞呈扁平梭形，核較小，核周的胞質較豐富，含有高爾基復合體、中心體、多胞體和溶酶體等。高膽固醇組內皮細胞通透性增高，細胞間連接結構破壞、斷裂甚至發(fā)生變性和脫落，核濃縮，染色質濃縮，胞核體積縮小，可見凋亡小體。氯沙坦組內皮細胞損傷明顯改善，未見凋亡小體形成。

2.2 各組內皮細胞增殖周期比例及細胞凋亡率比較 正常對照組、氯沙坦組細胞均以靜止期為主，而高膽固醇組細胞以分裂前期及分裂期為主。由于細胞增殖周期各組標準差較大，各組比較差異無統(tǒng)計學意義。正常對照組及氯沙坦組細胞凋亡率均低于高膽固醇組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組血管內皮細胞增殖周期比例及細胞凋亡率比較

注：與高膽固醇組比較，*P<0.05。

2.3 各組動脈壁內c-myc蛋白表達比較 正常對照組、高膽固醇組、氯沙坦組c-myc陽性表達半定量評分分別為1.000、3.143、1.500，Ri分別為0.19、0.73、0.39，95%CI分別為-0.11～0.49、0.52～0.94、0.15～0.63，高膽固醇組c-myc表達高于正常對照組，氯沙坦組c-myc表達低于高膽固醇組(P均<0.05)。

2.4 各組動脈組織Caspeses-3 mRNA表達比較 正常對照組、高膽固醇組、氯沙坦組高膽固醇組動脈組織Caspeses-3 mRNA相對表達量分別為0.51±0.14、2.44±1.13、1.48±0.52，高膽固醇組動脈組織Caspeses-3 mRNA表達高于正常對照組(P<0.01)，氯沙坦組動脈組織Caspeses-3 mRNA表達低于高膽固醇組(P<0.01)。

3 討論

內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期階段，也是動脈粥樣硬化的始動因素，同時也是發(fā)生動脈粥樣硬化的必備條件。近年來，動脈粥樣硬化斑塊中細胞凋亡的作用引起關注。粥樣斑塊的消退與細胞凋亡密切相關[1]。Gonzalez等[2]研究發(fā)現，巨噬細胞凋亡在粥樣斑塊發(fā)展、斑塊內壞死核心產生和易損斑塊形成中起到重要作用。內皮細胞凋亡可通過影響內皮損傷修復功能、導致血管舒縮功能障礙[3]、增加斑塊不穩(wěn)定性、促進血栓形成和急性冠脈事件的發(fā)生[4]，從而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。近年研究表明，RAAS可通過一系列作用機制，與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，如促進血管內皮細胞增殖、抑制其凋亡、引起內皮功能失調、誘導癌基因表達、抑制纖溶、與激肽系統(tǒng)相互作用等。因此，RAAS與動脈粥樣硬化的關系已成為新的研究熱點[5]。

氯沙坦作為血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑，早先作為抗高血壓類藥物廣泛應用于臨床，近年研究發(fā)現，除降壓作用以外，氯沙坦還可以改善心室重構、改善內皮功能，進而改善冠心病患者的長期預后，但其作用機制有待進一步研究[6]。Derosa等[7]研究發(fā)現，氯沙坦聯合應用鈣離子拮抗劑可顯著改善糖尿病和高血壓患者的內皮損傷和氧化應激。Zhu等[8]研究發(fā)現，自發(fā)性高血壓大鼠給予氯沙坦治療后，內皮細胞結構更加平滑完整，內皮損傷得到改善。本研究發(fā)現，與高膽固醇組比較，氯沙坦組的內皮細胞損傷明顯改善，未見凋亡小體形成，靜止期細胞比例增加、分裂前期及分裂期細胞比例減少，細胞凋亡率降低，提示氯沙坦可抑制動脈粥樣硬化兔的主動脈粥樣斑塊凋亡，表明氯沙坦可能通過抑制內皮細胞凋亡而延緩動脈粥樣硬化進程。

Caspases蛋白酶是一組半胱氨酸蛋白酶家族，具有蛋白酶的生物學特性。人類Caspases基因有12種，多數與凋亡有關[9]，其中Caspases-3參與凋亡過程的終末期，在凋亡病理過程中起到重要作用。Hachani等[10]以高膽固醇飲食誘發(fā)去交感神經大鼠動脈壁內細胞的凋亡，檢測到Caspases基因的表達顯著增加。Lloyd給予人冠狀動脈內皮細胞以氧化應激刺激，發(fā)現內皮細胞的凋亡呈現Caspases依賴性，包括Caspases-3、7，說明Caspases途徑在凋亡發(fā)生機制中的重要調節(jié)作用[11]。也有研究發(fā)現缺氧導致的成人心肌細胞凋亡有Caspases基因的參與[12]，應用Caspases 抑制劑可減少缺血及再灌注損傷[13]，同時Caspases-3還可以調控心肌病心衰患者的心肌細胞凋亡[14]。總之，Caspases 與心血管疾病相關的細胞凋亡密切相關。本研究發(fā)現，氯沙坦組動脈組織Caspeses-3 mRNA表達低于高膽固醇組，提示氯沙坦可顯著抑制動脈粥樣斑塊內Caspeses-3 mRNA的表達，可能參與抑制內皮細胞凋亡的過程，從而延緩動脈粥硬化的發(fā)生發(fā)展。

c-myc蛋白為核內結合蛋白，具有細胞轉化的能力，在調節(jié)細胞生長、分化及惡性轉化中起重要作用。c-myc蛋白被激活時，可結合到基因組中特定的調控序列，進一步激活與細胞增殖和分化有關的基因，促進細胞增殖，抑制凋亡。在球囊損傷引起的大鼠平滑肌細胞增殖和內膜增生中存在c-myc表達的增加[15]，虎杖苷通過激活eNOS/SIRT1途徑，抑制c-myc表達，抑制氧化應激誘導的血管平滑肌細胞增殖[16]。Inafuku等[17]研究了日本鵪鶉主動脈粥樣硬化斑塊中細胞周期調節(jié)基因和蛋白，發(fā)現c-myc mRNA的表達顯著增加。因此，c-myc是細胞增殖調節(jié)的重要蛋白之一。本研究發(fā)現，氯沙坦組動脈組織c-myc蛋白表達低于高膽固醇組，提示氯沙坦可顯著抑制動脈粥樣斑塊內c-myc蛋白的表達，可能參與抑制內皮細胞凋亡的過程，從而延緩動脈粥硬化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，氯沙坦可顯著抑制動脈粥樣斑塊形成，其作用機制可能與下調c-myc、Caspases-3表達，進而抑制內皮細胞凋亡密切有關。