放射性腦損傷對小鼠情緒的影響及機制探討

李濤，張慎貴，趙文博，宋巖，王新立，于永慧，孫晉浩，王洪杰

(1濟南市第四人民醫院，濟南250031；2山東大學基礎醫學院；3山東大學齊魯醫院；4山東省立醫院)

放射性腦損傷是指對腦部或腦鄰近部位實施放射治療后引起的腦組織損傷。研究發現，放療患者經常會出現進行性認知功能障礙[1]和情緒異常，如焦慮、抑郁等，嚴重影響患者的生存質量[2]。目前，對放射性腦損傷導致情緒變化的原因尚不明確。2016年1～6月，我們采用8 Gy照射劑量建立放射性腦損傷小鼠模型，采用開場實驗和懸尾實驗評價小鼠的情緒變化，并觀察小鼠海馬神經元形態變化，探討放射性腦損傷對情緒的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 4～6周齡C57BL/6J雄性小鼠24只，購于山東大學基礎醫學院動物室。將小鼠隨機分成對照組、照射組各12只。動物實驗程序通過了山東大學動物保護和使用委員會批準，遵守照顧和維護實驗動物的法律授權和國家的指導方針。

1.2 照射方法 照射組進行頭部電子線照射建立放射性腦損傷模型。使用Elekta Precise直線加速器，20 cm×20 cm電子線限光筒，制作1 cm厚度鉛模，照射野大小2.0 cm×1.5 cm，使照射野上界位于小鼠雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，以保護雙眼、鼻腔及口腔。照射前使用4%水合氯醛腹腔注射后，俯臥位固定于自制圓形木板上，使小鼠腦部與限光筒鉛模射野一致。給予6 MeV電子線、400 mu/min劑量率、源皮距100 cm、8 Gy的組織吸收劑量行一次性照射，建立放射性腦損傷模型。對照組麻醉后放在相似的環境中，但不進行照射。

1.3 焦慮反應評價 采用開場實驗評價動物焦慮反應。所有小鼠于照射后第7天行開場實驗檢測。使用活動觀察箱大小為40 cm×40 cm×40 cm，底面等分為25個格子，依次將每只小鼠輕放于箱中，使用自發活動分析軟件分析10 min內小鼠的自發活動情況。將中央3/5的區域定義為中央區域，記錄小鼠中央區域的活動路程及活動總路程、中央區活動時間、活動次數、10 min內糞便數量。

1.4 抑郁反應評價 開場試驗后，小鼠休息2 h，行懸尾試驗。在懸尾實驗操作箱頂部中心繩連有一個小書夾，夾住裹有小鼠尾尖(尾巴末端0.5～1 cm)的膠布并使之倒懸，小鼠頭部距離底部4～5 cm。總時間為6 min，記錄后4 min內小鼠的懸尾不動時間。懸尾不動判斷標準：小鼠四肢完全不動或僅有足部輕度掙扎動作。

1.5 海馬組織病理觀察 照射后第7天行開場實驗及懸尾實驗檢測后，將小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，經左心室插管至升主動脈，先用生理鹽水 100 mL 快速沖洗，隨后用PBS液200 mL先快后慢進行灌注，灌注后30 min取腦，放入10%甲醛溶液中固定，12 h后取材、脫水、包埋、切片、烤片、染色、封片。顯微鏡下觀察海馬神經元細胞形態。

2 結果

2.1 兩組焦慮反應指標比較 與對照組比較，照射組中央區活動時間增加，活動次數、10 min內糞便數量均減少(P<0.05或0.01)。兩組活動總路程、中央區活動路程差異無統計學意義。見表1。

表1 兩組焦慮反應指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.2 兩組抑郁反應指標比較 對照組、照射組懸尾不動時間分別為(52.00±7.61)、(74.16±13.35)s，照射組懸尾不動時間長于對照組(P<0.01)。

2.3 兩組海馬組織病理表現 對照組海馬各部位結構及層次清楚，細胞形態完整，結構清晰，染色均勻。照射組海馬神經元變性壞死，細胞體積變大，細胞質內空泡變性、核固縮，染色不均勻。見圖1。

3 討論

放射治療是治療鼻咽癌、腦膠質細胞瘤、轉移瘤等頭頸部腫瘤的主要方法之一，隨著立體定向放療、三維適形調強放療等放療技術的不斷發展，腫瘤患者的生存時間不斷延長，但放療所導致的放射性腦損傷越來越受到廣泛的關注。急性放射性腦損傷多數發生在照射后很短時間內，一般為1～7 d，主要由放射線對腦組織的直接損傷作用、血腦屏障受損、通透性增加等所致的腦水腫導致[3,4]。研究表明，單次照射劑量>3 Gy及照射野體積過大均可以導致急性放射性腦損傷的發生[5]。放射性腦損傷患者的常見臨床癥狀包括頭痛、肢體活動障礙、認知功能障礙和情緒改變等。情緒改變是放射性腦損傷后常出現的癥狀之一。范興文等[6]研究發現，腦部照射1個月后可導致大鼠活動度降低、焦慮水平增加。但目前，對于急性放射性腦損傷后的情緒障礙尚待深入研究。

注：A為對照組；B為照射組。

圖1 兩組小鼠海馬組織病理表現(HE染色，×100)

開場實驗是評價焦慮行為的常用方法之一[7]。因動物在敞箱中會對新鮮環境產生恐懼，主要在敞箱內的周邊部活動，中央區域對其來說具有潛在的威脅，故而在中央區活動較少，從而可以反映其焦慮水平變化。開場試驗中動物排便數量通常作為一個測量動物焦慮行為的指標。本研究結果顯示，與對照組比較，照射組中央區活動時間、活動次數、10 min內糞便數量均減少，表明小鼠在放射性腦損傷后急性期焦慮水平升高。小鼠懸尾試驗是最常用的監測動物抑郁行為的實驗，以一定時間內小鼠的懸尾不動時間來反映其絕望情緒。本研究發現，與對照組相比，照射組小鼠的懸尾不動時間明顯延長，表明放射性腦損傷急性期小鼠抑郁水平明顯升高。

海馬在學習記憶和情緒調節中都起重要作用。研究發現，海馬對射線具有高度敏感性，射線照射后，海馬神經元數量明顯減少、突觸密度明顯降低，并呈現放射劑量依賴性，這種變化可以持續至少1個月[8]。研究證明，顱內照射海馬齒狀回區神經干細胞后可導致一些神經心理缺陷，其原因可能與照射后海馬神經減少、血腦屏障破壞、突觸密度降低、脫髓鞘等有關[9～11]。射線照射后損傷加重的機制可能與神經興奮性毒性、炎性反應、應激反應、血管內皮老化等有關[12～14]。本課題組前期研究發現，X線照射能抑制海馬神經干細胞增殖，并通過激活胱天蛋白酶-1誘導神經干細胞凋亡，使用胱天蛋白酶-1抑制劑阻斷體內和體外胱天蛋白酶-1激活后，神經干細胞凋亡減少[15]。本研究發現，照射組海馬神經元變性壞死，細胞體積變大，細胞質內空泡變性、細胞核固縮，提示照射后可使小鼠海馬組織變性壞死，放射性腦損傷急性期出現的焦慮抑郁水平升高可能與海馬神經元損傷有關。

綜上所述，放射性腦損傷可導致小鼠焦慮及抑郁水平升高、活動度減低，其原因可能與海馬神經元受損有關。