漿細胞瘤異位基因1表達下調對高糖環境下腎小球系膜細胞增殖的影響及機制

李敏，吳汪麗，彭云，肖一平

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州510260)

糖尿病腎病是終末期腎臟疾病的主要發病原因，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，主要通過調節蛋白編碼基因，影響蛋白質編碼基因的表達水平、穩定性和細胞定位等，參與調控多種進程，如細胞分化、生長發育、腫瘤的發生發展等[2,3]。研究發現，許多lncRNA在腎臟發育和腎臟疾病發病中發揮一定的調控作用[4]。漿細胞瘤異位基因1(PVT1)為lncRNA，是目前惟一一個與腎臟疾病相關的lncRNA[5]，與糖尿病腎臟疾病的發生和發展密切相關。研究發現，PVT1在糖尿病患者的腎小球系膜細胞表達豐富，但不表達相關蛋白，其可能代表一個非編碼RNA，當發生擴增和過度表達時，可促進細胞增殖[6]。腎小球細胞外基質(ECM)的過度堆積在糖尿病腎病發展中發揮核心作用[7,8]。2015年2月～2016年5月，我們采用小干擾RNA(siRNA)技術抑制腎小球系膜細胞PVT1 mRNA表達，觀察下調PVT1表達對高糖環境下腎小球系膜細胞增殖及ECM相關蛋白表達的影響，探討PVT1在糖尿病腎臟疾病發生、發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人腎小球系膜細胞購自美國Scien Cell公司。胎牛血清和DMEM購自美國Gibco公司；siRNA轉染試劑Lipofecttamine2000購自美國Invitrogen公司；Annexinv-FITC/PI凋亡試劑盒和周期檢測試劑盒購自中國凱基公司；PVT1、纖維連接蛋白(FN)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAT-1)、羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；總蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 膠試劑盒購自中國碧云天公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒購自日本Takara公司；PVT1 siRNA和control siRNA由上海吉凱制藥技術有限公司合成。

1.2 細胞分組、干預及轉染方法 細胞培養后，以2×105/孔常規培養于6孔板，分為正常對照組、高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組。正常對照組在5.55 mmol/L的低糖DMEM完全培養基中培養，高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組均在25 mmol/L的高糖DMEM完全培養基中培養。待融合度達70%時，將高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組培養基換成Opti-MEM培養基，嚴格按GenePharma RNAi產品使用手冊的Protocol進行操作，分別轉染control siRNA、PVT1 siRNA。

1.3 細胞增殖檢測 采用CCK-8法。各組細胞于37 ℃、5%CO2條件下分別培養0、24、48、72 h后，嚴格按CCK-8試劑盒說明書步驟進行操作，測定每個時間點各組細胞OD值，以實驗組OD值/陰性對照組OD值×100%計算細胞增殖率。

1.4 細胞周期檢測 采用流式細胞術。將各組細胞消化收集，制備單細胞懸液，預冷PBS清洗2～3次，重懸細胞于EP管中，70%乙醇固定，-20 ℃過夜，PI/Rnas染色，按細胞周期檢測試劑盒說明書操作，于流式細胞儀上檢測細胞G1、S期的比例。

1.5 PVT1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。各組細胞培養48 h時，去掉原培養基，使用預冷的PBS洗滌細胞；TRIzol法提取細胞總RNA，以提取的總RNA為模板，逆轉錄cDNA，反應體系為70 ℃，保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min，42 ℃ 60 s，72 ℃ 15 s。按照 qRT-PCR試劑盒(RR420A)SYBR Green法進行擴增，擴增40個循環周期，每個標本3個復孔。人PVT1引物序列為上游：5′-GCCCTCCAGCCTGATCTTTT-3′，下游 5′-CAGCGTTATTCCCCAGACCA-3′。檢測PVT1 mRNA的相對表達量。

1.6 ECM相關蛋白表達檢測 采用Western blot法，檢測ECM相關蛋白FN、TGF-β1及PAT-1蛋白的表達。各組細胞培養48 h時，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。上樣量為20 μg 總蛋白，經5%的濃縮膠和6%的分離膠SDS-PAGE電泳；濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min。濕轉法轉膜100 V，60 min，5%BSA封閉60 min，免疫抗體反應(稀釋比例，一抗 1∶1 000；二抗1∶5 000)。ECL化學發光，醫用X光底片顯影。使用Quantity One分析電泳條帶的灰度值，與GAPDH比較計算相對表達量。

2 結果

2.1 各組不同時間細胞增殖率比較 高糖組細胞各時點細胞增殖率均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組各時點細胞增殖率均低于高糖組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖率比較

注：與正常對照組比較，#P<0.05，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

2.2 各組細胞周期比例比較 與正常對照組比較，高糖組細胞G1期比例減少、S期比例增多；與高糖組比較，高糖+PVT1 siRNA組細胞G1比例增加、S期比例減少(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細胞周期比例比較

注：與正常對照組比較，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

2.3 各組細胞PVT1 mRNA表達比較 正常對照組、高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.03、7.73±0.06、7.12±0.10、1.92±0.05，高糖組、高糖+control siRNA組PVT1 mRNA相對表達量均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量低于高糖組(P均<0.05)。

2.4 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達比較 高糖組、高糖+control siRNA組、高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均高于正常對照組，高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均低于高糖組(P均<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達比較

注：與正常對照組比較，△P<0.01；與高糖組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

注：1為正常對照組；2為高糖組；3為高糖+control siRNA組；4為高糖+PVT1 siRNA組。

圖1 各組細胞FN、TGF-β1及PAT-1蛋白表達情況(Western blot法)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病引起的嚴重和危害較大的一種慢性并發癥，是終末期腎病患者的主要死因之一。糖尿病腎病的發生和發展主要由遺傳易感性及高糖環境因素相互作用引起的。高血糖可改變腎小球內血流動力學，促進腎臟ECM沉積。糖尿病腎病在早期可因糖尿病微血管病變導致腎小球濾過功能亢進，而在后期可發生ECM積聚和腎小球硬化，其中腎小球系膜細胞發揮了中心作用[8]。近年研究發現，lncRNA與慢性腎臟疾病的發病有關。Lorenzen 等[9]研究發現，在急性腎損傷危重患者血液中可檢測到lncRNA Tap SAKI，且其水平與疾病的嚴重程度相關。Sui等[10]通過基因芯片分析發現，非IgA原發性腎小球疾病患者系膜區系膜細胞lncRNA明顯增多。但目前，lncRNA在腎臟疾病中的研究主要集中在檢測其表達差異，而其作用機制研究相對較少。

PVT1位于人染色體8q24，參與該部位以及2、22號染色體之間的復發性易位，參與細胞周期、細胞凋亡和細胞轉化重要進程[11]。Hanson等[11]研究發現，PVT1位點與2型糖尿病的發病顯著相關，PVT1是終末期腎病的易感基因部位。PVT1與1型糖尿病引起的終末期腎病有關。研究表明，PVT1可導致腎小球ECM沉積。本研究發現，高糖組PVT1 mRNA相對表達量均高于正常對照組，結合高糖組細胞增殖率高于正常對照組、S期細胞比例增多的結果，考慮高糖環境下，腎小球系膜細胞的增殖明顯加快，可能與PVT1表達增加有關；高糖+PVT1 siRNA組PVT1 mRNA相對表達量低于高糖組，結合高糖+PVT1 siRNA組細胞增殖率低于高糖組、S期比例減少的結果，考慮抑制PVT1表達后，可明顯抑制高糖環境下腎小球系膜細胞的增殖。

ECM是由細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面和細胞之間的大分子，主要是多糖、蛋白或蛋白聚糖。ECM不屬于任何細胞，其決定結締組織的特性，為細胞的生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉導系統影響細胞的形狀、代謝、遷移、增殖和分化。ECM積聚是糖尿病腎病的特點之一。高糖可引起纖溶酶原激活物抑制物過度表達，纖溶酶原轉變纖溶酶受抑制，ECM降解減少，導致腎小球硬化、腎臟纖維化。腎小球系膜細胞功能紊亂，分泌大量的細胞因子，包括TGF-β1、FN、COL4A1、PAI-1等ECM合成成分。TGF-β1在ECM作用主要是增加基質合成，此外，TGF-β1可通過抑制MMPs和促進TIMPs的合成，直接影響ECM的表達[13]。TGF-β1表達增加時，可刺激腎小球系膜細胞內蛋白多糖、膠原和纖維連接蛋白的產生，引起ECM合成增加。FN主要是促使細胞與基質結合，使ECM形成網絡；或與細胞表面的受體結合，使細胞附著于ECM上，并通過膜整合蛋白將細胞外與細胞內連成一個整體。PAI-1可激活多種蛋白溶解酶，降解ECM、基底膜；促進uPA-uPAR的細胞降解內吞，防止ECM降解過度。ECM蛋白的關鍵調控因子PAI-1表達升高時，可破壞系膜細胞產生纖維蛋白誘導的能力，使ECM降解緩慢，系膜增生。本研究發現，高糖組FN、TGF-β1、PAT-1表達均高于正常對照組，提示高糖環境下，腎小球系膜細胞中的TGF-β1、FN、PAI-1蛋白表達增加，可能參與了腎小球系膜細胞增殖的過程；高糖+PVT1 siRNA組FN、TGF-β1、PAT-1表達均低于高糖組，提示抑制PVT1表達后，FN、PAI-1、TGF-β1蛋白表達均降低，可能與高糖環境下腎小球系膜細胞增殖受到抑制有關。

綜上所述，高糖環境可明顯促進腎小球系膜細胞的增殖，且ECM相關蛋白表達增加，可能是導致ECM積聚的機制之一；抑制PVT1表達后，腎小球系膜細胞增殖受到抑制、ECM相關蛋白表達減低，表明下調PVT1表達可通過抑制腎小球系膜細胞增殖及ECM積聚，減緩或抑制糖尿病腎病的發生發展。