食物蛋白質體外消化模型研究進展

游義嬌,佟 平,袁娟麗,3,陳紅兵,高金燕,2,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學生命科學與食品工程學院,江西南昌 330047;3.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

食物蛋白質體外消化模型研究進展

游義嬌1,2,3,佟 平1,袁娟麗1,3,陳紅兵1,2,3,高金燕1,2,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學生命科學與食品工程學院,江西南昌 330047;3.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

體外消化模型是代替體內研究食物蛋白消化的一種重要手段,具有簡單易行、可復制等優點。然而體外消化效率受樣本類型及消化條件的影響顯著,如何更準確的模擬體內生理環境和消化過程,是建立體外消化模型的關鍵。本文詳細介紹了目前已建立的不同類型的食物蛋白質體外消化模型,包括靜態模型和動態模型、單室模型和多室模型、單酶體系及多酶體系消化模型,并分析比較其優缺點及適用范圍,為根據不同研究目的選擇恰當的消化模型提供理論參考,并為標準化體外消化模型提供支撐。

體外消化,消化模型,蛋白質消化

體內評估和體外模擬是研究食物消化的常用方法。體內實驗雖然可以更準確地反映真實情況,但往往存在研究周期長、費用高、結果重現性差、受倫理道德約束、且個體間有差異等問題[1]。而體外模擬則具有簡單、便宜、快速、通用、可再生等優點,從而被廣泛應用于食物或藥物的研究[2]。如研究食物消化的穩定性、腸道運輸和代謝、預測食物成分的生物利用率以及藥品轉運等。體外模擬也常用于食物蛋白在體內消化吸收的機理研究,探究攝入物質在體內的轉運機制[3]?？傊?體外模擬是為了盡可能模擬人體內的生理過程,以供實驗和研究需要。

由于體外消化受酶的種類、酶與底物的比例、pH、消化時間、離子強度等因素的影響[4],為了能更準確地模擬攝入物的消化過程,則需要嚴格模擬體內生理環境。早在2009年,Hur等[5]較詳細地介紹了體外消化模型在食品方面的應用,并對消化過程的酶、樣品基質、消化時間、轉運時間等參數條件進行了細致描述。該綜述增強了人們對體外消化模型的理解,并為用于食品和藥品的體外消化模型的改進提供了科學參考信息。近年來,隨著研究發展,出現了一些不同類型的消化模型,而且體外模擬的條件也越來越趨近于體內的真實狀態[6]。食物蛋白體外消化模型按照是否模擬了消化的動態過程,可分為體外靜態模型和體外動態模型;按照消化腔室的多少,可分為單室消化模型和多室消化模型;按照使用酶的多少,可分為單酶體系消化模型和多酶體系消化模型。當前研究的主要目標是對消化模型和消化程序標準化,并關注實驗結果的驗證及其重現性[7]。有鑒于此,本文通過回顧并綜述最新的消化模型研究及其應用進展,期望對食物蛋白體外消化模型的發展提供重要的參考信息。

1 靜態模型和動態模型

靜態模型是一種只模擬了體內生理環境而沒有模擬人類消化時動態過程的體外消化方式。動態模型則是人們為了更準確地模擬體內的生理環境和物理化學活動,考慮了一系列動態變量因素后設計的消化模型。在模擬人類胃腸道對食物基質消化時,靜態模型一般不經過物理力量,缺少胃排空、pH改變、分泌物流速等條件的控制。此外,在靜態多室模型中,消化產物在各隔室中不能自動呈遞,需人為轉移來模擬各階段的連續性消化。因此,為了克服靜態模型中的這些限制,建立了動態模型。與靜態模型相比,動態模型不僅嚴格模擬了體內生理環境,而且設計了部分動態消化程序,如攝取物質在胃腸道內的逐步運輸,消化隔間的動態排空以及每個階段的蠕動混合,這些變量因素對蛋白質的消化率的測定有重要影響[8]。

在已有的實驗報道中,靜態模型是使用最廣泛的消化模型,早期Hur等[5]就對體外消化模型的消化條件進行了概述。在Hur等人的研究基礎上,Hollebeeck[7]通過運用響應面設計pH、培養時間、酶濃度三因素,評估它們對食品基質消化的影響,實驗得出的最優消化程序包括:口腔消化階段:pH6.9,消化時間為5 min,α-淀粉酶酶活為3.9 U/mL;胃消化階段:pH2,消化時間為90 min,胃蛋白酶酶活為71.2 U/mL;十二指腸消化階段:pH7,消化時間為150 min,胰液素9.2 mg/mL,膽鹽55.2 mg/mL。該研究最終確立了一個快捷、低成本的體外靜態消化程序,可用于研究食物蛋白在體內的靜態消化。

近年來,基于人體內的實際消化情況,Minekus等[9]則提出了一種通用、實用的靜態消化方法,這種消化方法能應用于各類食品的消化。該研究中提供了口腔、胃、小腸各階段的消化參數,并討論了體內可利用參數與酶的相關性。其消化條件為:口腔消化:樣品中加入模擬唾液與唾液淀粉酶(75 U/mL)的等比混合液,在pH7的環境中消化2 min;胃消化:在口腔消化物中加入模擬胃液與胃蛋白酶(2000 U/mL)的等比混合物,調pH為3,消化2 h;小腸消化:在上述胃消化物中添加模擬腸液與酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、輔脂酶、膽鹽、胰液素)的等比混合物,調pH為7,消化2 h。各階段消化時的溫度均為37 ℃。該方法為建立標準靜態體外消化方法提出了詳細的建議和指導,也為未來標準化消化模型的研究提供了依據。

隨著相關靜態模型的發展,少數體外動態模型也逐步被建立。動態模型的建立主要是基于體內數據,通過增加HCl模擬胃中食物的酸化,同時設置了蛋白酶的流速和胃的排空等條件[10]。動態模型的發展已經提升到越來越細化的水平,如配備多少復雜消化液,或者使用自動化系統控制消化產品通過各隔室的路徑等。如,DGM[11]和HGS[12]模型僅模擬了胃消化階段,忽略了食糜進入小腸后的情況,屬于動態胃模型。Vatier[13]和Mainville[14]等則通過增加HCl來調節胃中pH變化,同時利用磁力攪拌器混合食糜,分別模擬了胃和十二指腸階段的連續消化。兩者不同的是,Vatier在模擬十二指腸時,分別模擬了其近端和末端,而Mainville則對十二指腸階段進行整體模擬,并在消化過程中增加了膽鹽的應用。

迄今為止,TIM[15]模型(TNO gastro-intestinal tract model)是模擬胃腸道消化最系統和最全面的動態模型,由胃、十二指腸、空腸和回腸四部分構成,該模型對溫度、pH變化、胃和小腸的交接、轉運時間、蠕動混合、逐步運輸、蛋白酶的連續增加、水和小分子的吸收等參數進行了設定。TIM模型也是最接近人類胃腸道體內消化的體外動態模型,已應用于營養學等領域[16-17]。如,Villemejane等[18]利用TIM動態多室模型,探究了餅干中的蛋白質和纖維素對其蛋白水解程度的影響。研究發現,消化形式和樣品的處理方式均會影響餅干的消化結果,而且這兩種營養素混合后模擬消化使蛋白水解度降低,裝置示意圖如圖1所示。

圖1 動態多室消化模型:TIM模型[18]Fig.1 Dynamic multicompartmental model:TIM model (TNO gastro-intestinal tract model)[18]

動態模型設備復雜,成本較高,一般應用于復雜食物基質中蛋白質動態消化研究。靜態模型簡單方便,主要應用于單一蛋白的體外消化評價。與動態模型相比,靜態模型在實際應用中較多,但隨著研究工作的深入,動態模型的科學價值必將日益凸顯。

2 單室模型和多室模型

在體外模擬時,根據消化腔室選擇的不同,體外消化模型又可分為單室和多室模型。單室模型是指根據實際研究的需求,單獨模擬某個階段的消化,主要是用于單一隔室消化情況的研究,如模擬胃對蛋白質的消化。根據是否模擬了體內消化的動態過程,單室消化模型也可分為單室靜態和單室動態模型。多室模型則是指間接或連續模擬多個腔室消化的一種更接近人體生理過程的消化方式。為了能模擬消化過程的連續性,達到與正常生理活動的一致性,人們提出了靜態多室和動態多室消化的方法。動態多室消化的方法更接近人體內的真實環境,如TIM[15]模型。但是此種模型設計復雜、不利于操作,且成本較高,通常是在特殊研究中應用。而靜態多室消化模型,則是借用機械外力代替胃腸道的物理活動,通過人為轉移來模擬消化過程的連續性。

體外模擬消化通常包括口腔、胃和小腸三個階段,偶爾也包括大腸階段[19]。Oomen等[20]建立的Oomen模型是典型的單室模型,在該模型中,依次將唾液、胃液、腸液、膽鹽加入到一個生物發生器中,用于評估土壤污染物的生物可接受率。Vardakou等[11]則通過考慮胃體各腔室生理功能的不同,設計出了DGM單室胃模型。該模型由主體、腔體、閥門三部分組成,共同模擬胃消化,用來預測藥物在胃腔內的釋放行為,也可用于研究攝入不同基質對生物可接受率的影響,裝置示意圖如圖2所示。

圖2 動態單室消化模型:動態胃模型(DGM模型)[10]Fig.2 Dynamic monocompartmental model:Dynamic Gastric Model(DGM模型)[10]

Kong等[12]在Oomen模型和DGM模型的基礎上,通過對胃排空和流速等條件的控制,設計了一個消化模式更精確的HGS模型。這類似于一個人體胃模擬器,裝置圖如圖3所示。HGS模型已經被開發利用,主要用來研究胃中內容物物理和化學性質的變化、食物成分在消化過程中的轉換,以及生理條件對消化的影響。同時,這個裝置也證實了流體動力學和機械因素對食物在體內消化有重要影響。

圖3 HGS模型[12]Fig.3 HGS model[12]注:1-發動機;2-乳膠內層;3-網袋;4-分泌物管道系統;5-滾軸;6-皮帶;7-溫控燈;8-絕緣泡沫塑料。

為了更接近人體正常的消化過程,多室體外消化模型越來越引起了人們的注意,并廣泛應用于食物蛋白消化率和生物可接受率等方面的研究[21]。如,Moreno[22]詳細闡述了多室模型在食物過敏蛋白消化性方面的應用,指出多室模型能提供更多有用的數據,體外消化系統與體內生理條件的一致性對評估過敏蛋白的消化率非常重要。Gianfrani等[23]也利用多室模型研究了不同消化條件對麩質蛋白致敏性的影響。結果發現不同的消化方法產生的結果不同,越接近胃腸道消化的真實過程,消化越徹底,其致敏性越低。Bordoni[24]則利用了多室模型評估肉類產品的消化性,分別模擬了口腔、胃和十二指腸的消化。研究顯示,在胃模擬階段被消化的蛋白少,在十二指腸中則迅速被消化,這與消化液成分密切相關。

單室模型僅模擬了體內某一階段的消化,主要用于食物蛋白在某腔室消化情況的研究。相對于單室模型而言,多室模型更接近人體正常消化過程,且更有利于食物蛋白水解。故多室模型在營養學、微生物學、藥學、毒理學等方面的應用較廣[25-26]。盡管如此,多室模型仍值得研究,目前研究的側重點是建立一種通用的體外消化模型能應用于各種食物蛋白的消化。

3 單酶體系消化模型和多酶體系消化模型

根據食物基質的不同,需選用不同種類的消化酶模擬體內消化,且酶的添加順序也不同,因而消化模型按酶的種類又可分為單酶體系消化模型和多酶體系消化模型。單酶體系消化模型是指僅使用一種酶模擬食物基質在體外的消化情況,這種模型簡單且易操作。在某些情況下,使用單一酶比混合酶更有利,它促進了體外消化模型的標準化,也使各實驗室的研究結果更具有可比性。在預測單一營養物質的消化率時,常利用單酶體系的消化方法,如:利用胃蛋白酶來測定蛋白質的消化率。然而,不同營養物質之間的消化通常會互相影響,隨著研究的需要,逐漸建立了多酶消化模型。多酶體系消化模型是指為了盡可能地模擬體內生理環境,在模擬消化的過程中添加了多種相關的消化酶及一些生物分子。其中最常用的酶和其他生物分子包括胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶、α-淀粉酶、脂肪酶、輔脂酶、膽鹽和黏蛋白等[27-28]。多酶消化模型的消化液成分更精確,模擬更接近真實狀態,是目前應用較多的一種消化模型。

單酶體系消化模型一般在研究單一組分消化時應用較多,有時也可應用于某些特殊研究[29-30]。如Hetty[31]在研究小麥麩質蛋白時,探索了僅使用糜蛋白酶對其消化的影響,進而優化體外消化的條件。又如,Plundrich[32]將花生蛋白結合多酚形成復合物后,用胃蛋白酶模擬胃消化。結果顯示,花生蛋白結合多酚復合物后,花生過敏原蛋白Arah2和Arah3均被快速水解,且結合多酚后的花生蛋白的免疫反應性降低,這一發現為加工改變花生致敏性提供了依據。然而,在模擬食物蛋白體外消化的相關研究中,使用多酶體系進行消化比單一酶更接近實際情況,相對于單酶體系而言,多酶體系消化模型的應用更多[33]。

Abdel-Aal等[34]對比了三種酶一步消化和兩種酶兩步消化的方法,一步法使用了胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶三種酶,兩步法使用的則是胃蛋白酶、胰酶。結果發現,前者水解產物的消化率比后者高,這可能是因為三種酶的協同作用,且該方法與體內的生理條件更相似。由此可見,使用多酶體系的體外消化方法比使用單一酶的方法更有優勢。Prandi等[35]也對消化酶進行了一些研究,比較了兩種不同消化模型對小麥蛋白消化率的影響,一種只使用簡單蛋白酶,另一種則使用復雜的多酶體系進行消化。該研究表明,多酶體系消化模型更有利于模擬小麥蛋白在胃腸道中的消化,消化液成分越精細,越有利于蛋白質水解。

隨著研究的深入,體外模型在模擬體內環境時考慮的因素也越來越多,增強了對酶系成分的研究。如,Picariello等[36]在研究牛奶蛋白消化性質時,利用多酶體系消化模型依次模擬了口腔和胃腸道消化,在模擬腸消化時特別增加了小腸刷狀緣膜(BBM)酶的使用。該實驗研究發現,經過BBM酶消化后,牛奶蛋白的水解度明顯增加,其水解率高達70%～77%。由此建議,為了更準確地測定膳食蛋白的消化性,在腸消化階段應該增加BBM酶的使用。

單酶體系消化模型主要用于對某一種膳食蛋白的研究,消化過程中利用的酶種類單一,消化不徹底。而多酶體系消化模型模擬的人工消化液成分復雜,應用的酶的種類較多,消化過程更接近體內真實狀態?？傮w而言,在研究食物蛋白消化性時,多酶體系消化模型應用前景更廣,值得進一步高度關注。

4 結論

在研究食物蛋白消化時,受體內實驗的局限性,體外消化模型已被廣泛使用。以上消化模型只是按照不同方式進行的分類,相互間有一定的相關性,在應用的過程中一般也會交叉使用。但總體而言,消化液成分越接近體內生理環境,模擬消化的過程越接近體內消化程序,食物蛋白的消化就越徹底。在研究膳食蛋白消化時,應用最廣的將是多酶多室靜態模型。但由于食物蛋白的種類和研究目的不同,各模型在應用時的消化條件略有差異,還需要進行擇優選擇?？傊?體外消化模型為研究食物蛋白質營養功能提供了強有力的工具。

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Progress oninvitromodel for protein digestion

YOU Yi-jiao1,2,3,TONG Ping1,YUAN Juan-li1,3,CHEN Hong-bing1,2,3,GAO Jin-yan1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Theinvitrodigestion model is an important approach to investigate food protein digestioninvivo. It is conveniente and reproducible. However,the efficiencyinvitrodigestion is significantly affected by the sample type and digestion conditions. How to simulate the physiological environment and digestion process more accurately is the key to establish theinvitrodigestion model. This review stated the types ofinvitrodigestion models of food proteins in detail,including static model and dynamic model,monocompartmental model and multicompartmental model,single-enzyme model and multi-enzyme system digestion model. The scope of application and the distinction of the different types ofinvitrodigestion were also illustrated. This review can be a reference for researchers to select appropriate digestion model,and can help to establish standardization forinvitrodigestion models.

invitrodigestion;digestion model;protein digestion

2016-09-01

游義嬌(1990-),女,碩士研究生,研究方向:營養與食品衛生學,E-mail:youyijiaoa@163.com。

*通訊作者:高金燕(1967-),女,碩士,教授,研究方向:食品營養與安全,E-mail:gaojy2013@ncu.edu.cn。

科技部國際合作與交流項目(2013GR0367);國家自然科學基金(31660436);江西省自然科學基金計劃(重點項目)(20133ACB20009);江西省國際合作項目(20111BDH80026);食品科學與技術國家重點實驗室目標導向課題(SKLF-ZZA-201612)。

TS201

A

1002-0306(2017)06-0381-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.064