紅松松塔多酚對S180荷瘤小鼠抗腫瘤及免疫活性

伊娟娟,王振宇,*,周麗萍,王 化,李景彤,曲 航

(1.哈爾濱工業大學化工學院,黑龍江哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學院自然與生態研究所,黑龍江哈爾濱 150040)

紅松松塔多酚對S180荷瘤小鼠抗腫瘤及免疫活性

伊娟娟1,王振宇1,*,周麗萍2,王 化2,李景彤1,曲 航1

(1.哈爾濱工業大學化工學院,黑龍江哈爾濱 150090;2.黑龍江省科學院自然與生態研究所,黑龍江哈爾濱 150040)

目的:研究紅松松塔多酚40%乙醇洗脫物PPP-40對S180荷瘤小鼠體內抗腫瘤及免疫調節作用。方法:首先建立S180 實體瘤模型,連續灌胃PPP-40為10 d。然后,對小鼠抑瘤率、腫瘤細胞周期、脾臟指數及脾淋巴細胞增殖能力進行分析。結果:實驗表明PPP-40中劑量(150 mg/kg)能夠顯著抑制腫瘤細胞生長(抑瘤率:48.29%,p<0.01),促進腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1和G2/M;且能顯著提高小鼠脾臟指數(3.29±0.26,p<0.01)及脾淋巴細胞增殖能力(p<0.01)。結論:這些結果表明PPP-40是一種天然抗腫瘤藥劑,對S180荷瘤小鼠具有顯著的抗腫瘤作用(p<0.01),其抗腫瘤機制和腫瘤細胞周期阻斷及小鼠免疫活性的提高有關。

紅松松塔多酚,S180小鼠模型,抗腫瘤,免疫活性

癌癥已經成為當下人類健康的巨大威脅,據世界衛生組織統計,癌癥的發病率逐年增加,預計到2025年,每年會產生2000萬的新增癌癥病例[1-3]。因此,尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫。多酚化合物因天然存在于多種植物中,資源廣泛,生理功能強大,而深受國內外學者的廣泛關注。流行病學調查顯示,膳食多酚的攝入量與癌癥發病率密切相關[4]。

大量研究證實植物多酚具有很強的抗腫瘤效應,并且對正常細胞不會造成損傷,具有開發應用前景[5-9]。癌癥的發生往往與機體免疫能力下降相關,且腫瘤細胞還分泌一些抑制免疫細胞發揮功能的抑制因子,使免疫細胞處于腫瘤微環境中,不能發揮正常免疫反應。研究表明植物多酚類物質能夠改善 S180 荷瘤鼠的免疫活性,調節小鼠免疫指數直接降低腫瘤活性,達到抑制腫瘤生長的作用[10]。

紅松(Pinuskoraiensis),亦稱果松、海松,在我國主要分布在長白山和小興安嶺一帶。國外關于松科植物多酚化合物研究最多的是法國海岸松松皮萃取物,商品名稱為碧落芷(Pycnogenol),是國際公認優良的營養和功能添加劑。國外還幾乎沒有見到關于紅松松塔活性成分的研究報告。國內關于紅松松塔的研究主要集中于松塔多酚化合物提取工藝的優化[11]、多酚化合物的純化[12]、體外抗氧化[13]、體外抗腫瘤[14]、體外免疫調節[15]及體內抗輻射的研究[16]。關于紅松松塔多酚化合物體內抗腫瘤及免疫調節作用的研究還很少報道,是一個巨大的研究空白區,非常具有研究意義。

因此,本文通過建立S180荷瘤小鼠腫瘤模型,研究紅松松塔多酚提取物對荷瘤小鼠體重、抑瘤率、腫瘤細胞周期、小鼠脾臟指數及脾淋巴細胞增殖能力等指標的影響，旨在為紅松松塔的綜合利用提供科學依據及實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松塔鱗片(PineconesofPinuskoraiensis) 來自伊春林業局,經哈爾濱工業大學化工學院王振宇教授鑒定;雄性健康昆明小鼠 購自哈爾濱黑龍江中醫藥大學,體重 22～25 g,動物生產許可證號碼SYXK(黑)2013-012;S180細胞 購自上海中科院細胞庫,細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中,于37 ℃ 5% CO2條件下培養;RPMI 1640培養基 美國Hyclone公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;MTT Amresco公司;紅細胞裂解液 碧云天生物技術研究所。

CJ-25分析天平 上海精天電子儀器廠;CLASS100 CO2恒溫培養箱 Thermo電子公司;HT-2酶標儀 Biocell公司;XSZ-H光學顯微鏡 南京冀飛科技有限公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅松松塔多酚的提取與純化 選取紅松球果鱗片5 kg,50 ℃烘箱干燥12～24 h,每2 h測一下質量,質量不變，表明到達干燥終點。然后經高速萬能粉碎機粉碎(24000 r/min)15 min 后過30目篩子。按料液比1∶20加60%乙醇(V/V)超聲輔助提取1 h,重復2次,合并濾液,4000 r/min下離心10 min,合并上清液后真空旋轉蒸發儀50 ℃條件下濃縮濾液,定容體積至原體積20%后測定多酚的濃度。

對上述制備的紅松松塔多酚粗提物進行一、二級純化。一級純化采用AB-8大孔樹脂結合響應面法進行純化[12]。二級純化采用D101大孔樹脂結合不同乙醇濃度(20%、40% 及60%)梯度洗脫法進行純化,獲得二級分離物PPP-40,其純度為57.25%,主要組成為兒茶素和花旗松素[14]。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下,將培養狀態良好的S180腫瘤細胞收集并使用生理鹽水最終調整細胞濃度為5.0×106cells/mL,選取健康昆明小鼠無菌環境下快速接種上述S180細胞懸液0.2 mL。飼養7 d后,無菌條件下提取S180荷瘤小鼠的腹水,調整腹水濃度,無菌環境下注射于健康小鼠腹腔內,繼續飼養一周,腹水傳代3～4次后建模。

1.2.3 實驗分組及灌胃方法 將實驗小鼠分為5組,每組12只,分別為空白組、模型組和PPP-40低、中、高劑量處理組。模型組和空白組給予和給藥處理組相同量的生理鹽水,對照組腹腔注射環磷酰胺(20 mg/kg·d),PPP-40低、中、高劑量組灌胃劑量分別為50、150和300 mg/kg·d,連續給藥10 d,于第11 d處死取血及脾臟。

1.2.4 荷瘤鼠脾臟指數的測定 小鼠處死后,取其相應脾臟,生理鹽水沖洗,濾紙除去水后,于分析天平中快速稱得脾臟質量,記錄數據,并按下列公式計算脾臟指數:

式(1)

式中:I-脾臟指數,m-脾臟質量(mg),M-鼠體質量(g)。

1.2.5 PPP-40對S180實體瘤的抑制率 小鼠腫瘤組織瘤體質量稱量后,計算抑瘤率S:

S(%)=(A0-A1)/A0×100

式(2)

式中：S-抑瘤率(%),A0-模型組瘤體質量(g),A1-給藥組瘤體質量(g)。

1.2.6 S180小鼠腫瘤細胞周期及DNA含量分析方法 細胞周期通常為細胞分裂產生新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經歷的過程。主要包括DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)與DNA分裂期(M期)四個階段。正常的細胞都要經歷這四個階段,周期循環是細胞正常生長和分化的必要保證。植物多酚抗腫瘤效應與其對腫瘤細胞周期干擾阻斷有著密切的關系。故本實驗采用流式細胞儀對小鼠腫瘤細胞周期及DNA含量進行考察。具體操作如下:將處死的小鼠快速剝離腫瘤組織后,瘤體立即在低溫無菌環境下進行處理,收集各組腫瘤組織中腫瘤細胞于無菌的比色管中,調整細胞到適宜濃度,70%無水乙醇4 ℃放置24 h后,加入PI避光染色30 min后檢測腫瘤細胞周期分布及DNA含量[17]。

1.2.7 S180小鼠脾淋巴細胞增殖能力測定 將用于脾淋巴細胞增殖實驗的小鼠處死后75%乙醇滅菌,用剪刀在無菌潔凈的環境下小心的取出小鼠的完整脾臟,用冰PBS漂洗去除血液及結締組織后,于滅過菌的200目篩網上剪碎成小塊后研磨,PBS沖洗篩網過濾下的液體于試管中,1000 r/min離心5～10 min加紅細胞裂解液,3～5 min 后,離心沉淀用PBS反復洗滌2次后,去除上清液,加入培養基調整細胞濃度呈脾淋巴細胞懸浮液。將收集到的每份脾淋巴細胞調整到適宜濃度后加入到96孔板中,常規操作鋪板每孔加入95 μL細胞懸液后,向每孔中加入5 μL濃度為150 μg/mL的ConA溶液,使其每孔內終濃度為7.5 μg/mL,培養72 h后,按照MTT后續步驟于570 nm波長下測得吸光度值[18]。

1.3 統計學分析

實驗中測定結果均進行3次重復,實驗結果均以測定且對實驗數據采用統計分析軟件SPSS(Version 18.0)進行ANOVA單因素方差分析,數據以平均值±標準差(X±S)表示,p<0.05有顯著性差異,p<0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 PPP-40對S180小鼠外觀特征的影響

如表1所示,接種S180實體瘤細胞次日,小鼠外觀、飲食及活動均正常;給藥第3 d后,模型組小鼠生長狀態變差,逐漸出現精神萎靡,行動遲緩,毛發雜亂干澀等現象。不同給藥組的不同劑量對荷瘤小鼠外觀特征及飲食行動影響明顯,其中環磷酰胺及PPP-40中劑量組作用效果最突出,對小鼠整體改善效果接近正常組。

表3 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞周期的影響

表1 PPP-40對S180小鼠的外觀特征影響

2.2 PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用

根據瘤重計算PPP-40對其的抑制率如表2所示,結果表明3個劑量的PPP-40對S180實體瘤生長均具有顯著的抑制作用(p<0.05);PPP-40低、中、高處理組對實體瘤的抑制率分別為12.68%、48.29%和32.20%。環磷酰胺對S180實體瘤的抑制率59.02%,低、中、高劑量的PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用顯著低于環磷酰胺組(p<0.01)。以上結果表明,PPP-40對S180 實體瘤生長具有很好的抑制作用,進一步揭示了PPP-40在體內具有顯著的抗腫瘤作用。

表2 PPP-40對S180實體瘤生長的抑制作用

注:*與模型組比較,p<0.05;**與模型組比較,p<0.01;#與陽性對照組比較,p<0.05;##與陽性對照組比較,p<0.01;表3、表4同。

2.3 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞周期分布的影響

由表3可知,模型組腫瘤組織中G0/G1期和S期細胞的比例分別為44.23%和53.79%。與模型組比較,環磷酰胺組S期腫瘤細胞顯著減少(p<0.01),大部分細胞處于G0/G1期(73.21%)。而PPP-40中劑量組顯著的影響了腫瘤細胞在G0/G1期的變化,相繼影響了S期到G2/M期的轉變,使腫瘤細胞更多的從S期轉變到G2/M期,細胞阻滯在G2/M期的比例增多;其細胞在G0/G1期、S期和G2/M期各周期所占的比例分別為56.97%、3.59%和39.44%。

實驗結果證明陽性對照環磷酰胺組能夠顯著誘導S180荷瘤小鼠腫瘤細胞停滯在G0/G1期,從而抑制腫瘤細胞DNA復制、轉錄和蛋白質的合成,促進腫瘤細胞的凋亡。PPP-40高、低劑量組與模型組相比,各周期的細胞數量差異不顯著,而PPP-40中劑量組與模型組相比,使S期的細胞更多的進入到G2/M期,阻滯在G2期。研究表明,芒果苷可以時間和劑量依賴地抑制人骨髓性白血病細胞的增長,明顯改變蛋白激酶和細胞周期相關因子表達水平,是通過ATR-Chk1通路使腫瘤細胞停滯在G2/M期發揮抗白血病作用[19]。也有文獻報道肉桂的水提多酚混合物具有抗腫瘤活性,它們也是通過阻斷腫瘤細胞G2-M期而發揮抗腫瘤作用的[20]。

2.4 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞DNA含量的影響

用流式細胞儀檢測技術對細胞內DNA含量進行檢測,結果如圖1所示。

圖1 PPP-40對S180小鼠腫瘤細胞DNA含量的影響Fig.1 Effect of PPP-40 on contents of tumor cells DNA in S180 mice注:PPP-40-H,PPP-40-M,PPP-40-L分別表示PPP-40高、中、低劑量組;注:##與模型組比較,p<0.01。

灌胃低、中、高劑量PPP-40的荷瘤鼠腫瘤組織DNA含量百分比分別為18.24%、33.97%、20.56%,而陽性對照組腫瘤組織DNA含量為36.50%。表明松多酚二級分離物PPP-40各劑量組均不同程度的對腫瘤細胞起到一定的凋亡促進作用。

2.5 PPP-40對S180小鼠脾臟指數的影響

由表4可知,與正常組相比,模型組小鼠的脾臟指數顯著降低(p<0.01),這表明腫瘤的發生導致脾臟細胞的損傷或凋亡。與模型組相比,PPP-40各劑量處理組對小鼠的脾臟指數均有顯著升高(p<0.01)。其中,中劑量處理組的改善效果優于低、高劑量處理組。而陽性對照環磷酰胺組與模型組相比沒有顯著差異(p<0.05),其脾臟指數低于模型組,表明環磷酰胺沒有起到免疫修復作用,相反起到免疫抑制效果。

表4 PPP-40對S180小鼠脾臟指數的影響

2.6 PPP-40對S180小鼠脾淋巴細胞增殖的調節

由圖2可以看出,與正常組相比,模型小鼠的脾淋巴細胞增殖能力受到明顯的抑制(p<0.01);與模型組相比,PPP-40中劑量處理組促進脾淋巴細胞增殖作用極其顯著(p<0.01),優于其它兩個劑量處理組。而陽性對照組環磷酰胺對脾淋巴細胞增殖與模型組相比沒有顯著差異,表明陽性對照組對荷瘤小鼠脾臟沒有修復作用,這與文獻報道的環磷酰胺免疫抑制功能相同。這種現象也說明了陽性對照試劑環磷酰胺對腫瘤的抑制途徑不是通過免疫調節通路。

圖2 PPP-40對S180小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.2 Effect of PPP-40 on proliferation of splenocytes in S180 mice注:*與正常組比較,p<0.05;**與正常組比較,p<0.01;#與模型組比較,p<0.05;##與模型組比較,##p<0.01。

3 討論與結論

本文在紅松松塔多酚PPP-40體外抗腫瘤研究的基礎上,通過在體內建立S180荷瘤小鼠腫瘤模型,對PPP-40體內抗腫瘤活性及免疫調節活性進行系統研究。通過對S180小鼠體內抑瘤率及腫瘤細胞周期、腫瘤細胞DNA含量、脾臟指數以及脾淋巴細胞增殖等指標綜合分析,結果看出:PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組的抑瘤效果最明顯,抑瘤率為48.29%;且腫瘤細胞周期檢測也發現 PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組將腫瘤細胞更多地阻滯在G0/G1期及G2/M期,表明松塔多酚PPP-40體內抗腫瘤作用可能是通過抑制腫瘤細胞DNA復制、調節細胞周期阻滯來實現的。

腫瘤的發生與轉移與機體免疫系統功能抑制有著直接關系,如腫瘤微環境的影響使機體不能對腫瘤細胞產生正常的免疫應答而引起腫瘤的發展和惡化。脾臟是機體最大的外周免疫器官,是衡量機體免疫功能的重要指標。脾淋巴細胞分化的T、B淋巴細胞與機體的細胞免疫及體液免疫關系非常密切[21]。在本研究中PPP-40中劑量(150 mg/kg·d)處理組能夠顯著提高S180荷瘤小鼠的脾臟指數、脾淋巴細胞增殖能力,從而有效提高S180 荷瘤小鼠的免疫功能。這個結果與左麗麗等人的研究結果相一致[22]。

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Antitumor and immunomodulation activities of polyphenols from pinecone ofPinuskoraiensisin cancer-bearing S180 mice

YI Juan-juan1,WANG Zhen-yu1,*,ZHOU Li-ping2,WANG Hua2,LI Jing-tong1,QU Hang1

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China;2.Institution of Natural Resources and Ecology of Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China)

Objective:The aim of this study was to investigate the antitumor and immunoregulatory activities of the 40% ethanol eluent of polyphenols from pinecone ofPinuskoraiensis(PPP-40)on S180 mice. Methods:Firstly,S180 solid tumor-bearing mice were given PPP-40 by oral for 10 days. Then,the tumor inhibition rate,cell cycle of tumor cells,spleen index and spleen lymphocytes proliferation ability were analyzed. Results:Pretreatment with PPP-40(150 mg/kg)could significantly inhibit of tumor growth(Inhibition rate:48.29%,p<0.01),promote tumor cells cycle arrest at G0/G1and G2/M,enhance spleen index(3.29±0.26,p<0.01)and accelerated the proliferation of splenocytes(p<0.01). Conclusion:These results suggested that PPP-40 was a natural antitumor agent and possesses strong antitumor effect in S180 mice(p<0.01). The antitumor effect may be related to the arrest of tumor cell cycle and the improvement of immunomodulatory activity.

polyphenols ofPinuskoraiensispinecone;S180 solid tumor;antitumor activity;immunomodulation activity

2016-08-29

伊娟娟(1988-),女,在讀博士,研究方向:天然產物提取與功能分析,E-mail:yijuanjuanmsn@126.com。

*通訊作者:王振宇(1957-),男,教授,主要從事活性成分的分離合成調控,新資源開發與利用方面的研究,E-mail:wangzhenyu13001@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0345-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.057