食源性糖蛋白糖鏈結構的研究進展

趙文竹,張宏玲,陳月皎,于志鵬,*,馬 勇,劉靜波,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養與功能食品研究室,吉林長春 130062)

食源性糖蛋白糖鏈結構的研究進展

趙文竹1,張宏玲1,陳月皎1,于志鵬1,*,馬 勇1,劉靜波2,勵建榮1,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養與功能食品研究室,吉林長春 130062)

糖蛋白作為一種結合蛋白質,是由寡糖鏈與蛋白質共價相連構成的分子,具有多種生物活性。糖鏈作為糖蛋白的組成部分,發揮重要生理活性,影響糖蛋白的構象并且參與糖蛋白生理功能。文章綜述了糖蛋白的生物活性和糖鏈結構,同時對糖蛋白生物活性與糖鏈結構的相關性研究進行了分析,旨在為后續深入的研究和應用提供參考。

糖蛋白,生物活性,糖鏈結構

糖蛋白是體內重要的生物大分子,往往是由分支的寡糖鏈與多肽鏈共價相連所構成的復合糖,廣泛存在于植物、動物和微生物中[1]。糖蛋白是蛋白質經糖基化修飾的產物,糖基化是常見的蛋白質翻譯后修飾,對蛋白質的折疊[2]、蛋白質的穩定性[3]、蛋白質的分子識別[4]和蛋白質的免疫原性[5]等都有重要影響,且與蛋白質的生理功能有關[6]。糖蛋白具有增強免疫力[7]、防衰老[7]、抑制腫瘤[8-9]、抗氧化[10]等生理功能。越來越多的研究表明,糖蛋白的許多生理功能是在糖鏈的共同參與下完成的,甚至糖鏈的作用更直接、更突出[11]。糖鏈與細胞識別、免疫應答、細胞分化、接觸抑制等有關,糖鏈也是生物體內的重要生理活性物質,并且影響糖蛋白的構象甚至決定其功能[12],如糖脂糖鏈對血型、大腦及神經組織的生命活動有決定作用[13]。隨著技術的發展,糖蛋白的生物活性已經成為國內外研究的熱點,在很多領域已有了深入的研究,糖鏈結構與糖蛋白的生理活性有著密不可分的關系。然而,針對兩者相關性的研究報道較少[14]。本文對目前已研究的糖蛋白的糖鏈結構及生物活性進行闡述,并對兩者的相關性進行分析,旨在把生物活性與糖鏈結構的相關性結合起來,為之后建立以活性跟蹤法為手段篩選特定功能糖蛋白的純化策略提供參考。

1 食源性糖蛋白的糖鏈結構分析

1.1 糖鏈結構分析方法

糖鏈與肽鏈之間主要有O-連接和N-連接兩種連接方式,糖蛋白糖鏈的結構分析包括以下幾個步驟:糖鏈的釋放、糖鏈的分離純化和糖鏈結構測定等。

1.1.1 糖鏈的釋放

1.1.1.1 化學法 化學法主要有β-消除法和肼解法。

肼解法可應用于N-糖鏈和O-糖鏈的釋放,傳統的β-消除法一般只釋放O-糖鏈,但并不是所有的O-糖鏈均能發生β-消除反應[18]。無水肼解通過酰胺鍵的水解,使與蛋白相連的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰化[15]。化學法常用于對O-糖鏈的釋放,糖蛋白在堿性條件下可引起β-消除反應釋放糖鏈,加入硼氫化鈉改善糖鏈還原端醛基的遇堿不穩定性,加入二甲胺能有效釋放O-糖鏈[16]。Huang[17]等開發了一種NH3·H2O依賴型β-消除法,釋放糖蛋白上帶有還原末端的O-糖鏈,能夠進行紫外或熒光衍生標記。該法改良了對N-糖鏈的釋放,完成了在對還原末端的O-糖鏈釋放的同時,也對N-糖鏈的釋放起到了一定作用,是一項很有發展的糖鏈釋放技術。

1.1.1.2 酶法 酶法操作簡單,條件溫和,是N-糖鏈釋放的常用方法。對大多數N-糖鏈能進行有效釋放,但對于經α,l-3巖藻糖修飾的N-糖鏈除外[19]。常用的特異酶有N-糖肽酶F(PNGase F)和N-糖肽酶A(PNGase A),由于二者結合有很好的互補性,因此常聯合使用。用PNGase F酶能水解天冬酰胺殘基側鏈與糖基之間的酰胺鍵,得到完成的糖鏈。內切糖苷酶如 Endo F1、Endo F2和Endo F3沒有廣泛的切割活性,專一地切割特定類型的 N-糖鏈[15]。Endo-H只能用于高甘露糖型與雜合型的糖鏈,可用于研究蛋白質糖基化位點[15],還可用于酶解人血清,是檢測卵巢癌和結腸癌的主要生物標志物[20]。

1.1.2 糖鏈的分離純化 將糖鏈組分進行純化得到單一純品,只有對單一純品進行的結構分析才準確、有意義。糖鏈分離純化的方法有層析法和電泳法。

1.1.2.1 層析法 凝膠柱層析法是分離純化的常規方法,可對分子量不同的糖鏈進行分離,復雜樣品通常采用凝膠層析法實現分離,交換介質有葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠、聚丙烯酰胺葡聚糖等。由于α-1,6葡萄糖聚合物脫落會污染樣品,現在大多采用聚丙烯酰胺凝膠等[21]。

高效液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)靈敏度高、更快速。目前,會將幾種高效液相組合成多維HPLC,如2D-HPLC或3D-HPLC[22],高維的分離速度更快,且分離后的峰選擇性好,能提供更多信息。3D-HPLC主要用于藥物的研究[23],2D-HPLC分離外切糖苷酶消化 pyridylaminate 后的糖鏈與特定組織病變有關[24]。

凝集素親和柱層法能專一地結合糖鏈,它們的結合是非共價且可逆的,一次可以固定到不同層析材料上分離糖鏈混合物,凝集素親和柱層析適用于那些帶電性質相似,分子大小相近的糖鏈。

1.1.2.2 電泳法 熒光標記糖電泳應用廣泛,帶電熒光物標記后的糖鏈,進入高濃度的聚丙烯酰氨凝膠,在電場作用下,由于分子大小不同產生不同遷移率使糖鏈分離[25]。而毛細管電泳可用于不帶電的天然糖,首先要通過絡合帶電、強堿電離和衍生帶電等方法使糖帶電[15]。

1.1.3 糖鏈的結構測定 糖鏈的結構測定需要確定分子量、單糖組成、糖鏈類型、糖苷鍵的構型等。測定方法有生物質譜、核磁共振法、芯片技術、生物信息學法、氣相色譜法、紅外光譜法和甲基化反應-氣相色譜法等。

電噴霧質譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)不用衍生化即可用于糖鏈序列、連接方式和糖基化位點分析。基質輔助激光解吸飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)對干擾物忍受性好,碎片離子產生較少,圖譜中沒有多電荷特性,容易解析,是糖鏈結構解析中常用的工具。以血清糖蛋白為例的基質輔助激光解吸飛行時間質譜如圖1所示,23種不同的N-連接糖鏈被表示,且圖譜中以鈉離子為主。由于豐富中性寡糖的抑制,有注釋的N-連接糖鏈沒有酸性寡糖。在血清糖蛋白中,被注釋為(Fuc)1(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2,(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2,(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2,(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2和(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2的N-連接糖鏈在m/z1485.533、1647.897、1663.581、1809.639和1850.665是主要的多糖[26]。快原子轟擊質譜使用氬或氙等照射液態基質中的樣品分子,只能產生單電荷離子,有一定局限性。

圖1 血清糖蛋白N-連接糖鏈的富集的一種基質輔助激光解吸飛行時間質譜[26]Fig.1 One MALDI-TOF-MS spectra of the enriched total N-linked glycans from rhe serum glycoproteins[26]

核磁共振法是糖鏈結構研究的重要方法,能提供最完整的結構信息。將一維和二維核磁共振圖譜綜合起來分析,能得到更準確的糖結構信息。

糖芯片技術是結構不同的糖分子結合在經化學修飾的基質上檢測的技術,在糖鏈結合蛋白分析、疫苗開發及與免疫識別癌癥抗原有關糖鏈等方面已有應用[27]。凝集素芯片是將凝集素固定在芯片上高通量分析糖基化差異的技術。目前,將液相懸浮芯片應用在凝集素芯片,提高了凝集素與糖鏈的結合力,獲得更靈敏的凝集素芯片[28]。

生物信息學主要通過信息處理、歸納分析以及糖鏈結構檢索等對糖蛋白糖鏈來進行研究。KEGG、CFG、Glycosciences.de、GLYCAN、CCRC和 CCSD等是目前常用的資源。這些資源提高了糖鏈的研究效率,比如CFG可以用于查找糖鏈亞結構、分子量和組成等參數,CCSD收集的有關糖鏈結構的數據為糖譜的構建和糖鏈結構的查找提供了很好的保障。

1.2 食源性糖蛋白的糖鏈結構

糖鏈對糖蛋白的功能起著重要作用,糖蛋白結構的糖鏈結構信息[29]包括糖鏈的單糖組成、異頭碳構型、環狀結構的類型、碳水化合物組成和比例、糖苷鍵的連接位置、分子量測定、羥基被取代情況等內容。蔡自建[30]經氣相色譜分析發現甘薯糖蛋白糖鏈SPG-1-P單糖組成為葡萄糖,通過紅外光譜檢測SPG-1-P是以α-糖苷鍵連接的吡喃型糖環,最后經甲基化和紅外光譜確定SPG-1-P是一種以α-1,6連接的葡聚糖,梁婧婧[31]等通過紅外光譜和核磁共振分析糖鏈也得到了相近的結果。王芳[32]利用紅外光譜分析覆盆子糖蛋白純化組分,發現糖蛋白RGP-2糖鏈有幾處較弱的吸收,證明α、β-糖苷鍵的存在且含有α-D-葡萄糖和β-D-半乳吡喃糖,并存在吡喃環;RGP-3-a糖蛋白糖鏈和RGP-4糖蛋白糖鏈均有特征峰說明兩種糖蛋白糖鏈均以β-糖苷鍵連接,且含有吡喃環,證明RGP-3-a糖蛋白糖鏈含有甘露糖。張艷[33]研究發現燕麥糖蛋白含的糖苷鍵為吡喃型,含有阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖和木糖,葡萄糖含量最多。李婷婷[34]等通過紅外光譜分析,發現長林油茶籽粕糖蛋白的糖鏈以α-糖苷鍵連接,為吡喃環糖型。吳紅棉[35]等通過HPLC對菲律賓蛤仔糖蛋白糖鏈單糖組分進行分析,發現其糖鏈由葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖和阿拉伯糖組成。

進行糖鏈結構分析時常用的方法有氣相色譜分析、紅外光譜分析、甲基化反應-氣相色譜法、HPLC法。氣相色譜法可以測定得出單糖組成,紅外光譜法可以測定得出環狀結構的類型、異頭異構體、糖苷鍵類型,甲基化反應-氣相色譜法可以測定得出羥基被取代情況,HPLC法可以測定得出單糖組成。目前,食源性糖蛋白糖鏈的結構信息尚不完整,測定方法也有待完善,食源性糖蛋白糖鏈的研究也將會是今后國內外研究的焦點。

2 食源性糖蛋白的生物活性

2.1 抗氧化活性

2.2 抗腫瘤活性

2.3 免疫活性

免疫系統對保持生命體內的環境的穩定和結構的完整有重要作用,研究發現糖蛋白能增強機體免疫力。Picariello等[51]研究發現由于母乳中含有包括糖蛋白的可以阻止病原體粘附在機體細胞的糖復合物,從而預防新生兒不被細菌等感染。Mesaik[52]等研究發現,蜂蜜糖蛋白對中性粒細胞(IC50=6～14 ng/mL)和巨噬細胞(IC50=2～9 ng/mL)的活性氧產量、吞噬作用、一氧化碳產量均有抑制作用,在800 ng/mL顯著抑制吞噬作用,對TNF-α產物有顯著抑制,蜂蜜糖蛋白對固有免疫系統的分子有干擾。Shen等[53]發現從納豆中提取的糖蛋白NPPC-1-b和NPPC-2-a分別在100～200 μg/mL和12.5～200 μg/mL濃度時顯著增強脾細胞增值能力,說明納豆中提取的糖蛋白有顯著的免疫活性。闞建全等[54]對甘薯糖蛋白進行熱加工,發現當溫度小于70 ℃、pH在3.5～7.5、紫外線照射下甘薯糖蛋白的免疫調節功能較穩定。通過對活性氧產量、吞噬作用、一氧化碳產量和淋巴細胞轉化進行測定,發現食源性糖蛋白具有免疫活性,但免疫活性在一定條件下會受到限制,在加工中應避免70 ℃以上的溫度,盡量在酸堿度適中的條件進行加工有利于糖蛋白免疫活性的穩態化保護。但不同來源的糖蛋白或同一來源但組成成分不同的糖蛋白表現的免疫活性并不相同,糖蛋白的免疫活性與其糖鏈結構存在密切關系,其構效關系將成為未來研究的焦點。

3 食源性糖蛋白糖鏈結構與生物活性

糖蛋白的許多生理功能是在糖鏈的共同參與下完成的,糖蛋白中糖鏈具有穩定蛋白質的構象、保護肽鏈不被酶解以及識別作用。王岸娜[55]等對獼猴桃的O-糖鏈進行釋放,并通過傅里葉變換紅外光譜法測定切除前后蛋白質的 O-糖鏈二級結構的變化,發現釋放后的O-糖鏈獼猴桃糖蛋白的ABTS+自由基清除能力顯著增強;β-折疊結構的含量與OH自由基、DPPH 自由基的清除能力呈正相關。程顯好[56]等用紙層析和氣相色譜分析出蟲草菌菌絲體糖蛋白(PCAI)的單糖組成是甘露糖和半乳糖,經紅外光譜和核磁共振分析其主要連接方式是1→4連接的吡喃甘露糖,并發現PCAI能夠提高巨噬細胞的吞噬能力,增重免疫器官的脾臟,說明PCAI具有免疫活性。Kato[57]等發現在卵黏蛋白中最少有三種碳水化合物側鏈,一條由半乳糖、半乳糖胺、唾液酸和硫酸鹽按1∶1∶1∶1組合;一條由半乳糖和半乳糖胺按照1∶1混合;一條由甘露糖和葡糖胺按照1∶1混合;Omana[58]等發現卵黏蛋白有抗病毒、抗菌、抗癌等活性。Xia[59]等對血清溶菌酶活性和T細胞免疫應答進行分析,發現在毒性實驗中甘薯糖蛋白免疫活性增強,可能是甘薯糖蛋白的碳水化合物含量多于蛋白質含量;糖蛋白在胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后免疫活性輕微減弱,可能是由于硫酸鹽化作用的高度改性,硫酸鹽化作用是對碳水化合物進行功能性生物改性,能改變生物識別或者將糖蛋白中的蛋白快速排泄。目前由于糖鏈結構的復雜性,對于糖鏈結構尚不能得到較為完整的結構,把生物活性與糖鏈結構結合起來并以活性跟蹤法為手段探索糖鏈結構與功能活性將成為未來的研究熱點。

4 展望

糖蛋白糖鏈結構復雜多樣,不僅表現為糖鏈序列的多樣,還在于其合成沒有模板可循,很難分離得到結構完全一致的生物糖鏈,使得其結構的測定較為困難,糖蛋白的研究在一定程度上因此受到限制。目前,對于食源性糖蛋白的生物活性的研究較廣泛,但對其糖鏈的研究較少,糖鏈結構的測定還不夠完善,把生物活性與糖鏈結構相關性結合起來共同研究的更是微乎其微。在未來糖蛋白的研究方向可以從幾方面進行:一是結合生物質譜、核磁共振、芯片技術和生物信息學等技術測定糖鏈結構,逐漸完善糖鏈結構的測定方法;二是將具有多種生物活性的食源性糖蛋白應用于產品開發,如利用糖蛋白的抗氧化活性應用到化妝品新產品開發,利用糖蛋白的免疫活性開發提高免疫力的功能性食品,同時可為未來拓寬功能食品的功能聲稱種類提供理論參考;三是把生物活性與糖鏈結構的相關性結合起來,為建立以活性跟蹤法為手段,篩選特定功能糖蛋白的純化策略,為糖蛋白的純化、結構鑒定及活性研究提供重要參考。

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Progress on glycanstructure of glycoprotein

ZHAO Wen-zhu1,ZHANG Hong-ling1,CHEN Yue-jiao1,YU Zhi-peng1,*,MA Yong1,LIU Jing-bo2,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Glycoprotein is a kind of binding protein,which consists of relatively small number of monosaccharide units and protein linked through a variety of covalent forms. Glycoprotein possesses plenty of biological activities. Glycan chain as a component of glycoprotein plays an important physiological activity,influencing glycoprotein’s conformation and takeing part in physiological functions of glycoprotein. The review focused on the biological activities and glycanstructure of glycoprotein. In addtion,the activities and glycanstructure relationship of glycoprotein was addressed,aimed to provide a reference for subsequent in depth study and application.

glycoprotein;bioactivity;glycanstructure

2016-09-22

趙文竹(1986-)，女，博士，講師，研究方向：植物活性成分，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。

*通訊作者:于志鵬(1984-)，男，博士，講師，研究方向：蛋白質及活性肽，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。 勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

國家自然科學基金項目(31601479)；渤海大學博士啟動項目(0515bs020)。

TS201

A

1002-0306(2017)06-0370-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.062