龍葵果自然發酵過程中活性物質含量及體外抗氧化能力研究

李 祎,王 萍

(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

龍葵果自然發酵過程中活性物質含量及體外抗氧化能力研究

李 祎,王 萍*

(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

以龍葵果為原料,探討龍葵果在分別添加紅糖、蜂蜜以及綿白糖的條件下進行自然發酵,分析活性物質含量和體外抗氧化能力在發酵過程中的變化。實驗結果表明,發酵60 d后三組龍葵果發酵物中總多酚、總黃酮、皂苷和原花青素含量顯著升高(p<0.05),花色苷含量顯著下降(p<0.05)。發酵60 d后紅糖、蜂蜜及綿白糖三組的DPPH·清除能力分別提高14.68%、12.63%和10.26%(p<0.05);還原力分別提高81.9%、29.1%和34.2%(p<0.05)。相關性分析表明,還原力與總多酚含量具有極顯著的正相關性(p<0.01),DPPH·清除率與總黃酮含量之間具有極顯著的相關性(p<0.01)。發酵后蛋白酶和淀粉酶活力顯著提高(p<0.05),多酚氧化酶活力顯著降低(p<0.05)。經過綜合比較三組龍葵果發酵物的生物活性物質含量、抗氧化能力和三種酶活力,得出添加紅糖發酵得到的龍葵果發酵物功能性更顯著。

龍葵果,自然發酵,體外抗氧化活性

龍葵(SolanumnigrumL.)為茄科(Solanaceas)茄屬(Solanum)的一年生草本植物,又名黑星星、黑天天等[1]。近年來大量研究證明,龍葵果含有多糖、礦物質、維生素、色素、氨基酸等功能性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、消炎抑菌、提高人體免疫力等功效[2]。

果蔬原料經過多種益生菌的發酵,不僅保存了果蔬原料中原有的營養物質,而且產生了新的生物活性物質和酶類,抗氧化能力有所提高[3-4]。經自然發酵的發酵飲品含有豐富的維生素、酶、礦物質和次生代謝產物等營養成分[5]。現已有文獻報道,自然發酵過程中的微生物主要以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等益生菌為主[6-7],植物原料經益生菌發酵后發酵體系中的總多酚和有機酸等活性物質含量有所增加[4]。張惠香[8]等研究發現諾麗果自然發酵產物具有較強的抗氧化、抗菌和增強機體免疫力的功效。隨著食品工業的發展,消費者越來越重視食品的功能性,期望可以通過食物來改善健康和預防疾病[9]。有研究表明,黃酮類物質含量與清除自由基能力顯著相關[10],并且有文獻報道[11],多酚類物質經微生物發酵后更易被人體利用,有益于人體健康。然而對食品發酵過程中的活性物質變化規律的研究相對較少,本研究的目的是研究活性物質在自然發酵過程中的變化,并比較其與抗氧化能力之間的相關性。

本實驗以成熟龍葵果為原料,測定其自然發酵過程中總多酚、總黃酮、花色苷、原花青素、皂苷等活性物質的含量及龍葵果發酵物的抗氧化能力變化,通過相關性分析研究各指標對抗氧化活性的貢獻,探討龍葵果發酵物在自然發酵前后的變化規律,為龍葵果資源的進一步開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍葵果 2015年9月下旬采于哈爾濱市郊;紅糖、綿白糖、蜂蜜 市售,均為食品級;DPPH Sigma公司;其他試劑 均為分析純。

單人無菌操作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;HR600型榨汁機 飛利浦電子香港有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海精密儀器有限公司;TU-1810型PC 722s分光光度計 上海精密實驗儀器有限公司;TDL-5臺式離心機 上海科興儀器有限公司;DK-S12電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍葵果自然發酵物的制備 將成熟的新鮮龍葵果去梗,并用無菌水輕輕沖洗掉表面的塵土及雜質,在無菌條件下晾干表面水分。選用市面常見紅糖、蜂蜜和綿白糖為碳源,使用前紫外殺菌30 min。在無菌條件下向已滅菌的玻璃瓶中,按質量比1∶1∶3的比例加入已破碎的龍葵果、碳源和無菌飲用水。將玻璃瓶封口,25 ℃恒溫避光發酵60 d。每組做3份平行實驗。在發酵過程中,每隔5 d在無菌條件下從各個實驗組中取樣,將樣品于10000 r/min離心5 min,取上清液備用。

1.2.2 龍葵果發酵物活性物質測定

1.2.2.1 總多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法[12]。100 μL適當稀釋后的樣品加入試管中,加水7 mL,搖勻,再加0.5 mL福林試劑,1 min之后,加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液,混勻后加入0.9 mL蒸餾水。于25 ℃水浴條件下避光反應1 h。在765 nm波長下測定吸光值,結果用沒食子酸當量表示。每份樣品平行測定3次取平均值。

1.2.2.2 總黃酮含量的測定 根據文獻[13]的方法測定,略有改動。0.5 mL的樣品加入30%的乙醇至5 mL,加入0.3 mL 5% NaNO2,搖勻。6 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁,搖勻靜置6 min后加入1.0 mol/L的氫氧化鈉4 mL,反應15 min后于510 nm波長下測定吸光值,結果用蘆丁當量值表示。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.2.2.3 花色苷含量的測定 采用pH示差法[14]。分別移取1 mL樣品于試管中,用pH1.0、4.5的緩沖溶液定容到10 mL,置于暗處反應達平衡后(pH1.0為50 min,pH4.5為80 min)分別在510、700 nm波長下測定吸光值,根據公式(1)計算花色苷含量。每組樣品平行測定3次取平均值。

式(1)

其中,A-吸光度,A=(A510 nmpH1.0-A700 nmpH1.0)-(A510 nmpH4.5-A700 nmpH4.5);ε-矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數,26900;DF-稀釋因子;M-矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量,449.2。

1.2.2.4 原花青素含量的測定 根據文獻[15]的方法測定。移取0.5 mL樣品于試管中,依次加入2.5 mL 4%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30%濃硫酸-甲醇溶液,搖勻,于30 ℃水浴條件下避光反應20 min。用甲醇代替樣品作為空白對照,在500 nm波長下測定反應體系的吸光值,結果用兒茶酚當量值表示。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.2.2.5 皂苷含量的測定 采用香草醛-冰醋酸法[16],略做改動。取一定量樣品于10 mL具塞試管中,70 ℃水浴揮干溶劑,加入0.2 mL新配制的5%(w/v)香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸,搖勻,60 ℃水浴25 min,取出置于冷水浴中終止反應15 min,加入5 mL冰乙酸,混勻,放置10 min,以不加樣品的溶液做空白對照,在465 nm波長測定各樣品吸光度。以薯蕷皂苷元作為標品,制作皂苷的標準曲線。每組樣品重復3次測定取平均值。

1.2.3 龍葵果發酵物體外抗氧化能力的測定

1.2.3.1 還原力測定 采用鐵氰化鉀法[17],略作改動。依次加入50 μL樣品、2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀,搖勻后置于50 ℃水浴20 min。加入2.5 mL 10%三氯乙酸,搖勻,靜置5 min。4000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。30 min后,于700 nm波長下測定吸光值。每組樣品平行測定3次取平均值。結果以吸光值表示,吸光值越高,則表示還原力越強。

1.2.3.2 DPPH·清除率測定 DPPH·清除率的測定根據參考文獻[14]的方法測定。移取50 μL樣品加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液4 mL,避光反應30 min,以去離子水為參比,在517 nm波長下測定吸光值;對照組用4 mL無水乙醇代替0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液,空白組用50 μL無水乙醇代替樣品,測定吸光值,根據公式(2)計算清除率。每組樣品平行測定3次取平均值。

式(2)

其中,A1-樣品組吸光值；A2-對照組吸光值；A3-空白組吸光值。

1.2.4 龍葵果發酵物中酶活力測定

1.2.4.1 蛋白酶活力測定 根據文獻[18]的方法測定蛋白酶活力。取0.5 mL待測樣品于試管中,加入2 mL 2%的干酪素,于37 ℃準確水浴10 min后迅速加入5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸,搖勻后靜置20 min,3000 r/min離心10 min。取1 mL濾液加入5 mL 0.55 mmol/L的碳酸鈉溶液,加入1 mL福林酚試劑(稀釋10倍)。30 min后測定OD660。定義每毫升酶液作用于底物,每分鐘增加1 μg酪氨酸為一個酶活單位(IU)。

1.2.4.2 淀粉酶活力測定 根據文獻[18]的方法測定淀粉酶活力。取1 mL溶于0.4 mol/L pH4.8醋酸緩沖液的可溶性淀粉于試管中,加入1 mL待測樣品,于37 ℃水浴10 min后,加熱滅活。適當稀釋后,取2 mL稀釋后樣品加入DNS顯色液1.5 mL,混勻后進行沸水浴5 min,取出后迅速冷卻至室溫。用蒸餾水定容到25 mL,搖勻。在520 nm波長下測定吸光值。以滅活酶液作為空白,計算葡萄糖增加量。定義每毫升酶液作用于底物,每分鐘水解釋放1 μg葡萄糖為1個酶活單位(IU)。

1.2.4.3 多酚氧化酶活力測定 取0.5 mL pH7.0的磷酸鹽緩沖液,加入2 mL 0.02 mol/L鄰苯二酚,于37 ℃水浴10 min,加入0.5 mL待測液,于37 ℃水浴處理5 min后,迅速在420 nm波長下測定OD值,每組平行測定3次。將每毫升酶液反應后每分鐘吸光值變化(ΔA420)0.001定義為1個酶活單位(IU)。

2 結果與分析

2.1 龍葵果發酵物活性物質含量變化

2.1.1 龍葵果發酵過程中總多酚含量的變化 由圖1可知,三組龍葵果發酵物經自然發酵60 d后,與發酵前相比總多酚含量均顯著增加(p<0.01)。實驗前測定了三種碳源的總多酚含量,使用的紅糖中總多酚含量為(0.317±0.01) mg/g,而蜂蜜與綿白糖中總多酚含量未測出。由于紅糖相對于蜂蜜與白糖來說,酚類物質含量更多,并且其中含有的微量元素和其他營養物質更符合微生物生長代謝的需要[19]。因此,發酵開始0 d時紅糖組的總多酚含量顯著高于蜂蜜組及綿白糖組。紅糖組在發酵35～45 d總多酚含量呈緩慢上升趨勢,在45 d總多酚含量最高達到(2.48±0.03) mg/mL,是發酵初始總多酚含量的2.8倍,50～60 d總多酚含量有所下降,但含量下降差異不顯著(p>0.05)。不考慮紅糖本身帶入的酚類物質,只比較在發酵過程中總多酚的增加量,發現紅糖組發酵前后總多酚含量增加(1.28±0.07) mg/mL,顯著高于(p<0.05)蜂蜜組總多酚含量增加量(0.85±0.03) mg/mL和綿白糖組增加量(0.64±0.06) mg/mL。現已有文獻報道,自然發酵過程中主要以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等益生菌的代謝為主[6-7],Hur等[3]總結發現當乳酸菌控制發酵時,可將分子量較高的酚類化合物降解成簡單的酚類。Filannino[11]等的研究證明了在微生物發酵過程中復雜的大分子酚類物質經乳酸菌代謝生成各種小分子酚類,如綠原酸會分解成咖啡酸和奎寧酸,使體系中總多酚含量增加。這是自然發酵前后各組總多酚含量增加的主要原因。

圖1 發酵過程中總多酚含量變化Fig.1 Changes in the contents of total polyphenols during fermentation

2.1.2 龍葵果發酵過程中總黃酮含量的變化 如圖2所示,龍葵果發酵物在發酵過程中總黃酮的含量略有升高,三組總黃酮含量的增加量均在0.2～0.3 mg/mL,與發酵0 d時總黃酮含量相比差異顯著(p<0.05)。發酵0 d時,紅糖組總黃酮含量最高,可能是由于加入的紅糖中含有少量的黃酮類物質導致的。實驗前測定了三種碳源的總黃酮含量,使用的紅糖中總黃酮含量為(1.12±0.05)μg/g,蜂蜜中總黃酮含量為(0.38±0.04)μg/g,綿白糖中總黃酮未測出,三種碳源對發酵0 d的樣品總黃酮含量均無顯著影響(p>0.05),故不考慮碳源所帶入的總黃酮含量。

紅糖組總黃酮含量最高,且在發酵35 d時達到最高水平(1.57±0.04) mg/mL,顯著高于發酵0 d的總黃酮含量,35 d之后總黃酮含量變化無顯著差異(p>0.05);綿白糖組次之,在發酵35 d時含量最高為(1.25±0.02) mg/mL;蜂蜜組含量最低,在45 d時含量達到最高為(0.81±0.04) mg/mL,發酵50～60 d其含量變化無顯著差異(p>0.05)。Hur等[3]指出水果或者谷物發酵過程中微生物產生的酶類,如淀粉酶、纖維素酶、幾丁質酶、植酸酶及α-葡萄糖苷酶等可以分解植物細胞壁基質,促進黃酮的釋放,這是總黃酮含量稍有升高的主要原因。

圖2 發酵過程中總黃酮含量的變化Fig.2 Changes in contents of total flavonnoids during fermentation

2.1.3 龍葵果發酵過程中花色苷含量的變化 根據圖3所示,隨發酵時間延長,三組花色苷含量逐漸降低。紅糖組、蜂蜜組及綿白糖組花色苷發酵60 d后含量與發酵前相比含量分別下降51.23%、54.43%和50.76%。因為花色苷是一類化學性質活潑的物質,在加工和貯藏的過程中容易造成損失,但可以通過結合多酚或黃酮類等具有輔色作用的物質來提高自身穩定性。實驗結果顯示,在龍葵果發酵物的發酵過程中總多酚及總黃酮含量都有所升高,因此增高了花色苷的穩定性,并且非酰化的花色苷在發酵前期發生的氧化、聚合反應中褪色[20],性質較為穩定的酰化的花色苷被保留下來[21],因此在發酵30 d后花色苷含量基本維持穩定。

圖3 發酵過程中花色苷含量的變化Fig.3 Changes in contents of total anthocyanins during fermentation

2.1.4 龍葵果發酵過程中原花青素含量的變化 龍葵果在發酵過程中原花青素的含量變化如圖4所示。

圖4 發酵過程中原花青素含量的變化Fig.4 Changes in content of procyanidine during fermentation

實驗前測定了三種碳源的原花青素含量,使用的紅糖中原花青素含量為(0.99±0.05) mg/g,對發酵0 d的樣品原花青素含量影響顯著(p<0.05);蜂蜜和綿白糖中原花青素未測出。根據圖4所示,發酵60 d后與發酵前相比原花青素的含量顯著增加(p<0.05),紅糖組的含量先增加之后在發酵30 d時基本穩定,發酵60 d后含量為(1.17±0.01) mg/mL,發酵前后增加了(0.37±0.05) mg/mL。蜂蜜組在發酵前期并無明顯增加,之后在35 d時開始明顯升高,55 d時達到最高(0.75±0.03) mg/mL,60 d時發酵與0 d相比增加了(0.41±0.04) mg/mL。綿白糖組在發酵前35 d原花青素含量持續升高,之后基本穩定,發酵60 d后含量增加(0.545±0.05) mg/mL。比較三組原花青素增加量發現,綿白糖組>蜂蜜組>紅糖組。

2.1.5 龍葵果發酵過程中皂苷含量的變化 龍葵果在發酵過程中皂苷含量的變化如圖5所示。

圖5 發酵過程中皂苷含量的變化Fig.5 Changes in content of saponin during fermentation

三種碳源中皂苷含量均未檢出,故不考慮碳源帶入的皂苷對發酵液結果的影響。如圖5所示,三組龍葵果發酵物在發酵60 d后皂苷含量均顯著增加(p<0.05),紅糖組皂苷含量發酵前后增加(1.67±0.11) mg/mL,蜂蜜組皂苷含量增加(1.93±0.11) mg/mL,綿白糖組發酵前后含量增加(0.92±0.12) mg/mL。由圖5可以看出蜂蜜組含量增量最高,綿白糖組在發酵40 d后含量不再增加。

2.2 龍葵果發酵過程中體外抗氧化能力的變化

2.2.1 龍葵果發酵過程中總還原力變化 由于三種碳源中含有一定量的活性物質,為排除碳源的干擾,在實驗前分別測定了三種碳源的還原力,發現三種碳源的還原力無顯著差異(p>0.05),故不考慮碳源對發酵液還原力的影響。發酵過程中龍葵果發酵產物還原力變化如圖6所示,發酵60 d后三組龍葵果發酵物還原力均顯著提高(p<0.05),這是由于總多酚、原花青素等抗氧化物質含量增加的原因。發酵60 d后,紅糖組的還原力顯著高于其他兩組(p<0.05),在第55 d時抗氧化性最高,是發酵之前的2.17倍。蜂蜜組、綿白糖組還原力分別提高了29.11%、34.26%。由于酚類物質和黃酮都是優良的抗氧化劑,并且都作為金屬螯合劑發揮作用[3]。隨著發酵的進行,三組樣品總多酚和總黃酮含量均顯著增加(p<0.05),這可能是三組樣品發酵60 d后還原力顯著提高的原因。

圖6 發酵過程中龍葵果發酵產物還原力變化Fig.6 Changes in reducing power of Solanum nigrum fruits during fermentation

2.2.2 龍葵果發酵過程中清除DPPH·能力變化 龍葵果發酵過程中清除DPPH·能力的變化趨勢如圖7所示。

圖7 發酵過程中龍葵果發酵產物DPPH·的清除作用變化Fig.7 Changes in DPPH value of Solanum nigrum fruits duringfermentation

同樣為排除碳源的干擾,在實驗前分別測定了三種碳源的DPPH·清除率,發現三種碳源的DPPH·清除率無顯著差異(p>0.05),故不考慮碳源對發酵液DPPH·清除率的影響。由圖7可以看出,三組龍葵果發酵物清除DPPH·的能力都是先增加后稍微降低最終維持在一定水平。紅糖組在第15 d時清除率最高達到76.84%±1.40%,隨后稍有降低,最終維持在69%左右,相較發酵之前提高了14.68%。蜂蜜組也在第15 d時清除率達到55.04%±0.26%,最終穩定在53.5%左右,與發酵之前相比提高了12.63%。綿白糖組的清除率持續增長,60 d時達到45.21%±0.29%,與發酵前相比提高了10.26%。三組樣品清除DPPH·能力依次為紅糖組>蜂蜜組>綿白糖組。

表1 活性物質含量間的相關系數

注:“*”表示相關性顯著(p<0.05);“**”表示相關性極顯著(p<0.01);表2同。

表2 抗氧化能力與活性物質之間的相關系數

表3 發酵前后三種酶活力的比較

注:同列不同字母表示差異性顯著,p<0.05。

2.3 相關性分析

如表1所示,總多酚含量與原花青素、總黃酮、皂苷含量都有極顯著的正相關性(p<0.01),且與原花青素相關性最強,相關系數為0.881(p<0.01),說明在發酵過程中微生物代謝積累原花青素是導致總多酚含量的增加的主要原因。總黃酮含量也與原花青素含量極顯著相關(p<0.01),相關系數為0.876,說明發酵過程中原花青素含量增加是也黃酮類化合物含量增加的主要原因。

龍葵果發酵物中相關活性物質含量與抗氧化能力之間的相關系數如表2所示。

如表2所示,龍葵果發酵物的還原力與各種活性物質之間都有極顯著的相關性(p<0.01),其中與總多酚之間的相關性強于其他物質含量,相關系數為0.887。從表2可以看出DPPH·清除率與活性物質含量之間相關性不強。DPPH·清除率與總黃酮、原花青素含量之間顯著相關(p<0.01),但相關性較弱。這說明龍葵果發酵物的DPPH·清除率是由多種生物活性物質共同作用的。

2.4 龍葵果發酵物中酶活力的測定

蛋白酶和淀粉酶都屬于消化酶類,據文獻[22]報道消化酶類可以作為食品補充劑添加到功能食品中,提高產品的助消化功能。由表3可以看出,三組發酵物中的蛋白酶、淀粉酶酶活力均顯著升高(p<0.05),說明發酵后樣品助消化能力增強,且發酵60 d樣品紅糖組顯著高于(p<0.05)其他兩組。多酚氧化酶會引起果蔬原料的酶促褐變,使多酚物質氧化,影響食品的營養及風味,發酵前后多酚氧化酶酶活力顯著降低(p<0.05),說明經過自然發酵后發酵液的穩定性增強。

3 結論

添加三種不同碳源的龍葵果發酵60 d后,經比較紅糖組總多酚增量、總黃酮含量及皂苷增量均顯著高于(p<0.05)其他兩組;同時,發酵物還原力及清除DPPH·能力也顯著高于(p<0.05)其他兩組,綜合來看,紅糖作為自然發酵的碳源可以使龍葵果發酵產物具有更佳的抗氧化功能。

為進一步確定各種活性物質對抗氧化的貢獻,對實驗結果進行了相關性分析。還原力與總多酚含量相關性最強(r=0.887);各種活性物質含量與DPPH·清除率間不存在相關性或相關性較弱,說明龍葵果發酵物的DPPH·清除率是由多種生物活性物質共同作用的結果。

三組發酵物中的蛋白酶、淀粉酶酶活力均顯著升高(p<0.05),多酚氧化酶酶活力顯著降低(p<0.05),說明經過自然發酵后發酵液的助消化能力及體系的穩定性增強。發酵60 d后,紅糖組的蛋白酶及淀粉酶活力最高。

顯然,比較三種碳源自然發酵60 d后的樣品,紅糖更適合作為龍葵果自然發酵的碳源,得到的發酵產物具有更顯著的功能。然而,在發酵過程中活性物質轉化的機理及發酵過程中的主要微生物尚需進一步探究。

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權威·核心·領先·實用·全面

Study on active ingredients and antioxidant activityinvitroofSolanumnigrumfruits spontaneous fermentation

LI Yi,WANG Ping*

(School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

This study was carried out to analyzed some active ingredients fromSolanumnigrumfruits spontaneous fermentation with brown sugar,honey and soft sugar respectively,and evaluated the ferments antioxidant capacityinvitro. The results showed that the contents of total polyphenols,total flavonoids,saponin and proanthocyanidins increased significantly(p<0.05),the contents of anthocyanins decreased significantly(p<0.01)after 60 days fermentation. Meanwhile,the scavenging DPPH· capacity ofSolanumnigrum-ferment with brown sugar,honey,and soft sugar increased by 14.68%,12.63%,and 10.26%(p<0.05)respectively,and the reducing power of three groups increased by 81.9%,29.1%,and 34.2%(p<0.05)respectively. Correlation analysis showed significant positive correlation(p<0.01)between reducing power and total polyphenols contents,and between the scavenging DPPH·capacity and contents of flavonoid. Furthermore,the activity of protease and amylase was significantly increased(p<0.05),and the activity of polyphenol oxidase was significantly decreased(p<0.05)after 60 days fermentation. The results suggested theSolanumnigrum-ferment with brown sugar was better than with honey or soft sugar.

Solanumnigrumfruits;spontaneous fermentation;antioxidant activityinvitro

2016-09-22

李祎(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品發酵工程，E-mail：lanny924@sina.com。

*通訊作者:王萍(1964-)，女，博士，教授，主要從事功能食品研究與開發方面的研究，E-mail：wangpingnefu@126.com。

卓越農林人才教育培養計劃改革試點項目(41110211)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0207-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.031